实验六酵母蔗糖酶的粗提及其比活力测定.ppt

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1、实验六酵母蔗糖酶的粗提及其比活力测定 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望蔗糖酶活性及比活性测定原理蔗糖酶活性及比活性测定原理+蔗糖酶蔗糖酶 蔗糖酶的酶活单位：在40水浴反应10min，测定吸光值A540，增加0.01个光吸收值的酶量为一个酶活力单位（U）。蔗糖酶比活力测定：每毫克蔗糖酶蛋白所具有的活力单位，对同一种酶来说，酶的比活力越高，酶的纯度越高。试剂试剂（一）（一）蔗糖酶的粗提及活性测定蔗糖酶的粗提及活性测定 （1）冰冻无水乙醇：1瓶/班 （2）

2、0.01 mol/L pH6.0 PBS buffer，2000ml（全班共用）（3）0.5mol/L蔗糖,用0.01 mol/L pH6.0 PBS buffer配制，200ml（大组共用）（4）2 mol/L NaOH，1000ml （全班共用）（5）3,5-二硝基水扬酸(DNS)试剂：可配300ml （全班共用）19.2克酒石酸钾钠溶于50ml水中（电炉加热溶解，不用沸腾），把.0.63克3,5-二硝基水杨酸(DNS)和26.2ml2 mol/L NaOH 加到酒石酸钾钠的热溶液中，电炉加热溶解，冷却到50-60，再加0.5克苯酚和0.5克亚硫酸钠搅拌使溶解冷却后加水定容至100ml，过

3、滤，贮于棕色瓶中。实验方法实验方法（一）粗提取酵母蔗糖酶一）粗提取酵母蔗糖酶 （1）量取2g的面包酵母，加液氮研磨（加入少量石英砂）充分研磨，再加入18ml的0.01mol/L PBS（pH 6.0），搅拌混合,再加入液氮研磨,（2）待溶液完全解冻后,转入离心管,2ml PBS洗研钵,转入离心管.（二）热提取酵母蔗糖酶（二）热提取酵母蔗糖酶 （3）11000r/min离心10min，离心后取上清液，按下表方法分别测蔗糖酶A的活性及蛋白含量（蛋白含量略）。（4）将上述上清液置于45的恒温水浴锅中，用玻璃棒缓慢搅拌30min，然后置于冰浴中迅速冷却5min。然后装入离心管中，离心，转速11000r

4、/min条件下离心10min，离心后取上清液，按下表方法分别测蔗糖酶B的活性及蛋白含量。（三）乙醇提取酵母蔗糖酶（三）乙醇提取酵母蔗糖酶（1）取上述第4步中的上清液10ml，缓慢加入10ml的冰冻的无水乙醇（乙醇的终浓度为50），并搅拌5min，此过程在冰浴中进行。然后装入离心管中，转速3000r/min条件下离心5min，离心后弃上清液，留沉淀，离心管倒置于滤纸上，尽可能去除乙醇残液。（2）将沉淀用15ml的0.01mol/L的PBS（pH6.0）搅拌溶解30min，溶液如为浑浊液，10000r/min离心10min，离心后取上清液，按下表方法测蔗糖酶C的活性及蛋白含量。表1 酵母蔗糖酶酶活

5、性及比活力测定 试剂对照管粗提A1粗提A2热提B1热提B2醇提C1醇提C20.5mol/L蔗糖（ml）0.30.30.30.30.30.30.32 mol/L NaOH（ml）0.100000040恒温水浴准确保温10min各组酶液（ml）0.10.10.10.10.10.10.01 mol/L pH6.0 PBS（ml）0.140恒温水浴中准确反应10min2 mol/L NaOH（ml）0.10.10.10.10.10.1DNS（ml）0.50.50.50.50.50.50.5100沸水浴准确加热5min，立即冷却蒸馏水（ml）5555555摇匀，以对照管作空白A5400酶活（U）0酶比活力（U/mg）0酶比活力平均值（U/mg）0实验结果分析实验结果分析4思考题：（1）比较哪种蔗糖酶的粗提方法使酶的活性及纯度较高。（2）本实验中有哪些影响蔗糖酶活性的因素。