《蛋白质的分离纯化》PPT课件.ppt

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1、蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化uu 蛋白质的两性电离蛋白质的两性电离蛋白质的两性电离蛋白质的两性电离 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pHpHpHpH条件下都条件下都条件下都条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。可解离成带负电荷或正电荷的基团。可解离成带负电荷或正电荷的基团。可解离成带负电荷或正电荷的基团。u 蛋白质的等电

2、点蛋白质的等电点蛋白质的等电点蛋白质的等电点(isoelectricisoelectricisoelectricisoelectric point,point,point,point,pIpIpIpI)当当当当蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质溶溶溶溶液液液液处处处处于于于于某某某某一一一一pHpHpHpH时时时时，蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质解解解解离离离离成成成成正正正正、负负负负离离离离子子子子的的的的趋趋趋趋势势势势相相相相等等等等，即即即即成成成成为为为为兼兼兼兼性性性性离离离离子子子子，净净净净电电电电荷为零，此时溶液的荷为零，此时溶液的荷为零，此时溶液的荷为零，此时溶液的pHpHpHpH称为蛋

3、白质的等电点。称为蛋白质的等电点。称为蛋白质的等电点。称为蛋白质的等电点。u 蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质属属属属于于于于生生生生物物物物大大大大分分分分子子子子之之之之一一一一，分分分分子子子子量量量量可可可可自自自自1 1 1 1万万万万至至至至100100100100万万万万之之之之巨巨巨巨，其其其其分分分分子子子子的的的的直直直直径径径径可可可可达达达达1 1 1 1100nm100nm100nm100nm，为胶粒范围之内。，为胶粒范围之内。，为胶粒范围之内。，为胶粒范围之内。*蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因

4、素颗粒表面电荷颗粒表面电荷颗粒表面电荷颗粒表面电荷水化膜水化膜水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉u蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收 由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在和色氨酸，

5、因此在和色氨酸，因此在和色氨酸，因此在280nm280nm波长处有特征性吸收波长处有特征性吸收波长处有特征性吸收波长处有特征性吸收峰。蛋白质的峰。蛋白质的峰。蛋白质的峰。蛋白质的ODOD280280与其浓度呈正比关系，因此与其浓度呈正比关系，因此与其浓度呈正比关系，因此与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。可作蛋白质定量测定。可作蛋白质定量测定。可作蛋白质定量测定。蛋白质的分离纯化方法蛋白质的分离纯化方法uu透析透析透析透析(dialysis)(dialysis)利用透析袋把大利用透析袋把大利用透析袋把大利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化分子蛋白质与小分子化分子蛋白质与小分子化分子蛋白质

6、与小分子化合物分开的方法。合物分开的方法。合物分开的方法。合物分开的方法。u 丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀*丙丙丙丙酮酮酮酮沉沉沉沉淀淀淀淀:低低低低温温温温进进进进行行行行，丙丙丙丙酮酮酮酮用用用用量量量量一一一一般般般般10101010倍倍倍倍于于于于蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质溶溶溶溶液液液液体体体体积积积积。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质被被被被丙丙丙丙酮酮酮酮沉沉沉沉淀淀淀淀后后后后，应应应应立立立立即即即即分分分分离离离离。除除除除了了了了丙丙丙丙酮酮酮酮以以以以外外外外，也也也也可可可可用用用用乙醇沉淀。乙醇沉淀。乙醇沉淀。乙醇沉淀。*盐盐盐盐析析析析(salt(sal

7、t(salt(salt precipitation)precipitation)precipitation)precipitation)：将将将将硫硫硫硫酸酸酸酸铵铵铵铵、硫硫硫硫酸酸酸酸钠钠钠钠或或或或氯氯氯氯化化化化钠钠钠钠等等等等加加加加入入入入蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质溶溶溶溶液液液液，使使使使蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质表表表表面面面面电电电电荷荷荷荷被被被被中中中中和和和和以以以以及及及及水水水水化化化化膜膜膜膜被被被被破坏，导致蛋白质沉淀。破坏，导致蛋白质沉淀。破坏，导致蛋白质沉淀。破坏，导致蛋白质沉淀。*免疫沉淀法：免疫沉淀法：免疫沉淀法：免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗

8、将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗 该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原 蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质 混合溶液中分离获得抗原蛋白。混合溶液中分离获得抗原蛋白。混合溶液中分离获得抗原蛋白。混合溶液中分离获得抗原蛋白。u 电电 泳泳 蛋白质在高于或低于

9、其蛋白质在高于或低于其pI的溶液中的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳称为电泳(elctrophoresis)。几种重要的蛋白质电泳几种重要的蛋白质电泳SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel SDS-polyacrylamide gel electrophoresiselectrophoresis，SDS-SDS-PAGEPAGE）

10、：）：）：）：常用于蛋白质分常用于蛋白质分常用于蛋白质分常用于蛋白质分 子量的测子量的测子量的测子量的测定。定。定。定。等电聚焦电泳等电聚焦电泳（isoelectric focusing，IEF）通过蛋白质等电点通过蛋白质等电点通过蛋白质等电点通过蛋白质等电点的差异而分的差异而分的差异而分的差异而分 离蛋白质离蛋白质离蛋白质离蛋白质的电泳方法。的电泳方法。的电泳方法。的电泳方法。pHpH梯度梯度梯度梯度以两性电解质以两性电解质以两性电解质以两性电解质ampholyteampholyte（脂肪族多（脂肪族多（脂肪族多（脂肪族多胺和多羧同系物）在外胺和多羧同系物）在外胺和多羧同系物）在外胺和多羧同

11、系物）在外电场作用下自然形成。电场作用下自然形成。电场作用下自然形成。电场作用下自然形成。双向凝胶电泳双向凝胶电泳two-dimensional electrophoresistwo-dimensional electrophoresis u 层析层析(chromatography)原理原理 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以

12、不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。层析的主要设备层析的主要设备常见色谱柱常见色谱柱自动分步收集器自动分步收集器离子交换层析离子交换层析ion exchange chromatography 离子交换层析法是利用各蛋白质的电荷量及离子交换层析法是利用各蛋白质的电荷量及离子交换层析法是利用各蛋白质的电荷量及离子交换层析法是利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。电荷不同的蛋白质，对管柱性质不同进行分离。电荷不同的蛋白质，对管柱性质不同进行分离。电荷不同的蛋白质，对管柱性质不同进行分离。电荷不同的蛋白质，对管柱上的离子交换剂有不同的亲和力，改变冲洗液的上

13、的离子交换剂有不同的亲和力，改变冲洗液的上的离子交换剂有不同的亲和力，改变冲洗液的上的离子交换剂有不同的亲和力，改变冲洗液的离子强度和离子强度和离子强度和离子强度和pHpH值，物质就能依次从层析柱中分值，物质就能依次从层析柱中分值，物质就能依次从层析柱中分值，物质就能依次从层析柱中分离出来。离出来。离出来。离出来。离子交换层析法大致分为离子交换层析法大致分为5个步骤个步骤n n离子扩散到树脂表面离子扩散到树脂表面离子扩散到树脂表面离子扩散到树脂表面 n n离子通过树脂扩散到交换位置离子通过树脂扩散到交换位置离子通过树脂扩散到交换位置离子通过树脂扩散到交换位置 n n在交换位置进行离子交换；被交

14、换的分子所带在交换位置进行离子交换；被交换的分子所带在交换位置进行离子交换；被交换的分子所带在交换位置进行离子交换；被交换的分子所带 电荷愈多，它与树脂的结合愈紧密，也就愈不电荷愈多，它与树脂的结合愈紧密，也就愈不电荷愈多，它与树脂的结合愈紧密，也就愈不电荷愈多，它与树脂的结合愈紧密，也就愈不 容易被其它离子取代容易被其它离子取代容易被其它离子取代容易被其它离子取代 n n 被交换的离子扩散到树脂表面被交换的离子扩散到树脂表面被交换的离子扩散到树脂表面被交换的离子扩散到树脂表面 n n 冲洗液通过，被交换的离子扩散到外部溶液中冲洗液通过，被交换的离子扩散到外部溶液中冲洗液通过，被交换的离子扩散

15、到外部溶液中冲洗液通过，被交换的离子扩散到外部溶液中 离子交换层析的原理离子交换层析的原理凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)凝胶过滤色谱亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛，凝胶过滤色谱亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛，凝胶过滤色谱亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛，凝胶过滤色谱亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。凝凝凝凝胶胶胶胶色色色色谱谱谱谱的的的的机机机机理理理理是是是是分分分分子子子子筛筛筛筛效效效

16、效应应应应，凝凝凝凝胶胶胶胶颗颗颗颗粒粒粒粒在在在在合合合合适适适适的的的的溶溶溶溶剂剂剂剂中中中中浸浸浸浸泡泡泡泡，充充充充分分分分吸吸吸吸胀胀胀胀后后后后装装装装入入入入色色色色谱谱谱谱柱柱柱柱内内内内，加加加加入入入入欲欲欲欲分分分分离离离离的的的的混混混混合合合合物物物物后后后后，再再再再以以以以同同同同一一一一溶溶溶溶剂剂剂剂洗洗洗洗脱脱脱脱。在在在在洗洗洗洗脱脱脱脱过过过过程程程程中中中中，大大大大分分分分子子子子不不不不能能能能进进进进入入入入凝凝凝凝胶胶胶胶内内内内部部部部，而而而而沿沿沿沿凝凝凝凝胶胶胶胶颗颗颗颗粒粒粒粒间间间间的的的的空空空空隙隙隙隙最最最最先先先先流流流流

17、出出出出柱柱柱柱外外外外；而而而而小小小小分分分分子子子子可可可可以以以以进进进进入入入入凝凝凝凝胶胶胶胶颗颗颗颗粒粒粒粒内内内内部部部部的的的的多多多多孔孔孔孔网网网网状状状状结结结结构构构构，路路路路径径径径长长长长、流流流流速速速速慢慢慢慢，以以以以至至至至最最最最后后后后流流流流出出出出柱柱柱柱外外外外。因因因因此此此此，混混混混合合合合样样样样品品品品如如如如同同同同“过过过过筛筛筛筛”一一一一样样样样，因分子大小的不同得以彼此分开。因分子大小的不同得以彼此分开。因分子大小的不同得以彼此分开。因分子大小的不同得以彼此分开。凝胶过滤的作用机制凝胶过滤的作用机制 凝胶过滤的过程凝胶过滤的过程u 超速离心超速离心 超速离心法超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。测定蛋白质的分子量。高速：高速：25000rpm超速：超速：50000-120000rpmCsCl密度剃度离心密度剃度离心蔗糖密度剃度离心蔗糖密度剃度离心