免疫组织化学染色sp技术.ppt

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1、免疫组织化学染色sp技术 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望免疫组织化学的应用免疫组织化学的应用 IHC通过检测细胞内、细胞表面或细胞通过检测细胞内、细胞表面或细胞间的正常或异常的物质，以研究组织细胞的间的正常或异常的物质，以研究组织细胞的正常生理、代谢及疾病的病因、发病机理，正常生理、代谢及疾病的病因、发病机理，广泛用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的广泛用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测，细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫表检测，细胞属性的判定、淋巴

2、细胞的免疫表型分析、细胞增殖和凋亡的研究，以及细胞型分析、细胞增殖和凋亡的研究，以及细胞周期和信号转导的研究等。周期和信号转导的研究等。武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室实验名称实验名称链霉菌亲和素链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法过氧化物酶连结法(Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method,简称简称S-P法法)检测胃癌组织检测胃癌组织CKVimentin的蛋白表达的蛋白表达武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室S-P法原理示意图过氧化物酶过氧化物酶链酶亲和素链酶亲和素生物素生物素生物素化二抗生物素化二抗特异性一抗特异性一抗待测抗原待测抗原武汉大学病理教研室

3、武汉大学病理教研室免疫组织化学基本实验流程免疫组织化学基本实验流程组织、细胞标本组织、细胞标本 抗原修复抗原修复 阻断内源性过阻断内源性过氧化物酶氧化物酶 正常血清封闭正常血清封闭 滴加特异性一抗滴加特异性一抗滴加二抗滴加二抗 滴加三抗滴加三抗显色显色复染复染封片封片 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室l具体步骤如下：具体步骤如下：1石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01M PBS（pH 7.4）漂洗）漂洗35min；2所有组织均采用微波修复抗原；所有组织均采用微波修复抗原；3室温冷却后，室温冷却后，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗）漂洗35m

4、in；4滴加滴加50l过氧化物酶阻断液（试剂过氧化物酶阻断液（试剂A），），37湿盒湿盒孵育孵育 10min；50.01M PBS（pH 7.4）漂洗）漂洗35min；6滴加非免疫性动物血清（试剂滴加非免疫性动物血清（试剂B），），37湿盒孵育湿盒孵育 10min；武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室7甩去多余血清，分别滴加种抗体，甩去多余血清，分别滴加种抗体，4湿盒孵湿盒孵育育 过夜，过夜，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗）漂洗35min；8滴加生物素标记的二抗（试剂滴加生物素标记的二抗（试剂C），），37湿盒湿盒孵育孵育 15min，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗）漂洗35m

5、in；9滴加链亲和素滴加链亲和素-过氧化物酶溶液（试剂过氧化物酶溶液（试剂D），），37湿盒孵育湿盒孵育 15min，甩去多余液体；，甩去多余液体；10每片滴加新鲜配制的二甲基联苯胺（每片滴加新鲜配制的二甲基联苯胺（DAB）显）显色液，光镜下控制反应时间（约为色液，光镜下控制反应时间（约为1-5min），自来），自来水充分冲洗，苏木素复染；水充分冲洗，苏木素复染；11常规脱水、透明、中性树胶封片并镜检分析；常规脱水、透明、中性树胶封片并镜检分析；12阳性对照采用已知阳性片为标准，阴性对照采阳性对照采用已知阳性片为标准，阴性对照采用用PBS取代第一抗体，其余步骤相同。取代第一抗体，其余步骤相同。

6、武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室实验流程中的注意事项实验流程中的注意事项l内源性过氧化物酶的灭活内源性过氧化物酶的灭活 l血清封闭血清封闭 l冲洗冲洗 l抗体选择及一抗孵育时间抗体选择及一抗孵育时间l检测及显色系统检测及显色系统l复染复染 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室染色前处理染色前处理 取材、脱水、浸蜡取材、脱水、浸蜡取材、脱水、浸蜡取材、脱水、浸蜡l组织及时固定组织及时固定 固定剂选择：固定剂选择：10%中性缓冲福尔马林中性缓冲福尔马林 4%多聚甲醛多聚甲醛l常规下固定常规下固定8-24小时小时l取材厚度：取材厚度：2mm武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室染色前处理染色前处理

7、 预防脱片预防脱片预防脱片预防脱片l常选用多聚耐氨酸（常选用多聚耐氨酸（poly-L-lysine）注意：注意：1）应严格控制使用次数）应严格控制使用次数 2）玻片洁净度）玻片洁净度武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室染色前处理染色前处理 包埋与切片包埋与切片包埋与切片包埋与切片 l包埋：选择低熔点石蜡，温度不超过包埋：选择低熔点石蜡，温度不超过62l切片：厚度切片：厚度 3-4m l烤片：温度烤片：温度60，时间，时间1小时；或小时；或602小时小时（迈新）；或（迈新）；或60过夜过夜武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室染色前处理染色前处理 切片保存切片保存切片保存切片保存l切片不宜长时间在

8、常温下保存切片不宜长时间在常温下保存武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室染色前处理染色前处理 脱腊脱腊脱腊脱腊l原则：免疫组化的脱蜡试剂应与常规原则：免疫组化的脱蜡试剂应与常规HE 脱蜡分开脱蜡分开武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室实验操作中的应用实验操作中的应用l抗原修复抗原修复 l实验操作中的注意事项实验操作中的注意事项 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室抗原修复抗原修复 l影响染色结果的最关键因素影响染色结果的最关键因素 l抗原修复方法分类抗原修复方法分类 1）酶消化法）酶消化法 2）加热法（高压法）加热法（高压法水煮法水煮法微波法）微波法）l抗原修复液的选择抗原修复液的选择 1）柠

9、檬酸盐缓冲液（）柠檬酸盐缓冲液（PH 7.2-7.4）2）Tris（PH 7-8）3）EDTA（PH 8.0）武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室内源性过氧化物酶的灭活内源性过氧化物酶的灭活 l存在部位：红细胞、横纹肌细胞、粒细胞、存在部位：红细胞、横纹肌细胞、粒细胞、单核细胞、肝细胞及肾细胞单核细胞、肝细胞及肾细胞l消除方法：消除方法：3%H2O2 浸泡浸泡10分钟分钟武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室血清封闭血清封闭 l目的：减少非特异性着色目的：减少非特异性着色 l时间：一般在加载一抗之前使用时间：一般在加载一抗之前使用 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室冲冲 洗洗 l一般采用一般采

10、用PBS（PH 7.4-7.6）充分冲洗）充分冲洗l增加效果增加效果 可加入可加入Tween20武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室一抗孵育时间及抗体选择一抗孵育时间及抗体选择l应选择信誉高、质量好的试剂公司应选择信誉高、质量好的试剂公司l抗体切忌反复冻融抗体切忌反复冻融l一抗为浓缩液时，需选择最佳稀释浓度一抗为浓缩液时，需选择最佳稀释浓度l按说明书可采用按说明书可采用 37 1-2 小时或小时或 4 冰箱过夜冰箱过夜武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室检测及显色系统检测及显色系统l一般采用以一般采用以生物素标记生物素标记的辣根过氧化物酶为基础的的辣根过氧化物酶为基础的检测方法。检测方法。如如

11、SP、LSABC、ABC等等 l显色方法显色方法：经常采用辣根过氧化物酶系统检测：经常采用辣根过氧化物酶系统检测 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室显色系统显色系统常用的酶常用的酶 1.1.辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)(HRP)A:A:显色底物显色底物DAB-DAB-棕黄色棕黄色 敏感度高、定位清晰、易于观察、保存敏感度高、定位清晰、易于观察、保存 B:B:显色底物显色底物AEC-AEC-砖红色砖红色 2.2.碱性磷酸酶碱性磷酸酶(AP)(AP)显色底物显色底物:BCIP/NBT-:BCIP/NBT-蓝紫色蓝紫色武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室复复 染染l原则：注意两者之间对比

12、，突出阳性信号原则：注意两者之间对比，突出阳性信号武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室实验对照设计实验对照设计l原则：所有检测指标均设阳性对照、阴性对照原则：所有检测指标均设阳性对照、阴性对照编号阳性片待检片阴性对照结论1操作失误，抗体失效2非特异性着色3阳性片不含靶抗原4待检片不含定位抗原5待检片含定位抗原武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室结果分析结果分析1.1.特定的定位特定的定位 胞膜型、胞浆型、全浆型或胞核型，局限性或弥胞膜型、胞浆型、全浆型或胞核型，局限性或弥散性。散性。2.2.染色的不均一性染色的不均一性 阳性切片的染色应分布不均，片状或点状散在分阳性切片的染色应分布不均，片状或点状散在分布；染色强弱也不等，颜色深浅反映抗原量的多布；染色强弱也不等，颜色深浅反映抗原量的多少。少。武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室3.3.颗粒性显色颗粒性显色 DABDAB显色在高倍镜下呈颗粒状而非均匀着色。显色在高倍镜下呈颗粒状而非均匀着色。4.4.避免人为造成的非特异性染色避免人为造成的非特异性染色 切片的折叠、刀痕，色素沉着，组织细胞坏死。切片的折叠、刀痕，色素沉着，组织细胞坏死。武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室