常用分子生物学技术的原理及其应用YiLiao教学文稿.ppt

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1、目录目录常用分子生物学技常用分子生物学技术的原理及其的原理及其应用用YiLiaoYiLiao目录目录第一节分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization and Blotting Technique目录目录DNA的变性与复性A=T CGDNA变性（DNA denaturation）：某些理化因素（温度、pH、离子强度等）会导致DNA双链互补碱基对之间的氢键发生断裂，使DNA双链解离为单链。DNA复性（DNA renaturation）：当变性条件缓慢去除后，两条解离的互补链可重新互补配对，恢复原来的双螺旋结构。n核酸分子杂交(nucleic acid hybridizatio

2、n)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。一、分子杂交与印迹技术的原理复性复性RNADNA（一）印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”（probe），探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分

3、子存在。（二）探针技术Biotin-labeled probe二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹(Southern blotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。、重组质粒和噬菌体的分析。（二）RNA印迹(Northern blotting)用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹(Western blotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。原理结果工具三种印迹技术的比较n其他：斑点印迹(dot blotting)原位杂交(in situ hybridization)DNA点阵(DNA array)DNA芯片技术(DNA chip)放放射射自自显显影影

4、照照片片DNA芯片芯片技术技术目录目录第二节PCR技术的原理与应用The Principle and Application of PCR Technology5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA一、PCR技术的工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。目录目录PCR技术原理示意图 n PCR的基本反应步骤变性变性95C95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C模板DNA特异性引物耐热

5、DNA聚合酶dNTPsMg2+n PCR体系基本组成成分目录目录Taq酶指标普通Taq酶ReliaTM热启动Taq酶FussionTM高保真聚合酶LonEZTM长片段高保真聚合酶通用标准错配率错配率错配率错配率错配率（相对）210-4-10-510-610-710-7校正功能无无有有热启动否是否否目标片段长度6kb(简单模板)10kb(简单模板)20kb（简单模板）15kb(复杂模板)35kb（简单模板）18kb(复杂模板)延伸时间（推荐）2kb/min1.5kb/min1.5-2kb/min1.5-2kb/min优势扩增速度快高特异性高灵敏度高效率扩增保真度为pfu的2倍速度快，5kb延伸只

6、需25s适用于粗提取样品扩增专门针对10-35kb的模板进行扩增具有高保真性缺点扩增特异性差，非特异性产物较多扩增保真度稍低于FussionTM无热启动的功能，操作要在低温下进行无热启动的功能，操作要在低温下进行应用常规PCR常规PCR荧光定量PCRDNA测序TA克隆应用于保真性要求高的方面：基因筛选、分子诊断、克隆表达、突变检测能够35kb的目标片段，其他酶无此扩增功能，且具备保真性利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段,或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段；利用随机引物从

7、cDNA文库或基因组文库中克隆基因。二、PCR技术的主要用途（一）目的基因的克隆利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。（三）DNA和RNA的微量分析（二）基因突变将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。（四）DNA序列测定（五）基因突变分析目录目录逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PC

8、R)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。（一）逆转录PCR技术三、几种重要的PCR衍生技术目录目录原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。（二）原位PCR技术目录目录（三）实时PCR技术实时PCR(real-time PCR)技术通过动态监测反应过程中

9、的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。背景对数增长期平台期n实时PCR技术原理QR3355上游引物下游引物荧光标记引物RQ 3355n实时PCR分类：实时PRC非探针类探针类1.TaqMan探针法 2.分子信标探针法 3.FRET探针法 SYBR Green图20-3 TaqMan探针法实时PCR原理示意图目录目录第三节基因文库Gene Library基因组DNA文库(genomic DNA library)cDNA文库(cDNA library)n基因文库(gene library)是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。一、基因组DNA文库基因组DNA文库

10、是指生物的基因组DNA的信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。用于构建基因组文库的载体有 噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。Vector TypeInsert size(thousands of bases)PlasmidsUp to 15Phage lambda()Up to 25CosmidsUp to 45Bacteriophage P170 to 100P1 artificial chromosome(PACs)130 to 150Bacterial artificial chromosome(BACs)120 to 300Yeast artificial c

11、hromosome(YACs)250 to 2000n基因组文库和cDNA文库的构建和筛选lDigest the DNA with a restriction enzyme.This creates fragments that are similar in size,each containing one or more genes.lInsert the fragments of DNA into vectors that were cut with the same restriction enzyme.Use the enzyme DNA ligase to seal the DNA

12、fragments into the vector.This creates a large pool of recombinant molecules.lThese recombinant molecules are taken up by a host bacterium by transformation,creating a DNA library.第一轮筛选第二轮筛选第三轮筛选n基因组文库筛选结果举例cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。二、cDNA文库目录目录第四节

13、生物芯片技术Biological Chip Technique是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列(DNA microarray)。一、基因芯片n基因芯片(gene chip)n基因芯片工作流程示意图是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片蛋白质分子间的亲

14、和反应n蛋白质芯片(protein chip)n蛋白质芯片作用原理目录目录第五节生物大分子相互作用研究技术 The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study一、蛋白质相互作用研究技术酵母双杂交各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选n常用蛋白质相互作用的研究技术标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白

15、相结合的未知分子。标签融合蛋白沉淀实验流程示意图（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途n酵母双杂交系统的应用证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为“诱饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的“猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。电泳迁移率变动测定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验(gel shift assay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和

16、定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定放射自显影未结合探针结合有蛋白的探针标记探针1X1X1X1X核蛋白提取物1X10X10X未标记探针10Xn凝胶迁移实验结果示意图染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。（二）染色质免疫沉淀法n染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图SummaryiTRAQ目录目录此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢