实验理论ppt课件.ppt

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1、实验理论ppt课件 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望l l 基本概念基本概念l l 基本原理基本原理l l 分光光度技术的应用分光光度技术的应用l l 仪器的基本结构仪器的基本结构l l 仪器的使用仪器的使用2 2光的知识光的知识紫外光：紫外光：200 400 nm可见光：可见光：400 760 nm红外光：红外光：760 10000 nm3 3若两种不同颜色的单色光按一定的若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称强度比例混合得到

2、白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。象称为光的互补。单色光：单一波长的光单色光：单一波长的光复合光：由不同波长的光组合而成的光复合光：由不同波长的光组合而成的光光的互补：光的互补：单色光、复合光、光的互补单色光、复合光、光的互补4 4红红橙橙黄黄绿绿青青青蓝青蓝蓝蓝紫紫5 5基本概念基本概念l l分光光度法：分光光度法：通过测定被测物质在特定波长处或通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。进行定性和定量分析的方法。6 6基本原理基本原理ItI0IrI0=Ir

3、+It+Ia I0=It+Ia 浓度7 7l l lambert-Beer定律：定律：吸光度与溶液的浓度和液层吸光度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比。的厚度的乘积成正比。lg I0/It=KLC8 8l l已知已知lg lg I I0 0/I/It t=KLC=KLC，那么公式中，那么公式中lg lg I I0 0/I It t的含义为：的含义为：（1 1 1 1）当）当）当）当I I I I0 0 0 0=I=I=I=It t t t 时，时，时，时，lg lg lg lg I I I I0 0 0 0/I/I/I/It t t t=0=0=0=0，表示溶液完全，表示溶液完全，表示溶液完

4、全，表示溶液完全不吸收光线不吸收光线不吸收光线不吸收光线（2 2 2 2）当）当）当）当 I I I I0 0 0 0 I I I It t t t 时，时，时，时，lg lg lg lg I I I I0 0 0 0/I/I/I/It t t t值很大，表示溶液值很大，表示溶液值很大，表示溶液值很大，表示溶液 对光线吸收比较多对光线吸收比较多对光线吸收比较多对光线吸收比较多（3 3 3 3）当）当）当）当I I I It t t t=0=0=0=0时，时，时，时，lg lg lg lg I I I I0 0 0 0/I/I/I/It t t t为无穷大，表示光线为无穷大，表示光线为无穷大，表

5、示光线为无穷大，表示光线 被溶液完全吸收被溶液完全吸收被溶液完全吸收被溶液完全吸收9 9l llg lg I I0 0/I/It t表示了溶液对光线的吸收程度，表示了溶液对光线的吸收程度，一般称之为一般称之为吸光度吸光度(Absorbance)(Absorbance)，用用A A来表来表示；或称为示；或称为光密度（光密度（Optical densityOptical density），），用用ODOD或或D D表示表示1010l lK K 吸光系数吸光系数 K=A/CL K=A/CL，表示有色溶液在单位质表示有色溶液在单位质量浓度和单位厚度时的吸光度，其值量浓度和单位厚度时的吸光度，其值取决于

6、取决于入射光的波长，溶液的性质和温度入射光的波长，溶液的性质和温度等，而与等，而与光的强度、溶液的浓度及液层的厚度无关。光的强度、溶液的浓度及液层的厚度无关。吸光系数是有色化合物的重要特性之一。吸光系数是有色化合物的重要特性之一。1111分光光度技术的应用分光光度技术的应用一、一、测定溶液中物质的含量测定溶液中物质的含量 （1 1）利用标准管计算测定物含量）利用标准管计算测定物含量CxAxAs CsAxAsKCxLKCsLCxCs1212 （2 2）利用标准曲线求得测定物浓度）利用标准曲线求得测定物浓度 先配制一系列不同浓度的标准液，按先配制一系列不同浓度的标准液，按测定管同样方法处理显色，分

7、别读取各管的测定管同样方法处理显色，分别读取各管的吸光度，以各管吸光度为纵坐标，浓度为横吸光度，以各管吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制坐标，绘制吸光度吸光度浓度标准曲线浓度标准曲线。然后测。然后测定出未知溶液的吸光度，即可从标准曲线上定出未知溶液的吸光度，即可从标准曲线上查到其相对应的浓度。查到其相对应的浓度。1313维生素维生素B B1212的标准曲线的标准曲线 1414l l注：注：含量测定时所用波长通常要选择被测含量测定时所用波长通常要选择被测物质的最大吸收波长，这样：物质的最大吸收波长，这样：（1 1）灵敏度大，物质在含量上的稍许）灵敏度大，物质在含量上的稍许 变化将引起较大的吸光度

8、差异；变化将引起较大的吸光度差异；（2 2）可以避免其它物质的干扰）可以避免其它物质的干扰 1515分光光度技术的应用分光光度技术的应用二、用吸收光谱鉴定化合物二、用吸收光谱鉴定化合物 使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲线，方法是用各种波长不同的单色光分别通线，方法是用各种波长不同的单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一种单过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸光度，然后以波长为横坐标，吸光色光的吸光度，然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标绘制度为纵坐标绘制吸光度吸光度波长曲线波长曲线，此曲线，此曲线即为吸收光谱曲线即为吸收光谱曲线 1616分光光度

9、技术的应用分光光度技术的应用三、用紫外光谱鉴定化合物三、用紫外光谱鉴定化合物 紫外光吸收是由不饱和的结构紫外光吸收是由不饱和的结构造成的，含有双键的化合物能表现出造成的，含有双键的化合物能表现出吸收峰。紫外吸收光谱分析主要用于吸收峰。紫外吸收光谱分析主要用于已知物质的定量分析和纯度分析。已知物质的定量分析和纯度分析。1717仪器的基本结构仪器的基本结构l l 光源光源l l 分光系统分光系统l l 吸收杯吸收杯l l 测光系统测光系统l l 信号输出：信号输出：记录仪、屏幕、记录仪、屏幕、数字显示等数字显示等1818l l 光源光源 要求能提供所需波长范围的连续光谱，要求能提供所需波长范围的连

10、续光谱，稳定且有足够的强度。稳定且有足够的强度。钨丝灯钨丝灯：可见光波长范围：可见光波长范围 氢弧灯或氘弧灯氢弧灯或氘弧灯：紫外光区：紫外光区 纳恩斯特（纳恩斯特（Nernst）棒）棒：红外光区：红外光区 1919l l 分光系统分光系统 滤光片滤光片 ：从光源发出的连续光谱中分出实：从光源发出的连续光谱中分出实验所需的某一特定波长范围的光。验所需的某一特定波长范围的光。单色光器单色光器 ：可以把连续波长的光分解，从：可以把连续波长的光分解，从中得出任一所需波长的更纯的单色光，主要中得出任一所需波长的更纯的单色光，主要由棱镜或光栅构成由棱镜或光栅构成。2020l l吸收杯（比色杯，比色皿）吸收

11、杯（比色杯，比色皿）用来盛测定溶液。玻璃吸收杯只用来盛测定溶液。玻璃吸收杯只适用于可见光区，在适用于可见光区，在紫外线范围内则要紫外线范围内则要采用石英吸收杯采用石英吸收杯。2121l l测光系统测光系统 测光系统是应用光电效应的原理测光系统是应用光电效应的原理来测量光线强度。将投射来的光线能量来测量光线强度。将投射来的光线能量转变为电能，进一步用适当的方法测量转变为电能，进一步用适当的方法测量产生的电流，即可了解光线的强度。产生的电流，即可了解光线的强度。2222l l测光系统测光系统光电转换器光电转换器：(1)(1)光电池光电池:受光照射产生电流，电流受光照射产生电流，电流 较大，可直接用

12、微电流计检出。较大，可直接用微电流计检出。2323硒光电效应示意图硒光电效应示意图 2424l l 光电转换器光电转换器 (2)(2)光电管光电管:产生的电流很小，需要放产生的电流很小，需要放大。常用电子倍增光电管，它们接受光线大。常用电子倍增光电管，它们接受光线后产生的电流经过了放大，使仪器对光线后产生的电流经过了放大，使仪器对光线的检测灵敏度大大提高。的检测灵敏度大大提高。2525光电管线路示意图光电管线路示意图 2626几种国产分光光度计的使用几种国产分光光度计的使用l l 基本操作步骤：基本操作步骤：（1 1）选择灵敏度）选择灵敏度 （2 2）选择波长范围）选择波长范围 （3 3）仪器

13、校正与调零）仪器校正与调零 （4 4）测量）测量 （5 5）关闭仪器，清洗比色杯）关闭仪器，清洗比色杯 2727电泳法电泳法 electrophoretic method2828l l 基本概念与原理基本概念与原理l l 影响电泳速度的因素影响电泳速度的因素l l 电泳的分类电泳的分类l l 几种常用的电泳技术几种常用的电泳技术l l 电泳技术的应用电泳技术的应用2929基本概念与原理基本概念与原理l l 电泳：电泳：在直流电场中，带电粒子向带符号相反的电在直流电场中，带电粒子向带符号相反的电极移动的现象称为电泳极移动的现象称为电泳(electrophoresis)(electrophores

14、is)。3030 在在电电场场中中，推推动动带带电电粒粒子子运运动动的的力力(F)(F)等等于于粒粒子子所所带带净净电电荷荷量量(Q)(Q)与与电电场场强强度度(E)(E)的的乘积，即：乘积，即：F FQEQE3131l l 迁移率：迁移率：带电粒子在单位电场强度下的移动带电粒子在单位电场强度下的移动速度，即：速度，即：=E=d/tV/L=dLVt(cm2/(Vs)电泳技术就是利用各种物质迁移率电泳技术就是利用各种物质迁移率的差异而将其分离的。的差异而将其分离的。3232例如：例如：在同一电场和同一时间条件下在同一电场和同一时间条件下物质物质A在电场中移动的距离为：在电场中移动的距离为：dAV

15、 t A/L物质物质B在电场中移动的距离为：在电场中移动的距离为：dBV t B/L两物质移动距离差为：两物质移动距离差为：ddA-dB（A-B）V t/L 3333影响电泳速度的因素影响电泳速度的因素l l 样品样品l l 电场强度电场强度l l 溶液的溶液的pHpH值值 l l 溶液的离子强度溶液的离子强度l l 电渗作用电渗作用3434样品样品带电粒子（样品）在电场中的泳动速度带电粒子（样品）在电场中的泳动速度首先与其本身所带净电荷的多少、颗粒首先与其本身所带净电荷的多少、颗粒大小和形状有关大小和形状有关3535电场强度电场强度电场强度是指单位长度（每电场强度是指单位长度（每1厘米）支持

16、物体厘米）支持物体上的电位降。一般，电场强度越高，带电粒子上的电位降。一般，电场强度越高，带电粒子移动速度越快。根据电场强度的大小，可将电移动速度越快。根据电场强度的大小，可将电泳分为常压（泳分为常压（100500V）和高压）和高压（50010，000V）电泳）电泳3636溶液的溶液的pH值值溶液的溶液的pHpH值决定了被分离物质的解离程度值决定了被分离物质的解离程度和粒子的带电性质及所带净电荷量。在电和粒子的带电性质及所带净电荷量。在电泳时，应根据样品性质，选择合适泳时，应根据样品性质，选择合适pHpH值的值的缓冲液。同时为了使电泳过程中溶液的缓冲液。同时为了使电泳过程中溶液的pHpH值保持

17、恒定，必须采用缓冲溶液值保持恒定，必须采用缓冲溶液3737溶液的离子强度溶液的离子强度离子强度代表所有类型的离子所产生的静电力，离子强度代表所有类型的离子所产生的静电力，它取决于离子电荷的总数，而与溶液中盐类的它取决于离子电荷的总数，而与溶液中盐类的性质无关。在保持足够缓冲能力的前提下，离性质无关。在保持足够缓冲能力的前提下，离子强度要求最小子强度要求最小3838电渗作用电渗作用在电场作用下，液体对于固体支持物的相对移动在电场作用下，液体对于固体支持物的相对移动称为电渗称为电渗(electroosmosis)。其产生的原因是固体其产生的原因是固体支持物多孔，且带有可解离的化学基团，因此常支持物

18、多孔，且带有可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负离子，使溶液相对带负吸附溶液中的正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电电或正电3939电泳分类电泳分类l l 自由电泳自由电泳l l 区带电泳区带电泳4040几种常用的电泳技术几种常用的电泳技术l l醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维素薄膜是由醋酸纤维素加工制醋酸纤维素薄膜是由醋酸纤维素加工制成的。醋酸纤维素薄膜作为电泳支持体有以成的。醋酸纤维素薄膜作为电泳支持体有以下优点：下优点：41411.1.电泳后区带界限清晰电泳后区带界限清晰 2.2.对各种蛋白质都几乎完全不吸附，因此无对各种蛋白质都几乎完全不吸附，因此无拖尾现象拖

19、尾现象3.3.对染料也没有吸附，因此不结合的染料能对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完全无色完全洗掉，无样品处几乎完全无色4.4.膜的亲水性比较小，它所容纳的缓冲液也膜的亲水性比较小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电流的大部分由样品传导，所少，电泳时电流的大部分由样品传导，所以分离速度快，电泳时间短，样品用量少以分离速度快，电泳时间短，样品用量少4242l l凝胶电泳凝胶电泳 1.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 （agarose gel electrophoresis）2.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 （polyacrylamide gel eletrophores

20、is，PAGE）4343琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是其结构单元是D-D-半乳糖和半乳糖和3,6-3,6-脱水脱水-L-L-半乳半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶型凝胶 4444 琼脂糖凝胶电泳常用的缓冲液的琼脂糖凝胶电泳常用的缓冲液的pHpH在在6-96-9之间，离子强度为之间，离子强度为0.02-0.050.02-0.05。常用的缓。常用的缓冲液有硼酸盐溶液和巴比妥缓冲液。主要用冲液有

21、硼酸盐溶液和巴比妥缓冲液。主要用于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。及纯化。4545琼脂糖凝胶电泳图（琼脂糖凝胶电泳图（DNADNA）4646聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。由于它甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。由于它是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度的交链结构。可体的浓度比，形成不同程度的交链结构。可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的以根据要分离物质分子的大小，选择合适的凝胶成

22、分，使之既有适宜的空隙度，又有比凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较好的机械性质。较好的机械性质。4747 聚丙烯酰胺凝胶具有三维空间网状结构，聚丙烯酰胺凝胶具有三维空间网状结构，分子通过这种网孔的能力取决于凝胶孔隙和分子通过这种网孔的能力取决于凝胶孔隙和分离物质颗粒的大小和形状，这就是凝胶的分离物质颗粒的大小和形状，这就是凝胶的分子筛作用。分子筛作用。4848聚丙烯酰胺凝胶电泳图聚丙烯酰胺凝胶电泳图4949SDS-PAGE 十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（SDSSDS）有一个极性头部）有一个极性头部和一条非极性尾巴，因此可以介入极性和非和一条非极性尾巴，因此可以介入极性和非极性基团之间，

23、是一种界面活性剂，也就是极性基团之间，是一种界面活性剂，也就是俗称的去污剂俗称的去污剂。50505151 SDSSDS能够与蛋白质结合，破坏蛋白质内部能够与蛋白质结合，破坏蛋白质内部、分子之间以及与其它物质分子间的非共价、分子之间以及与其它物质分子间的非共价键，使蛋白质变性而破坏原有的空间构象。键，使蛋白质变性而破坏原有的空间构象。52525353 由于由于SDS带负电，使各种蛋白质带负电，使各种蛋白质-SDS复合复合物都带上相同密度的负电荷，并大大超过蛋白物都带上相同密度的负电荷，并大大超过蛋白质分子原有的电荷量；同时不同蛋白质质分子原有的电荷量；同时不同蛋白质-SDS复合物形状也相似。因此

24、在聚丙烯酰胺凝胶电复合物形状也相似。因此在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，由于凝胶的分子筛效应，电泳迁移率就泳时，由于凝胶的分子筛效应，电泳迁移率就取决于蛋白质取决于蛋白质-SDS复合物的大小，也就是说复合物的大小，也就是说取决于蛋白质分子量的大小取决于蛋白质分子量的大小5454l l等电聚焦电泳等电聚焦电泳(isoelectric focusing，IEF)等电聚焦是一种利用有等电聚焦是一种利用有pH梯度的介质分梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同

25、的蛋白质组分。子量相近而等电点不同的蛋白质组分。5555l l毛细管电泳（毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）Neuhoff等人于等人于1973年建立了毛细管均一年建立了毛细管均一浓度和梯度浓度凝胶用来分析微量蛋白质的浓度和梯度浓度凝胶用来分析微量蛋白质的方法，即微柱胶电泳。毛细管的直径一般为方法，即微柱胶电泳。毛细管的直径一般为25200 um。5656 目前毛细管电泳分析仪的诞生，结合光目前毛细管电泳分析仪的诞生，结合光学仪器、计算机及自动记录仪、自动分布学仪器、计算机及自动记录仪、自动分布收集器，为收集器，为DNADNA片段、蛋白质及多肽等生物片段、蛋白

26、质及多肽等生物大分子的分离、回收提供了快速、有效的大分子的分离、回收提供了快速、有效的途径。途径。57575858电泳技术的应用电泳技术的应用l l分离无机盐和各种有机物分离无机盐和各种有机物l l分析物质的纯度与分子量测定分析物质的纯度与分子量测定 5959层层 析析 法法 Chromatography6060l l 基本概念基本概念l l 层析法的分类层析法的分类l l 几种常用的层析方法几种常用的层析方法 吸附层析、分配层析、离子交吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析换层析、凝胶层析、亲和层析6161基本概念基本概念l l 层析法层析法 通过在通过在固定相固定相和和流动相

27、流动相之间之间的物理和化学分配而将混合物中的的物理和化学分配而将混合物中的两种或多种化合物相互分离的方法两种或多种化合物相互分离的方法之总称。之总称。6262 利用混合物中各组分的理化性质利用混合物中各组分的理化性质（如（如溶解度溶解度、吸附能力吸附能力、电荷电荷、分子量分子量、分子极性分子极性、亲和力亲和力等）各不相同，使各组等）各不相同，使各组分在支持物上移动速度不同而集中分布在分在支持物上移动速度不同而集中分布在不同的区域，借此将各组分分离。不同的区域，借此将各组分分离。6363 所有的层析系统都由两个相组成：所有的层析系统都由两个相组成：一是一是固定相固定相，它或者是固体物质或者是，它

28、或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是固定于固体物质上的成分；另一是流动流动相相，即可以流动的物质，如水和各种溶，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。媒。6464组分组分A组分组分B固定相固定相吸附吸附结合等结合等+流动相流动相解除上解除上述作用述作用反反复复进进行行组分组分A组分组分B移动速度不同移动速度不同6565层析法的分类层析法的分类l l按两相所处的状态分类按两相所处的状态分类 液液-固固层析法层析法液液-液液层析法层析法液体液体气气-固固层析法层析法气气-液液层析法层析法气体气体流流动动相相固体固体液体液体固定相固定相气相层析气相层析液相层析液相层析6666l l按层析原

29、理分类按层析原理分类 各组份在流动相和静止各组份在流动相和静止液相（固相）中的分配液相（固相）中的分配系数不同系数不同 分配层析法分配层析法 吸附层析法吸附层析法 分分 离离 原原 理理 名名 称称组份在吸附剂表面吸附，组份在吸附剂表面吸附，固定相是固体吸附剂，对固定相是固体吸附剂，对各组分吸附能力不同各组分吸附能力不同 6767固定相是多孔凝胶，各组份固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同胶上受阻滞的程度不同 凝胶层析法凝胶层析法固定相是离子交换剂，各固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂形成的组份与离子交换剂形成的盐键数目不同盐键数目不

30、同 离子交换层析法离子交换层析法分分 离离 原原 理理名名 称称续上表续上表亲和层析法亲和层析法 固定相只能与一种待分离组固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此与无亲和份专一结合，以此与无亲和力的其它组份分离力的其它组份分离 6868l l按操作形式不同分类按操作形式不同分类 将适当粘度的固定相均匀涂将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流动铺在薄板上，点样后用流动相展开，使各组份分离相展开，使各组份分离 薄层层析法薄层层析法固定相装于柱内，使样品沿固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离着一个方向前移而达分离 柱层析法柱层析法操操 作作 形形 式式名名 称称6969将适当的高分

31、子有机吸附剂将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析方制成薄膜，以类似纸层析方法进行物质的分离法进行物质的分离 薄膜层析法薄膜层析法用滤纸作液体的载体，点样用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组份后用流动相展开，使各组份分离分离 纸层析法纸层析法操操 作作 形形 式式名名 称称续上表续上表7070几种常用的层析方法几种常用的层析方法 l l吸附层析吸附层析l l分配层析分配层析l l离子交换层析离子交换层析l l凝胶层析凝胶层析l l亲和层析亲和层析7171吸附层析吸附层析（Absorption chromatography）吸附层析是利用吸附层析是利用吸附剂表面吸附剂表面对不同

32、物质吸附性能的差异对不同物质吸附性能的差异进行分进行分离的一种方法，常用于分离易溶于离的一种方法，常用于分离易溶于有机溶剂而难溶于水的混合物。有机溶剂而难溶于水的混合物。7272吸附柱层析吸附柱层析(Absorption column chromatography)(Absorption column chromatography)吸附柱层析是利用玻璃柱盛固定相。吸附柱层析是利用玻璃柱盛固定相。样品溶液加入层析柱，溶质即被吸附剂样品溶液加入层析柱，溶质即被吸附剂（固定相）吸附。待样品液全部流入柱内（固定相）吸附。待样品液全部流入柱内的吸附剂后，再加入适当的洗脱液（流动的吸附剂后，再加入适当的洗

33、脱液（流动相），使被吸附的溶质逐步解吸下来，随相），使被吸附的溶质逐步解吸下来，随着洗脱液向下流动而移动，最后被分离。着洗脱液向下流动而移动，最后被分离。7373柱层析示意图柱层析示意图 7474薄层吸附层析薄层吸附层析（Thin layer absorption chromatography）薄层吸附层析是将吸附剂均匀地铺在玻薄层吸附层析是将吸附剂均匀地铺在玻璃板上成薄层，再把样品点在薄层上，点样的璃板上成薄层，再把样品点在薄层上，点样的位置靠近板的一端。然后将该端浸入适当的溶位置靠近板的一端。然后将该端浸入适当的溶剂（流动相）中，使溶剂在薄层板上扩散，并剂（流动相）中，使溶剂在薄层板上扩散

34、，并在此过程中通过在此过程中通过吸附吸附解吸解吸再吸附再吸附再解吸再解吸的反复进行，而将样品各个组分分离出来。的反复进行，而将样品各个组分分离出来。7575吸附剂的选择吸附剂的选择l l 最大表面积和足够的吸附能力最大表面积和足够的吸附能力l l 对欲分离的物质有不同的吸附能力对欲分离的物质有不同的吸附能力l l 与溶剂和样品不会发生化学反应与溶剂和样品不会发生化学反应l l 颗粒均匀，不会碎裂颗粒均匀，不会碎裂7676分配层析分配层析（Partition chromatography）分配层析法是根据分配层析法是根据物质在两种物质在两种不相混溶（或部分混溶）的溶剂间不相混溶（或部分混溶）的溶

35、剂间溶解度不同溶解度不同，从而有不同的分配从而有不同的分配来来实现分离的方法。属于液实现分离的方法。属于液-液层析。液层析。7777分配层析分配层析l l分配系数（分配系数（K）K=固定相中溶质的浓度固定相中溶质的浓度 流动相中溶质的浓度流动相中溶质的浓度 7878离子交换层析离子交换层析（Ion-exchange chromatography）离子交换层析法是以具有离子交离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它换性能的物质作固定相，利用它与流动与流动相中的离子能进行可逆的交换性质相中的离子能进行可逆的交换性质来分来分离离子型化合物的一种方法。离离子型化合物的一种方法。7979

36、离子交换层析示意图离子交换层析示意图 8080离子交换剂的优点：离子交换剂的优点：（1）具有开放性支持骨架，大分子可以自由）具有开放性支持骨架，大分子可以自由进入和迅速扩散，故吸附容量大。进入和迅速扩散，故吸附容量大。（2）具有亲水性，对大分子的吸附不大牢固，）具有亲水性，对大分子的吸附不大牢固，用温和的条件可以洗脱，不致引起蛋白质用温和的条件可以洗脱，不致引起蛋白质变性或酶失活。变性或酶失活。（3）多孔性，表面积大，交换容量大，回收）多孔性，表面积大，交换容量大，回收率高，可用于分离和制备率高，可用于分离和制备。8181磺酸基（磺酸基（SO3H）阳离子阳离子交换剂交换剂强酸型强酸型弱酸型弱酸

37、型酚羟基（酚羟基（OH）羧基（羧基（COOH）阴离子阴离子交换剂交换剂强碱型强碱型弱碱型弱碱型 季胺碱（季胺碱（N+R3）伯胺基（伯胺基（NH2）仲胺基（仲胺基（NHR）叔胺基（叔胺基（NR2）8282凝胶层析凝胶层析（Gel chromatography）凝胶层析是指混合物随流动相凝胶层析是指混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中混合物中各物质因分子大小不同各物质因分子大小不同而被而被分离的技术。分离的技术。8383分子筛效应分子筛效应 大分子物质由于直径较大，不易进大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布在颗粒之入凝胶颗

38、粒的微孔，而只能分布在颗粒之间，其流程短，遇到的阻力小，所以在洗间，其流程短，遇到的阻力小，所以在洗脱时向下移动的速度较快，先流出层析柱脱时向下移动的速度较快，先流出层析柱 。8484 小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进扩散，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，如此不入凝胶相内，在向下移动的过程中，如此不断地进入和扩散，其流程长，遇到的阻力大，断地进入和扩散，其流程长，遇到的阻力大，因而下移的速度落后于大分子物质，后流出因而下移的速度落后于大分子物质，后流出层析柱。层析柱。这样，样品中分子大的先流出

39、层析柱，这样，样品中分子大的先流出层析柱，然后是中等大小的分子，最后流出的是小分然后是中等大小的分子，最后流出的是小分子，这种现象称为子，这种现象称为分子筛效应分子筛效应。8585凝胶层析示意图凝胶层析示意图8686 凝胶层析用于分离目的时有两种：凝胶层析用于分离目的时有两种：一是一是组别分离组别分离，这种情况下，混合物，这种情况下，混合物中各组分的相对分子质量差别较大，常用于中各组分的相对分子质量差别较大，常用于制备性分离；制备性分离；二是二是分级分离分级分离，指相对分子质量比较，指相对分子质量比较接近的物质之间的分离，分辨率比组别分离接近的物质之间的分离，分辨率比组别分离高，常用于分析。高

40、，常用于分析。8787凝胶的种类和性质凝胶的种类和性质 l l交连葡聚糖凝胶交连葡聚糖凝胶 l l琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 l l聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 8888凝胶层析的实验技术凝胶层析的实验技术 l l层析柱层析柱 l l凝胶的选择凝胶的选择 l l凝胶的准备凝胶的准备 l l样品溶液的处理样品溶液的处理 l l防止微生物污染防止微生物污染 8989凝胶层析的应用凝胶层析的应用 l l脱盐脱盐 l l分离提纯蛋白质、核酸等生物大分子分离提纯蛋白质、核酸等生物大分子 l l测定高分子物质的分子量测定高分子物质的分子量 l l高分子溶液的浓缩高分子溶液的浓缩 l l酶、蛋白质、氨基酸、多糖、

41、激素、酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离精制生物碱等物质的分离精制 9090亲和层析亲和层析（Affinity chromatography）亲和层析是利用亲和层析是利用待分离物质与待分离物质与其特异性配体间具有特异的亲和力其特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技从而达到分离目的的一类特殊层析技术。术。9191配体与载体结合配体与载体结合（固相化）（固相化）装柱装柱（亲和层析柱）（亲和层析柱）亲和吸附亲和吸附（生物高分子与配体专一结合）（生物高分子与配体专一结合）洗柱洗柱亲和层析的基本亲和层析的基本过程过程9292亲和层析示意图亲和层析示意图9393载体

42、的选择原则载体的选择原则l l不溶性：不溶于水不溶性：不溶于水 l l渗透性：疏松网状结构，容许大分子自渗透性：疏松网状结构，容许大分子自由通过由通过 l l有一定硬度，最好为均一的珠状有一定硬度，最好为均一的珠状 l l具有大量可供反应的化学基团，能与大具有大量可供反应的化学基团，能与大量配体共价连接量配体共价连接 9494l l非特异性吸附能力极低非特异性吸附能力极低 l l能抗微生物和酶的侵蚀能抗微生物和酶的侵蚀l l有较好的化学稳定性有较好的化学稳定性 l l亲水性亲水性 9595配体与载体的联接方法配体与载体的联接方法l l吸附法：吸附法：配体吸附于固相载体或离子交换剂上配体吸附于固

43、相载体或离子交换剂上l l共价偶联法：共价偶联法：配体通过化学共价键联结于固相载体上配体通过化学共价键联结于固相载体上9696l l交联法：交联法：依靠双功能试剂造成分子之间交联，依靠双功能试剂造成分子之间交联，聚集成网状结构。聚集成网状结构。l l包埋法：包埋法：配体被包裹于凝胶格子或聚合物的配体被包裹于凝胶格子或聚合物的半透膜微胶囊中。半透膜微胶囊中。9797亲和层析的应用亲和层析的应用 亲和层析纯化过程简单、迅速，且亲和层析纯化过程简单、迅速，且分离效率高。对分离含量极少又不稳定分离效率高。对分离含量极少又不稳定的活性物质尤为有效。的活性物质尤为有效。9898亲和层析的应用亲和层析的应用

44、l l纯化生物大分子纯化生物大分子 l l稀溶液的浓缩稀溶液的浓缩 l l不稳定蛋白质的贮藏不稳定蛋白质的贮藏 l l从纯化的分子中除去残余的污染物从纯化的分子中除去残余的污染物l l用免疫吸附剂吸附纯化对此尚无互补用免疫吸附剂吸附纯化对此尚无互补配体的生物大分子配体的生物大分子 l l分离核酸分离核酸 9999生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心离离 心心 技技 术术 Centrifugation techniques100100l l基本概念及原理基本概念及原理l l离心技术的应用离心技术的应用l

45、l离心机的构造及使用离心机的构造及使用洗衣机脱水筒洗衣机脱水筒洗衣机脱水筒洗衣机脱水筒101101基本概念基本概念l l 离心技术离心技术 借助离心机旋转所产生的离心力，使借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分离的技术。不同大小和不同密度的物质分离的技术。l l 超速离心技术超速离心技术 根据物质沉降系数、质量、浮力因子根据物质沉降系数、质量、浮力因子等的等的不同不同,应用强大的离心力使物质分离、应用强大的离心力使物质分离、浓缩、提纯的浓缩、提纯的方法方法.102102基本原理基本原理l l离心力离心力离心力离心力 Centrifugal force (F)Centrifu

46、gal force (F)物体作圆周运动时形成的一种迫使物体脱离圆周运物体作圆周运动时形成的一种迫使物体脱离圆周运物体作圆周运动时形成的一种迫使物体脱离圆周运物体作圆周运动时形成的一种迫使物体脱离圆周运动中心的动中心的动中心的动中心的力。力。力。力。离心力离心力离心力离心力 F=ma=mF=ma=m2 2r r :旋转角速度旋转角速度旋转角速度旋转角速度 r:r:旋转体离旋转轴的距离旋转体离旋转轴的距离旋转体离旋转轴的距离旋转体离旋转轴的距离 2n 2n =(rad/sec)=(rad/sec)60 60 n n：转子每分钟的转数：转子每分钟的转数：转子每分钟的转数：转子每分钟的转数(rpm)

47、(rpm)103103l l沉降系数沉降系数沉降系数沉降系数S(Svedberg)S(Svedberg)单位离心力作用下颗粒沉降的速度单位离心力作用下颗粒沉降的速度单位离心力作用下颗粒沉降的速度单位离心力作用下颗粒沉降的速度.2.1 2.1 10102 2 logX2/X1logX2/X1S =S =n n2 2 (t2-t1)(t2-t1)X1:X1:离心前粒子离旋转轴的距离离心前粒子离旋转轴的距离离心前粒子离旋转轴的距离离心前粒子离旋转轴的距离 X2:X2:离心后粒子离旋转轴的距离离心后粒子离旋转轴的距离离心后粒子离旋转轴的距离离心后粒子离旋转轴的距离 n n：转子每分钟的转数：转子每分钟

48、的转数：转子每分钟的转数：转子每分钟的转数(rpm)(rpm)t2-t1t2-t1：离心时间（：离心时间（：离心时间（：离心时间（s s）S S在实际应用时常在在实际应用时常在在实际应用时常在在实际应用时常在1010-13-13秒左右，故把沉降系数秒左右，故把沉降系数秒左右，故把沉降系数秒左右，故把沉降系数1010-13-13秒秒秒秒称为一个称为一个称为一个称为一个SvedbergSvedberg单位，简写为单位，简写为单位，简写为单位，简写为S S，量纲为秒。，量纲为秒。，量纲为秒。，量纲为秒。沉降系数越沉降系数越沉降系数越沉降系数越大，相对分子质量越大大，相对分子质量越大大，相对分子质量越

49、大大，相对分子质量越大104104离心机的装置及应用离心机的装置及应用l l 离心机的种类离心机的种类离心机的种类离心机的种类 一般分常速一般分常速一般分常速一般分常速,高速和超高速离心机高速和超高速离心机高速和超高速离心机高速和超高速离心机1 1 常速离心机常速离心机常速离心机常速离心机 5000r/min,5000r/min,用用用用途途途途：分分分分离离离离细细细细胞胞胞胞、细细细细胞胞胞胞碎碎碎碎片片片片、培培培培养养养养基残渣及粗结晶等较大颗粒基残渣及粗结晶等较大颗粒基残渣及粗结晶等较大颗粒基残渣及粗结晶等较大颗粒2 2 高速离心机高速离心机高速离心机高速离心机 5000500020

50、000r/min,20000r/min,用用用用途途途途：分分分分离离离离各各各各种种种种沉沉沉沉淀淀淀淀物物物物、细胞碎片及较大的细胞器等细胞碎片及较大的细胞器等细胞碎片及较大的细胞器等细胞碎片及较大的细胞器等105105uu3 3 超高速离心机超高速离心机超高速离心机超高速离心机 200002000060000r/min60000r/min 结结结结构构构构：离离离离心心心心管管管管帽帽帽帽、冷冷冷冷冻冻冻冻装装装装置置置置和和和和温温温温控控控控系系系系统统统统、真真真真空空空空系系系系统统统统、安全保护系统、制动系统、指示仪表等。安全保护系统、制动系统、指示仪表等。安全保护系统、制动系