《植物生物学》课件.ppt

《《植物生物学》课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《植物生物学》课件.ppt（82页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、11植物种质离体保存植物种质离体保存111.1概述概述种质资源种质资源(germpalsmresources)基因资源基因资源(generesources)遗传资源遗传资源(geneticresources)指包含一定的遗传物质，表现一定的优良性状，指包含一定的遗传物质，表现一定的优良性状，并能将其遗传性状传递给后代的植物资源的总和。并能将其遗传性状传递给后代的植物资源的总和。2种质资源研究的类型种质资源研究的类型 群群 体体 个个 体体 性性 状状 细细 胞胞 基基 因因 3从来源上看，种质资源包括从来源上看，种质资源包括（1）自然自然资资源源中的植物材料；中的植物材料；（2）人工人工创创造

2、造的植物材料：的植物材料：栽培品种、中栽培品种、中试试品种、育种的中品种、育种的中间间材料、材料、育种工作的基育种工作的基础础材料。材料。4种质保存的意义种质保存的意义 随着经济发展，地球不断开发及生态环境随着经济发展，地球不断开发及生态环境破坏，每年都有破坏，每年都有多个物种消失或濒临灭绝多个物种消失或濒临灭绝。各。各种植物，包括栽培种、野生种甚至杂草，都具种植物，包括栽培种、野生种甚至杂草，都具有各自独特的优良基因，是植物品种改良和农有各自独特的优良基因，是植物品种改良和农业持续发展的基础。它们是经过长期进化而来，业持续发展的基础。它们是经过长期进化而来，一旦失去不会再来。因此，世界各国都

3、很重视一旦失去不会再来。因此，世界各国都很重视植物种质资源的收集与保存的研究。植物种质资源的收集与保存的研究。5中国特有植物中国特有植物银杏、水杉银杏、水杉珙珙(gong)桐桐6金花茶金花茶毛华菊毛华菊7种质资源的保存方法种质资源的保存方法(1)(1)原地保存原地保存 指在植物资源丰富的地区指在植物资源丰富的地区,在种质资源原来在种质资源原来所处的生态环境中，不经迁移，所处的生态环境中，不经迁移，建立自然保护区、建立自然保护区、原地保存林等原地保存林等,采取措施加以保护采取措施加以保护。(2)异地保存（种质圃保存）异地保存（种质圃保存）将种质材料迁出自然生长地，集中改种在将种质材料迁出自然生长

4、地，集中改种在植物园、树木园、品种资源圃、种质资源圃等处植物园、树木园、品种资源圃、种质资源圃等处保存。保存。89(3)种子保存种子保存(4)离体保存离体保存(5)基因文库保存基因文库保存设施保存设施保存将种质材料大批将种质材料大批量贮藏于一个较小的、量贮藏于一个较小的、可以人工控制的空间可以人工控制的空间,并能安全地保存种质并能安全地保存种质3050年以上年以上,具有具有种质不易丢失、便于种质不易丢失、便于交换和利用等特点。交换和利用等特点。种子保存（贮藏保存）种子保存（贮藏保存）用控制贮藏条件（温度和湿度）的方法保持用控制贮藏条件（温度和湿度）的方法保持种质资源的生活力。种质资源的生活力。

5、温度温度300，每降低，每降低5，种子的寿命延长，种子的寿命延长1倍。倍。种子含水量种子含水量14-4%，每减少，每减少1%，种子的寿，种子的寿命延长命延长1倍。倍。10资源库资源库温度温度湿度湿度种子贮藏方式与时间种子贮藏方式与时间短期库短期库450%纸袋中可保存纸袋中可保存5年年中期库中期库-6-240-50%密闭容器内保存密闭容器内保存20年年长期库长期库-101535%真空包装中保存真空包装中保存70年年11利用试管保存的优点：利用试管保存的优点：所需空间小所需空间小可以解决常规方法不易保存的种质资源。可以解决常规方法不易保存的种质资源。繁殖时不受季节限制，繁殖速度快。繁殖时不受季节限

6、制，繁殖速度快。培养物不带病虫害，便于种质交流。培养物不带病虫害，便于种质交流。离体保存离体保存(试管保存）试管保存）是在适宜条件下，用试管保存植物的组织和是在适宜条件下，用试管保存植物的组织和细胞的培养物。细胞的培养物。1213对于对于难以产生或不产生种子的无性繁难以产生或不产生种子的无性繁殖植物殖植物，如马铃薯、甘薯、大蒜、生姜等，如马铃薯、甘薯、大蒜、生姜等，以及以及含水量较高的种子含水量较高的种子如洋葱、芹菜、结如洋葱、芹菜、结球甘蓝等作物的种子，在脱水后即死亡，球甘蓝等作物的种子，在脱水后即死亡，自然状态下繁殖，不可能保存全部的基因自然状态下繁殖，不可能保存全部的基因型。对于这些作物

7、的种质保存，型。对于这些作物的种质保存，采取的方采取的方法都是离体保存法都是离体保存。14利用利用DNA重组技术，将种质材料的总重组技术，将种质材料的总DNA或染色体所有片断随机连接到载体上，或染色体所有片断随机连接到载体上，然后转移到寄主细胞中，通过细胞增殖，然后转移到寄主细胞中，通过细胞增殖，构成各个构成各个DNA片断的克隆。片断的克隆。基基因因文文库库保保存存基因文库技术基因文库技术从植物中提取从植物中提取DNA用限制性内切酶切用限制性内切酶切成片段成片段连接到载体连接到载体转移到大肠杆菌细胞转移到大肠杆菌细胞无性繁殖，产生大量无性繁殖，产生大量单拷贝基因单拷贝基因需要某个基因时需要某个

8、基因时“钩取钩取”15基因组基因组DNA文库文库 (genomicDNAlibrary)cDNA文库文库 (cDNAlibrary)基因文库基因文库(genelibrary)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA序列序列的克隆群体。的克隆群体。基因组DNA文库第一轮筛选第一轮筛选第二轮筛选第三轮筛选基因组文库筛选结果举例基因组文库筛选结果举例著名的种质资源数据库：著名的种质资源数据库：芬兰、瑞典、挪威、冰岛、丹麦共同建立的北芬兰、瑞典、挪威、冰岛、丹麦共同建立的北欧五国作物种质资源数据库欧五国作物种质资源数据库日本农林水产省的作物种质资源信息系统日本农林水产省的作

9、物种质资源信息系统美国农业部的作物种质资源信息网络系统美国农业部的作物种质资源信息网络系统中国国家作物种质资源数据库系统中国国家作物种质资源数据库系统菲律宾国际水稻所的国际水稻种质资源数据库菲律宾国际水稻所的国际水稻种质资源数据库种质资源数据库种质资源数据库1920很多国家从上世纪很多国家从上世纪50年代以来十分重视资年代以来十分重视资源的收集和保存。源的收集和保存。1958年建成的美国国家种质库是世界上第年建成的美国国家种质库是世界上第一座现代化种质库一座现代化种质库,该库于该库于1992年扩建成库容年扩建成库容100万份的现代化国家种质库万份的现代化国家种质库,已保存各类植物已保存各类植物

10、种质资源种质资源55万份。万份。21英国皇家植物园邱园英国皇家植物园邱园的千年种子库工程的千年种子库工程(MSBP),是目前是目前世界上最大的种质设施保世界上最大的种质设施保存库存库。该库于。该库于2001年建成并投入使用年建成并投入使用,MSBP计划到计划到2010年使得全世界干旱地区年使得全世界干旱地区2.4万种以上万种以上(约约10%)的植物种子得到收集的植物种子得到收集和保存和保存,目前已收集保存了全英国目前已收集保存了全英国95%的植的植物种质资源物种质资源,并与澳大利亚、埃及、肯尼亚、并与澳大利亚、埃及、肯尼亚、南非等南非等12个国家开展了合作个国家开展了合作,收集以干旱地收集以干

11、旱地区为主的植物种质资源。区为主的植物种质资源。22发展中国家发展中国家印度印度也于也于1976年成立国家年成立国家植物种质资源局植物种质资源局(NBPGR),下设下设30个单位个单位组成全印植物种质资源保存体系组成全印植物种质资源保存体系,已保存已保存20万份种质万份种质,每年用于植物种质资源保存每年用于植物种质资源保存维护费维护费110万美元万美元,1997年建成库容年建成库容100万万份的国家植物种质资源库份的国家植物种质资源库,成为世界植物成为世界植物种质资源大国。种质资源大国。23中国农科院在中国农科院在1984年和年和1986年分两期在北年分两期在北京建立了一座较大型的京建立了一座

12、较大型的国家农作物种质库国家农作物种质库,包包括一座括一座长期库长期库和一座和一座中期库中期库,而于而于90年代初又年代初又在青海建立了一个在青海建立了一个“复份库复份库”,至至2000年年,已已保存了保存了33万份材。万份材。24中国作物种质资源信息系统中国作物种质资源信息系统（CGRIS），），拥有粮食、拥有粮食、纤维、油料、纤维、油料、蔬菜、果树、糖、蔬菜、果树、糖、烟、茶、桑、牧草、绿肥、热作等烟、茶、桑、牧草、绿肥、热作等180种作物、种作物、39万份品种万份品种/种质种质/基因信息。基因信息。中国作物种质信息网中国作物种质信息网/25中国西南野生生物种质资源库中国西南野生生物种质资

13、源库2008年年4月月29日在中国科学院昆明植物研究所建成，于日在中国科学院昆明植物研究所建成，于10月月29日宣布投入运行。三万多种植物以及丰富日宣布投入运行。三万多种植物以及丰富的动物种质资源得以的动物种质资源得以“多世同堂多世同堂”。中国西南。中国西南野生生物种质资源库从筹建野生生物种质资源库从筹建到竣工历时年，到竣工历时年，项目总投资亿，建筑面积约项目总投资亿，建筑面积约7000平方米，园区平方米，园区80亩。项目建设包括种子库、植物离体库、微亩。项目建设包括种子库、植物离体库、微生物库、动物种质资源库、生物库、动物种质资源库、DNA库。库。中国西南野生生物种质资源库中国西南野生生物种

14、质资源库26中国中国首个数字化的热带亚热带植物种质首个数字化的热带亚热带植物种质资源库资源库2008年年7月月在广州建成新引种热带亚热在广州建成新引种热带亚热带珍稀植物带珍稀植物800多种，包括华南植物园活植物多种，包括华南植物园活植物数据库，入库数据达数据库，入库数据达11000条以上。建立了植条以上。建立了植物的成年植株、小苗、种子、插条、器官组物的成年植株、小苗、种子、插条、器官组织、织、DNA、有效化学成分等的保存技术体系。、有效化学成分等的保存技术体系。1996年年4月中国科学院月中国科学院典型培养物典型培养物保藏委员保藏委员会会(TCC/CAS)用三年时间用三年时间(1996-19

15、98)筹建筹建中国科学院植物离体种质库。主要工作是收集、中国科学院植物离体种质库。主要工作是收集、保存植物离体种质，研究其快速繁殖方法和保保存植物离体种质，研究其快速繁殖方法和保存技术。存技术。目前目前能够提供部分所保存的试管植物原种和能够提供部分所保存的试管植物原种和其快速繁殖技术；已初步建成的植物组织培养其快速繁殖技术；已初步建成的植物组织培养文献数据库可供查询；文献数据库可供查询；并欢迎进行有关快速繁并欢迎进行有关快速繁殖和离体种质保存技术的合作研究。殖和离体种质保存技术的合作研究。本库现保存各种培养物本库现保存各种培养物250种左右，包括蕨种左右，包括蕨类植物类植物56种，苦苣苔科植物

16、种，苦苣苔科植物31种，食虫植物种，食虫植物17种，猕猴桃属植物种，猕猴桃属植物35种，各种观赏植物种，各种观赏植物48种，种，工程植物工程植物59种。种。朱朱 至至 清清272811.2植物材料的离体保存植物材料的离体保存常用的离体保存方法是常用的离体保存方法是缓慢生长保存缓慢生长保存和和超低温保存超低温保存。前者适合中短期保存，后前者适合中短期保存，后者用于长期保存。者用于长期保存。11.2.1植物材料离体保存的方法植物材料离体保存的方法缓慢生长保存缓慢生长保存指改变培养物生长的外界环境条件，使细胞指改变培养物生长的外界环境条件，使细胞生长降至最小限度，但不死亡，从而延长继代培生长降至最小

17、限度，但不死亡，从而延长继代培养时间。养时间。优点是优点是：使保存材料维持不断生长，取出部：使保存材料维持不断生长，取出部分材料进行鉴定或用于育种之后，还有保存的材分材料进行鉴定或用于育种之后，还有保存的材料。料。29常温抑制生长保存常温抑制生长保存中低温调控生长保存中低温调控生长保存常温抑制生长保存与中低温调控常温抑制生长保存与中低温调控生长保存相结合生长保存相结合30改变生长温度抑制生长改变生长温度抑制生长缓缓慢慢生生长长保保存存常温抑制生长保存常温抑制生长保存 降低降低培养基中培养基中无机盐浓度（无机盐浓度（1/4MS、1/2MS),添加一添加一定量生长抑制剂，如脱落酸定量生长抑制剂，如

18、脱落酸(ABA)、矮壮素（、矮壮素（2-氯乙基三氯乙基三甲基氯化铵，甲基氯化铵，CCC）、多效唑（）、多效唑（PP333）、高效唑）、高效唑（3307）、二甲基氨琥珀酸（）、二甲基氨琥珀酸（B9）、）、TIBA、膦甘酸、甲、膦甘酸、甲基丁二酸基丁二酸等等,也可以加入甘露醇（也可以加入甘露醇（1-5%）、山梨醇、高浓）、山梨醇、高浓度蔗糖（度蔗糖（2-4%）等，延缓生长，保持活力达到一年以上。）等，延缓生长，保持活力达到一年以上。31温度温度:2025中低温调控生长保存中低温调控生长保存 在试管苗继代培养过程，适当降低温度，也在试管苗继代培养过程，适当降低温度，也能延缓生长，延长继代时间。能延缓

19、生长，延长继代时间。低温保存低温保存32温度温度:015温度温度:0-803319世纪末世纪末,诞生了一门新的科学诞生了一门新的科学低温低温生物学生物学(Cryobiology)。1949年发现了甘油可年发现了甘油可以防止冰冻对活细胞的伤害以防止冰冻对活细胞的伤害,对低温生物学有重对低温生物学有重要贡献。从此，在许多不同领域内广泛应用低要贡献。从此，在许多不同领域内广泛应用低温保护技术。温保护技术。低温保存（低温保存（cryopreservation）是由）是由cryo和和preservation组成，在英语中组成，在英语中cryo为一前缀，被为一前缀，被解释为低温、冷、冰、霜之意。解释为低温

20、、冷、冰、霜之意。超低温保存超低温保存（ultra-lowtemperature）通常指低于通常指低于-80的低温，主要是液氮的低温，主要是液氮（-196）及液氮蒸汽相（及液氮蒸汽相（-140）。）。34超低温保存常用的冷源有干冰超低温保存常用的冷源有干冰(-79)、超、超低温冰箱低温冰箱(-80-150)、液氮、液氮(-196)等。等。超低温保存已经证明是一种长期保超低温保存已经证明是一种长期保存高产细胞系的有效方法。存高产细胞系的有效方法。超低温保存生物材料的报道可追溯到超低温保存生物材料的报道可追溯到18世纪。世纪。但直到但直到1973年年Nag和和Street首次成功地首次成功地在液氮

21、中保存了胡萝卜悬浮细胞，植物种在液氮中保存了胡萝卜悬浮细胞，植物种质超低温保存才取得突破性进展。质超低温保存才取得突破性进展。351922年年Knowlton首先报道了首先报道了-180贮存后的金鱼草贮存后的金鱼草(Antirrhinummajus)花花粉仍具有生活力粉仍具有生活力,同时发现降低花粉含水量同时发现降低花粉含水量能够提高冰冻保存的生存率。能够提高冰冻保存的生存率。已对许多植物展开了这方面的研究，涉已对许多植物展开了这方面的研究，涉及保存的材料有：及保存的材料有：原生质体、悬浮细胞、愈伤组织、体原生质体、悬浮细胞、愈伤组织、体细胞胚、胚、花粉胚、花粉、茎尖（根尖）细胞胚、胚、花粉胚

22、、花粉、茎尖（根尖）分生组织、芽、茎段、种子等。分生组织、芽、茎段、种子等。36超低温保存的植物种类超低温保存的植物种类 超低温保存已涉及到不同的植物种类，超低温保存已涉及到不同的植物种类，如野生及人工创造的如野生及人工创造的谷类、豆类、薯类、油谷类、豆类、薯类、油类、糖类、纤维类、蔬菜类、果树、树木、类、糖类、纤维类、蔬菜类、果树、树木、药用植物和藻类等。药用植物和藻类等。3738超低温离体保存的机理超低温离体保存的机理种质超低温保存成功的关键在于：种质超低温保存成功的关键在于：降温冰冻过程中降温冰冻过程中避免细胞内结冰；避免细胞内结冰；化冻过程中化冻过程中减少次生结冰。减少次生结冰。在超低

23、温条件下，生物的代谢和衰老过在超低温条件下，生物的代谢和衰老过程大大减慢，甚至完全停止，程大大减慢，甚至完全停止，仅仅保存细胞的活保存细胞的活力和形态发生的潜力力和形态发生的潜力。当解冻后，能够恢复再。当解冻后，能够恢复再生能力。因此可以长期保存植物材料。生能力。因此可以长期保存植物材料。39控制降温冰冻速度控制降温冰冻速度及及添加冰冻保护剂添加冰冻保护剂对防对防止细胞内结冰至关重要。可以促进保存材料组止细胞内结冰至关重要。可以促进保存材料组织在结冰早期进行保护性脱水织在结冰早期进行保护性脱水,阻止冰晶生长阻止冰晶生长,达到玻璃化状态。达到玻璃化状态。细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的细胞内

24、外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键。关键。植物细胞中含有大量的水分，约占细胞总植物细胞中含有大量的水分，约占细胞总重量的重量的6090，由游离水和束缚水组成，其，由游离水和束缚水组成，其中游离水约占中游离水约占90，很容易冻结。，很容易冻结。40理论上讲，理论上讲，细胞外水的冻结温度为细胞外水的冻结温度为-5-15，细胞内游离水的冻结在，细胞内游离水的冻结在-25。-30时，细胞几乎没有非冻结状态的时，细胞几乎没有非冻结状态的游离水存在，而结合水在游离水存在，而结合水在-100温度下也不温度下也不冻结。冻结。41冷冻时，细胞外的溶液水分子，先形成冷冻时，细胞外的溶液水分子，先形成冰晶中心，一般

25、在冰晶中心，一般在-20-60范围内，晶体范围内，晶体中心增长最快，形成大块冰晶体之后，慢慢中心增长最快，形成大块冰晶体之后，慢慢减速，到减速，到-140时完全停止增长。时完全停止增长。431.生物细胞在生物细胞在有防冻剂存在有防冻剂存在的降温过的降温过程中程中,随着温度降低随着温度降低,细胞液逐渐结冰。细胞液逐渐结冰。-10时细胞外介质结冰已基本完成时细胞外介质结冰已基本完成,而细胞内尚未而细胞内尚未结冰结冰,从而造成细胞内外的蒸气压差从而造成细胞内外的蒸气压差,这时只要这时只要降温速率不太快降温速率不太快,细胞内的水不断向细胞外扩细胞内的水不断向细胞外扩散散,细胞原生质浓缩细胞原生质浓缩,

26、就会降低细胞内含物的冰就会降低细胞内含物的冰点点,这种这种逐渐除去细胞内水分的过程称为逐渐除去细胞内水分的过程称为“保保护性脱水护性脱水”。能有效地阻止在细胞质或液态中。能有效地阻止在细胞质或液态中结冰。结冰。降温时的三种情况降温时的三种情况442.此时此时若冷却的速度加快若冷却的速度加快(10/min),细细胞内的自由水来不及扩散到周围溶液胞内的自由水来不及扩散到周围溶液,细胞内就细胞内就产生大量的冰晶产生大量的冰晶,产生冰害产生冰害,导致细胞死亡。导致细胞死亡。3.但如果但如果降温速度很快降温速度很快,细胞质溶液细胞质溶液“固化固化”,细胞内形成对细胞不致伤害的微小冰晶或细胞内形成对细胞不

27、致伤害的微小冰晶或仍保持非结晶状态仍保持非结晶状态,这种现象称为这种现象称为玻璃化玻璃化,这时这时细胞内的水不是冰晶细胞内的水不是冰晶,而是玻璃态的水而是玻璃态的水,对细胞对细胞器和细胞膜不构成直接伤害。器和细胞膜不构成直接伤害。细胞内含物一旦发生玻璃化就能避免细胞细胞内含物一旦发生玻璃化就能避免细胞内结冰内结冰,从而达到超低温保存效果。从而达到超低温保存效果。目前常用的超低温保存方法可分为两类目前常用的超低温保存方法可分为两类 冷冻诱导保护性脱水的超低温保存冷冻诱导保护性脱水的超低温保存 玻璃化处理的超低温保存玻璃化处理的超低温保存 4511.3超低温保存的程序超低温保存的程序（1）培养材料

28、的准备）培养材料的准备（2）预处理）预处理（3）添加冷冻保护剂）添加冷冻保护剂（4）采取不同的）采取不同的冰冻方法及保存冰冻方法及保存（5）化冻处理）化冻处理（6）细胞活力和变异的评价）细胞活力和变异的评价（7）植株再生）植株再生4611.3.1冷冻诱导保护性脱水的超低温保存程序冷冻诱导保护性脱水的超低温保存程序三个重要操作步骤：三个重要操作步骤：(1)细胞预冻；细胞预冻；(2)细胞在细胞在-196下长期贮存；下长期贮存；(3)细胞解冻。细胞解冻。47针对不同种类的植物材料，针对不同种类的植物材料，筛选筛选适合的冰冻保护剂适合的冰冻保护剂采用采用适当的降温冰冻速度适当的降温冰冻速度采用采用适当

29、的化冻方式适当的化冻方式使细胞不受损伤或使损伤减小到最低程度。使细胞不受损伤或使损伤减小到最低程度。48 （1）保存材料的选择）保存材料的选择花粉、茎尖分生组织、芽、种胚、小植株、愈伤花粉、茎尖分生组织、芽、种胚、小植株、愈伤组织、体细胞胚等均可以作为保存材料。组织、体细胞胚等均可以作为保存材料。（2）冷冻前材料预处理（预）冷冻前材料预处理（预培养）培养）为了使保存材料适应超低温条件，必须进行预处为了使保存材料适应超低温条件，必须进行预处理。理。预处理方法预处理方法：将保存材料放在高糖浓度、添加二：将保存材料放在高糖浓度、添加二甲基亚砜（甲基亚砜（DMSO）、脯氨酸的培养基上，在接近）、脯氨酸

30、的培养基上，在接近0培养数日。培养数日。49预处理对于调整植物离体材料的生理状态非常预处理对于调整植物离体材料的生理状态非常有效。有效。通过预处理的植物材料，通过预处理的植物材料，减少了细胞内自由水减少了细胞内自由水的含量的含量，使细胞能经受低温胁迫，使细胞能经受低温胁迫，减少或避免了减少或避免了冷冻伤害冷冻伤害，可大大提高材料的抗冻力。，可大大提高材料的抗冻力。5051（cryoprotectiveagent，CPA）一般的生物体在没有添加冰冻保护剂的情一般的生物体在没有添加冰冻保护剂的情况下经历低温后是很难存活下来的。况下经历低温后是很难存活下来的。为了抵抗冻害，使用冷冻防护剂，为了抵抗冻

31、害，使用冷冻防护剂，也称作也称作抗冻剂，对低温保存很重要。抗冻剂，对低温保存很重要。（3）添加冷冻防护剂）添加冷冻防护剂 冰冻保护剂具有以下特点：冰冻保护剂具有以下特点：易溶于水，对细胞无毒，容易从组织细胞中清易溶于水，对细胞无毒，容易从组织细胞中清除。除。冰冻保护剂的作用：冰冻保护剂的作用：主要表现在增加膜透性，加速细胞内的水流到主要表现在增加膜透性，加速细胞内的水流到细胞外结冰，稳定细胞膜结构，阻止低温伤害，降细胞外结冰，稳定细胞膜结构，阻止低温伤害，降低冰点，提高溶液的粘滞性，阻止冰晶生长。低冰点，提高溶液的粘滞性，阻止冰晶生长。52渗透型冰冻保护剂：渗透型冰冻保护剂：多属低分子中性物质

32、，多属低分子中性物质，在溶液中易结合水分子，发生水合作用，使溶液在溶液中易结合水分子，发生水合作用，使溶液的粘性增加，从而弱化了水的结晶过程，达到保的粘性增加，从而弱化了水的结晶过程，达到保护的目的。护的目的。常用的有：常用的有：甘油、二甲亚砜（甘油、二甲亚砜（DMSO）、乙）、乙二醇（二醇（EG）、乙酰胺、丙二醇（）、乙酰胺、丙二醇（PG）等。）等。53渗透型冰冻保护剂的使用浓度、渗入细渗透型冰冻保护剂的使用浓度、渗入细胞的能力、对水分子活性的影响等各不相同。胞的能力、对水分子活性的影响等各不相同。非渗透型冰冻保护剂的特点：非渗透型冰冻保护剂的特点：能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈能溶于

33、水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，可在特定温度下降低溶质（电解过冷状态，可在特定温度下降低溶质（电解质）浓度，起到保护作用。质）浓度，起到保护作用。此类冰冻保护剂对快速、慢速冷却均有此类冰冻保护剂对快速、慢速冷却均有保护效果。保护效果。54非渗透型冰冻保护剂主要有非渗透型冰冻保护剂主要有聚乙烯吡咯烷酮（聚乙烯吡咯烷酮（polyvingylpyrollidone，PVP）蔗糖（蔗糖（sucrose）葡聚糖（右旋糖酐，葡聚糖（右旋糖酐，dextrane）聚乙二醇（聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）白蛋白（白蛋白（albumin）羟乙基淀粉（羟乙基淀粉（hydroxyet

34、hylstarch，HES）55（4）冷冻处理方法）冷冻处理方法快速冷冻法快速冷冻法慢速冷冻法慢速冷冻法预冷冻法预冷冻法干燥冷冻法干燥冷冻法56快速冷冻法：快速冷冻法：将植物材料从将植物材料从0或其它的预处理温度直接或其它的预处理温度直接投入液氮中保存的方法。植物体内水分从投入液氮中保存的方法。植物体内水分从-20-140范围内是冰晶形成和增长的危险范围内是冰晶形成和增长的危险温度区，到温度区，到-140时完全停止增长。时完全停止增长。关键是利用高速降温越过冰晶增长的危险关键是利用高速降温越过冰晶增长的危险温度区，这样就不能形成致死的冰晶。温度区，这样就不能形成致死的冰晶。降温速率为降温速率为

35、1000/min57 慢速降温法：慢速降温法：将植物材料从将植物材料从0或其它的预处理温度以或其它的预处理温度以1-2/min降到降到-100，稳定，稳定1h后再投入液氮中保存。后再投入液氮中保存。缓慢冷冻，细胞内的自由水扩散到细胞外的缓慢冷冻，细胞内的自由水扩散到细胞外的冰晶表面，并形成冰，使细胞发生冰晶表面，并形成冰，使细胞发生保护性的脱水保护性的脱水，避免在细胞内形成冰晶避免在细胞内形成冰晶，这样细胞可以存活。，这样细胞可以存活。58预冷冻法：预冷冻法：投入液氮前，需要经过短暂时间的低温锻炼。投入液氮前，需要经过短暂时间的低温锻炼。59将种质材料在添加保护剂将种质材料在添加保护剂(如蔗糖

36、、二甲亚砜、如蔗糖、二甲亚砜、甘油等甘油等)后置于低温冰箱或液氮蒸汽箱后置于低温冰箱或液氮蒸汽箱(-10-70)中冰冻若干小时后投入液氮贮存。中冰冻若干小时后投入液氮贮存。60两步法两步法:种质材料在添加保护剂后种质材料在添加保护剂后,用程序用程序降温仪以某个速率降温仪以某个速率(每分钟每分钟0.10.5)降温降温至转移温度至转移温度(-40-70),然后投入液氮中贮然后投入液氮中贮存。存。逐级冷冻：逐级冷冻：材料通过不同温度等级降温材料通过不同温度等级降温至至-40，停留一段时间，投入液氮快速冷，停留一段时间，投入液氮快速冷冻。冻。干燥冷冻：干燥冷冻：将材料置于将材料置于27-29的烘箱内，

37、或用干燥硅的烘箱内，或用干燥硅胶胶降低植物含水量后，再投入液氮中保存的降低植物含水量后，再投入液氮中保存的方法，可以防止植物冻死。方法，可以防止植物冻死。61（5）化冻方法化冻方法液泡小、含水量少的细胞（如茎尖分液泡小、含水量少的细胞（如茎尖分生组织），可采用生组织），可采用快速化冻快速化冻的方法。的方法。液泡大、含水量高的细胞则一般需要液泡大、含水量高的细胞则一般需要采用采用慢速化冻法慢速化冻法。62 解冻速度解冻速度是解冻技术关键，一般在是解冻技术关键，一般在37的热的热水浴中解冻。水浴中解冻。解冻速度慢，细胞内容易发生再结晶，而导致细解冻速度慢，细胞内容易发生再结晶，而导致细胞死亡。胞死

38、亡。解冻速度快，来不及再结晶，细胞存活解冻速度快，来不及再结晶，细胞存活。63生长季节中的材料生长季节中的材料，一般在，一般在3740温温水浴中快速化冻比在室温下慢速化冻要好。水浴中快速化冻比在室温下慢速化冻要好。木本植物的冬芽，木本植物的冬芽，在超低温保存后，必在超低温保存后，必须在须在0低温下进行慢速化冻才能达到良好的低温下进行慢速化冻才能达到良好的效果。效果。64 保存材料解冻后，需用液体培养基冲洗保存材料解冻后，需用液体培养基冲洗几遍，除去冷冻防护剂的残留毒害。然后可几遍，除去冷冻防护剂的残留毒害。然后可以在固体培养基上进行培养，进行正常生长，以在固体培养基上进行培养，进行正常生长，再

39、生植株。再生植株。65（6）超低温保存过程中的遗传变异及其超低温保存过程中的遗传变异及其检测技术检测技术无论哪种种质资源的保存方法都是以保无论哪种种质资源的保存方法都是以保持物种原有的遗传特性为出发点。在超低温持物种原有的遗传特性为出发点。在超低温保存过程中，植物材料是否发生变异是育种保存过程中，植物材料是否发生变异是育种工作者十分关心的问题。工作者十分关心的问题。66为了掌握超低温保存材料的遗传变异情为了掌握超低温保存材料的遗传变异情况，有必要在保存材料的恢复和再生阶段进况，有必要在保存材料的恢复和再生阶段进行有效的检测体系。行有效的检测体系。形态学观察、细胞学方法、同功酶、分形态学观察、细

40、胞学方法、同功酶、分子标记如子标记如RFLP和和RAPD等检测方法等检测方法常常单常常单独或结合起来用于遗传变异分析。独或结合起来用于遗传变异分析。67（7）再培养再培养经冻存的材料会不可避免地受到不同程度经冻存的材料会不可避免地受到不同程度的伤害。为了减少再培养中的光抑制，利于离的伤害。为了减少再培养中的光抑制，利于离体材料恢复生长，体材料恢复生长，冻存的材料一般在黑暗或弱冻存的材料一般在黑暗或弱光下培养光下培养12周，再转入正常光下培养。周，再转入正常光下培养。68再培养所用的培养基再培养所用的培养基一般是与保存前的相同，但有时需将大量一般是与保存前的相同，但有时需将大量元素或琼脂含量减半

41、，有时则在培养基中附加元素或琼脂含量减半，有时则在培养基中附加一定量的一定量的PVP、水解酪蛋白等成分以利于生长、水解酪蛋白等成分以利于生长的恢复。的恢复。69一般为愈伤组织、一般为愈伤组织、悬浮细胞、胚、悬浮细胞、胚、花粉和茎尖花粉和茎尖7011.3.2玻璃化冻存方法玻璃化冻存方法玻璃化（玻璃化（vitrification）是指液体转变为非）是指液体转变为非晶体（玻璃态）的固化过程。晶体（玻璃态）的固化过程。71用玻璃化法冻存程序是：用玻璃化法冻存程序是：（1）使用冷冻保护剂溶液对材料进行预处理；）使用冷冻保护剂溶液对材料进行预处理；（2）然后用玻璃化溶液进行脱水处理；）然后用玻璃化溶液进行

42、脱水处理；（3）最后投入液氮保存。）最后投入液氮保存。1玻璃化法玻璃化法是将生物材料是将生物材料直接直接经极高浓度的经极高浓度的玻璃化保护玻璃化保护剂剂快速脱水后，直接投入液氮。使生物材料快速脱水后，直接投入液氮。使生物材料在快在快速降温时速降温时胞内胞外都进入玻璃化态胞内胞外都进入玻璃化态,而不形成冰晶而不形成冰晶,从而避免了细胞结构的破坏从而避免了细胞结构的破坏。此间水分子没有发生重排，不形成冰晶，也此间水分子没有发生重排，不形成冰晶，也不产生结构和体积的改变，因而不会对材料造成不产生结构和体积的改变，因而不会对材料造成伤害。伤害。72Sakai1991设计的玻璃化保护剂设计的玻璃化保护剂

43、PVS230%甘油甘油+15%乙二醇蔗糖乙二醇蔗糖+MS无激素无激素培养基培养基732包埋脱水化法包埋脱水化法茎尖、分生组织和体细胞胚等种质材料用褐茎尖、分生组织和体细胞胚等种质材料用褐藻酸钙包埋后藻酸钙包埋后,第一阶段先在含高浓度蔗糖的培第一阶段先在含高浓度蔗糖的培养基中脱水养基中脱水,第二阶段用无菌空气流或干燥硅胶第二阶段用无菌空气流或干燥硅胶脱水脱水,然后投入液氮贮存。然后投入液氮贮存。可以保护材料的结构不会遭到破坏。可以保护材料的结构不会遭到破坏。743包埋玻璃化法包埋玻璃化法是是包埋脱水法包埋脱水法和和玻璃化法玻璃化法的结合。的结合。保存材料先用藻酸钙包埋，然后经蔗糖浓度保存材料先用

44、藻酸钙包埋，然后经蔗糖浓度梯度脱水和玻璃化溶液处理后直接浸入液氮保梯度脱水和玻璃化溶液处理后直接浸入液氮保存。存。材料存活率比用包埋材料存活率比用包埋脱水法要高，藻酸钙脱水法要高，藻酸钙包埋后减轻了玻璃化溶液的毒性。包埋后减轻了玻璃化溶液的毒性。7677玻璃化冻存的材料玻璃化冻存的材料在保存终止后，在保存终止后，快速化冻，以防止由于次生结冰对组织快速化冻，以防止由于次生结冰对组织细胞造成的伤害。细胞造成的伤害。材料能安全度过材料能安全度过冷却和化冻冷却和化冻两个关口，两个关口，就可保证冻存的成功。就可保证冻存的成功。新疆紫草高产细胞系的超低温保存程序新疆紫草高产细胞系的超低温保存程序（李国凤等

45、，（李国凤等，1992)1.将高产细胞系的愈伤组织放入试管内，在冰将高产细胞系的愈伤组织放入试管内，在冰浴条件下加入预冷的浴条件下加入预冷的冰冻保护剂（冰冻保护剂（7.5%的二的二甲基亚砜山梨醇甲基亚砜山梨醇5%甘油甘油5%蔗糖蔗糖)2.密封试管，继续在冰浴中停留密封试管，继续在冰浴中停留15min左右左右3.经过保护剂处理的愈伤组织，以经过保护剂处理的愈伤组织，以1/min的速的速度冷却，从度冷却，从1降低到降低到-40，在，在-40停留停留2h后投入液氮罐后投入液氮罐-196储存。储存。784.当需要使用细胞系时，将保存的愈伤组织当需要使用细胞系时，将保存的愈伤组织用用40的温水浴快速化冻

46、，并以消毒过的培养的温水浴快速化冻，并以消毒过的培养液彻底洗涤，液彻底洗涤，5.接种到继代培养基上，在接种到继代培养基上，在25下暗中培养，下暗中培养，愈伤组织即可逐渐复苏，恢复生长愈伤组织即可逐渐复苏，恢复生长。实验证明，在实验证明，在-196的超低温条件下细胞的超低温条件下细胞系的生活力和高产特性可以长期保存下去。系的生活力和高产特性可以长期保存下去。798020世纪世纪70年代以来年代以来,植物资源超低温保植物资源超低温保存研究取得了很大的进展存研究取得了很大的进展,为农业作物品种为农业作物品种改良、快速繁殖及脱毒等奠定了基础。国内改良、快速繁殖及脱毒等奠定了基础。国内应用超低温保存技术

47、研究的植物品种超过应用超低温保存技术研究的植物品种超过200种种,但至今还未建立起专有物种的种质资但至今还未建立起专有物种的种质资源库源库,缺乏植物材料的中长期保存研究及遗缺乏植物材料的中长期保存研究及遗传稳定性研究。传稳定性研究。81超低温保存是一个非常复杂的过程，超低温保存是一个非常复杂的过程，不同的植物，同一植物的不同材料类型，不同的植物，同一植物的不同材料类型，其保存的难易和效果都不相同。因此，在其保存的难易和效果都不相同。因此，在进行保存试验时，一定要根据材料本身的进行保存试验时，一定要根据材料本身的特性，对影响保存的因素进行研究，确定特性，对影响保存的因素进行研究，确定提高超低温保存成活率和再生率的有效途提高超低温保存成活率和再生率的有效途径和方法，达到成功保存种质资源的目的。径和方法，达到成功保存种质资源的目的。END！82