实验二α-淀粉酶的初步纯化.ppt

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1、实验二 -淀粉酶的初步纯化 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望一、实验目的一、实验目的掌握酶制剂提取工艺流程。掌握酶制剂提取工艺流程。掌握淀粉酶的分离方法、纯化方法、浓缩掌握淀粉酶的分离方法、纯化方法、浓缩方法和干燥方法。方法和干燥方法。二、实验原理二、实验原理发酵液发酵液预处理（细菌絮凝）预处理（细菌絮凝）固液分离（离心、过滤）固液分离（离心、过滤）菌体（胞内酶）菌体（胞内酶）动植物源酶动植物源酶液体（胞外酶）液体（胞外酶）细胞破碎细胞破碎提取提取固

2、液分离固液分离液体液体工业、食品、饲料工业、食品、饲料浓缩浓缩（蒸发、超滤、沉淀）（蒸发、超滤、沉淀）浓缩液浓缩液配方配方干燥干燥医药、分析、科研医药、分析、科研液体酶液体酶固体酶固体酶浓缩浓缩分离纯化分离纯化（离心、沉淀、膜分离、（离心、沉淀、膜分离、层析、电泳、萃取、结晶）层析、电泳、萃取、结晶）配方、制剂配方、制剂干燥干燥液体酶液体酶固体酶固体酶二、实验原理二、实验原理-淀粉酶是一种胞外酶，胞外酶的初步分离淀粉酶是一种胞外酶，胞外酶的初步分离纯化通常是将发酵液经过预处理后采用过纯化通常是将发酵液经过预处理后采用过滤或离心的方法将酶液与菌体分离，然后滤或离心的方法将酶液与菌体分离，然后在酶

3、液中加入在酶液中加入(NH4)2SO4 盐析沉淀获得酶泥盐析沉淀获得酶泥，最后干燥即可。，最后干燥即可。二、实验原理二、实验原理在酶的分离纯化过程中，每步都需要测定在酶的分离纯化过程中，每步都需要测定酶活力酶活力、体积体积，以计算酶的总活力和比活，以计算酶的总活力和比活力，进而计算酶活力力，进而计算酶活力回收率回收率和纯化倍数，和纯化倍数，以监测每步纯化步骤中酶的回收和纯化效以监测每步纯化步骤中酶的回收和纯化效果，从而可以判断每步所使用的纯化手段果，从而可以判断每步所使用的纯化手段是否适宜目的酶的分离。是否适宜目的酶的分离。二、实验原理二、实验原理盐析法盐析法是蛋白质溶液中加入盐到一定限度是蛋

4、白质溶液中加入盐到一定限度后继续加盐，蛋白质从溶液中析出。其原后继续加盐，蛋白质从溶液中析出。其原理主要是蛋白质在高盐离子浓度下表面电理主要是蛋白质在高盐离子浓度下表面电荷被中和，水膜被破坏，蛋白质分子间疏荷被中和，水膜被破坏，蛋白质分子间疏水部分吸引力增加，以致沉淀析出。水部分吸引力增加，以致沉淀析出。Ks分段盐析分段盐析、分段盐析分段盐析 二、实验原理二、实验原理有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法是利用酶与其它杂质在有机溶剂是利用酶与其它杂质在有机溶剂是利用酶与其它杂质在有机溶剂是利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶中的溶解度不同，通过

5、添加一定量的某种有机溶中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离。剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离。剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离。剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离。有机溶剂之所以能使酶沉淀析出是由于有机溶剂有机溶剂之所以能使酶沉淀析出是由于有机溶剂有机溶剂之所以能使酶沉淀析出是由于有机溶剂有机溶剂之所以能使酶沉淀析出是由于有机溶剂的存在会使溶液的的存在会使溶液的的存在会使溶液的的存在会使溶液的介电常数降低介电常数降低介电常数降低介电常数降低。从而使溶质分。从而使溶质分。从而使溶

6、质分。从而使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集。子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集。子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集。子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集。有机溶剂与水相互作用，有机溶剂与水相互作用，有机溶剂与水相互作用，有机溶剂与水相互作用，破坏溶质分子表面的水破坏溶质分子表面的水破坏溶质分子表面的水破坏溶质分子表面的水膜膜膜膜，使其溶解度降低而沉淀析出。，使其溶解度降低而沉淀析出。，使其溶解度降低而沉淀析出。，使其溶解度降低而沉淀析出。三、仪器和试剂三、仪器和试剂仪器：仪器：仪器：仪器：分光光度计、恒温水浴锅（控温精度分光光度计、恒温水浴锅（控温精度分光光度计、恒温水

7、浴锅（控温精度分光光度计、恒温水浴锅（控温精度0.10.1）、）、）、）、干燥箱、离心机、移液管、试管、烧杯、容量瓶、干燥箱、离心机、移液管、试管、烧杯、容量瓶、干燥箱、离心机、移液管、试管、烧杯、容量瓶、干燥箱、离心机、移液管、试管、烧杯、容量瓶、玻璃棒、三角瓶、秒表、标签、培养皿、量筒、玻璃棒、三角瓶、秒表、标签、培养皿、量筒、玻璃棒、三角瓶、秒表、标签、培养皿、量筒、玻璃棒、三角瓶、秒表、标签、培养皿、量筒、漏斗、中速滤纸。漏斗、中速滤纸。漏斗、中速滤纸。漏斗、中速滤纸。试剂：试剂：试剂：试剂：碘、碘化钾、碘、碘化钾、碘、碘化钾、碘、碘化钾、-淀粉酶制剂、磷酸氢二钠、柠淀粉酶制剂、磷酸氢

8、二钠、柠淀粉酶制剂、磷酸氢二钠、柠淀粉酶制剂、磷酸氢二钠、柠檬酸、盐酸、可溶性淀粉（湖州展望化学药业有檬酸、盐酸、可溶性淀粉（湖州展望化学药业有檬酸、盐酸、可溶性淀粉（湖州展望化学药业有檬酸、盐酸、可溶性淀粉（湖州展望化学药业有限公司）、氯化钙、磷酸氢二钠、硫酸铵、乙醇。限公司）、氯化钙、磷酸氢二钠、硫酸铵、乙醇。限公司）、氯化钙、磷酸氢二钠、硫酸铵、乙醇。限公司）、氯化钙、磷酸氢二钠、硫酸铵、乙醇。四、实验方法四、实验方法发酵液的预处理发酵液的预处理 将发酵液收集起来，过滤滤去菌体，收集滤将发酵液收集起来，过滤滤去菌体，收集滤液，测量其体积。取液，测量其体积。取5 mL出来留作淀粉酶的出来留

9、作淀粉酶的活力测定，剩余发酵液则进行初步纯化。在活力测定，剩余发酵液则进行初步纯化。在剩余发酵液中加入剩余发酵液中加入CaCl2 和和Na2HPO4 各各0.8%-1%进行絮凝作用，并加热到进行絮凝作用，并加热到5560 处理处理30 min，以破坏蛋白酶，促使胶体凝聚，以破坏蛋白酶，促使胶体凝聚后再过滤，收集滤液，测量其体积，并测酶后再过滤，收集滤液，测量其体积，并测酶活力活力(留样下次实验时候测定）。留样下次实验时候测定）。四、实验方法四、实验方法硫酸铵盐析沉淀硫酸铵盐析沉淀硫酸铵盐析沉淀硫酸铵盐析沉淀-淀粉酶淀粉酶淀粉酶淀粉酶 取取取取100ml100ml滤液，按硫酸铵的饱和度为滤液，按

10、硫酸铵的饱和度为滤液，按硫酸铵的饱和度为滤液，按硫酸铵的饱和度为5555的比例，的比例，的比例，的比例，将硫酸铵缓慢加入到收集的滤液中，一边加将硫酸铵缓慢加入到收集的滤液中，一边加将硫酸铵缓慢加入到收集的滤液中，一边加将硫酸铵缓慢加入到收集的滤液中，一边加(NH(NH4 4)2 2SOSO4 4，一边轻轻搅拌。尽量避免液面泛起白，一边轻轻搅拌。尽量避免液面泛起白，一边轻轻搅拌。尽量避免液面泛起白，一边轻轻搅拌。尽量避免液面泛起白色泡沫。完全溶解后在色泡沫。完全溶解后在色泡沫。完全溶解后在色泡沫。完全溶解后在4 4下沉淀过夜，使上清液下沉淀过夜，使上清液下沉淀过夜，使上清液下沉淀过夜，使上清液中

11、的蛋白质沉淀下来。次日将三角瓶取出，将溶液中的蛋白质沉淀下来。次日将三角瓶取出，将溶液中的蛋白质沉淀下来。次日将三角瓶取出，将溶液中的蛋白质沉淀下来。次日将三角瓶取出，将溶液以以以以4 000 rmin4 000 rmin-1-1 转速离心转速离心转速离心转速离心15 min15 min，收集沉淀，然，收集沉淀，然，收集沉淀，然，收集沉淀，然后在烘箱中于后在烘箱中于后在烘箱中于后在烘箱中于5060 5060 干燥（损失率应不高于干燥（损失率应不高于干燥（损失率应不高于干燥（损失率应不高于3030），即得粗酶制剂。），即得粗酶制剂。），即得粗酶制剂。），即得粗酶制剂。四、实验方法四、实验方法有机

12、溶剂沉淀有机溶剂沉淀-淀粉酶淀粉酶 在在50ml滤液中，一边缓慢加入冰冻乙醇，滤液中，一边缓慢加入冰冻乙醇，一边轻轻搅拌，至乙醇终浓度为一边轻轻搅拌，至乙醇终浓度为70%，观察，观察有无沉淀析出。亦可在有无沉淀析出。亦可在4下沉淀过夜，使下沉淀过夜，使上清液中的蛋白质沉淀下来。次日将三角瓶上清液中的蛋白质沉淀下来。次日将三角瓶取出，将溶液以取出，将溶液以4 000 rmin-1 转速离心转速离心15 min，收集沉淀，室温风干，即得粗酶制剂。，收集沉淀，室温风干，即得粗酶制剂。五、实验结果五、实验结果酶的总活力（即酶产量）酶的总活力（即酶产量）酶的总活力（即酶产量）酶的总活力（即酶产量）酶液总

13、体积酶液总体积酶液总体积酶液总体积 酶的比活力酶的比活力酶的比活力酶的比活力酶的纯化倍数酶的纯化倍数酶的纯化倍数酶的纯化倍数 某纯化步骤的比活力某纯化步骤的比活力某纯化步骤的比活力某纯化步骤的比活力/第一步的比活力第一步的比活力第一步的比活力第一步的比活力酶活力回收率酶活力回收率酶活力回收率酶活力回收率 (某纯化步骤的总活力某纯化步骤的总活力某纯化步骤的总活力某纯化步骤的总活力/第一步的总活力第一步的总活力第一步的总活力第一步的总活力)100%)100%五、实验结果五、实验结果步骤总量(g)比活力 (u/g)(u/g)酶的总活力(u)纯化倍数()回收率()发酵液提取液 硫酸铵 沉淀酶 干燥后 的成品思考题思考题发酵液为什么要进行预处理？发酵液为什么要进行预处理？如何进行发酵液预处理？如何进行发酵液预处理？