CR技术及其延伸与应用.ppt
《CR技术及其延伸与应用.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《CR技术及其延伸与应用.ppt(33页珍藏版)》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。
1、PCR技术及其延伸与应用刘红亮 聚合酶链反应或多聚酶链反(Polymerase Chain Reaction,PCR)又称无细胞克隆技术(“free bacteria”cloning technique)特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增107108倍,大大提高了DNA的得率。PCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室Kary Mullis及同事于1985年发现并研制成功的;最早的应用报道是Saiki等1985年将PCR技术应用于-珠蛋白基因扩增和镰刀状红细胞贫血的产前诊断。使用1976年Chien等分离的热稳定性Taq D
2、NA聚合酶,使PCR操作大为简化,并使PCR自动化成为可能;1987年Kary Mullis等完成了自动化操作装置,使PCR技术进行实用阶段。PCR已获得广泛应用,目前,每年都有上千篇文章发表。1991年,期刊“PCR方法与应用”(PCR Methods and Application)在美国创刊,使有关学者有了自己的论坛和参考的专业期刊。Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得1993年度诺贝尔化学奖。(一名加拿大籍英国科学家Michael Smith因开创了“寡核苷酸基因定点诱变”的方法而与Mullis同享此荣)瑞典皇家科学院说:“PCR方法已经广泛应用于生物医学中,该方法同
3、DNA测序法结合起来很可能将成为研究动植物分类学的一种革新工具。”现在世界各地都在使用PCR检测病人血液中的微量遗传物质,这一成就为精确诊断艾滋病及其它病症铺平了道路。PCR技术作为一种方法学革命,必将大大推动分子生物学各有关学科的研究,使其达到一个新的高度。PCR的基本原理和基本程序 变性:先将含有所需扩增分析序列的靶DNA双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链,退火:加入上下游引物,与互补链杂交复性。延伸:在Taq DNA聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷(dNTP)为原料按5到3方向将引物延伸、自动合成新的DNA链、使DNA重新复制成双链。循环扩增每次循环使延伸的模板增加1倍,亦即扩增
4、DNA产物增加1倍,经反复循环,使靶DNA片段指数性扩增。预变性十分钟延伸保存PCR扩增属于酶促反应,所以,DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。平台效应 靶DNA片段的扩增最初表现为直线上升,随着靶DNA片段的逐渐积累,当引物模板/DNA/聚合酶达到一定比值时,酶的促化反应趋于饱和,此时靶DNA产物的浓度不再增加,即出现所谓平台效应 PCR的特点 特异性高-聚合酶首次报导用大肠杆菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段。90会变性失活,需每次PCR循环都要重新加入;同时引物是在37延伸Taq DNA聚合酶 1988年Saiki等从温泉水中分离到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定的,扩增过
5、程中,单核苷酸的错误参入程度很低、其错配率一般只有约万分之一高度敏感:理论上PCR可以按2n倍数扩增DNA十亿倍以上。应用证实可以将极微量的靶DNA成百万倍以上地扩增到足够检测分析量的DNA。能从100万个细胞中检出一个靶细胞,或对诸如病人口液等只含一个感染细胞的标本或仅含的感染细胞的特异性片段样品中均可检测。快速 简便 可扩增RNA或cDNA 试剂 引物:决定扩增的特异性。根据检测的DNA不同,选用不同引物。耐热的DNA聚合酶:10PCR缓冲液500mmol/lKCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明胶。dNTP贮备液 D
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- CR 技术 及其 延伸 应用
限制150内