石蜡切片技术原理.pptx

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1、一、实验原理一、实验原理 显微标本的制作技术是组织学，胚胎学，生理学显微标本的制作技术是组织学，胚胎学，生理学及细胞学等学科研究观察细胞、组织的生理、病理形态及细胞学等学科研究观察细胞、组织的生理、病理形态变化的一种主要方法。大多数的生物材料，在自然状态变化的一种主要方法。大多数的生物材料，在自然状态下是不适合显微观察的，也无法看到其内部结构。因为下是不适合显微观察的，也无法看到其内部结构。因为材料较厚，光线不易透过，以致不易看清其结构，另外材料较厚，光线不易透过，以致不易看清其结构，另外细胞内的各个结构，由于其折射率相差很小，即使光线细胞内的各个结构，由于其折射率相差很小，即使光线可透过，也

2、难以辩明。但在经过固定，脱水，透明，包可透过，也难以辩明。但在经过固定，脱水，透明，包埋等手续后就可把材料切成较薄的片子，再用不同的染埋等手续后就可把材料切成较薄的片子，再用不同的染色方法就可以显示不同细胞组织的形态及其中某些化学色方法就可以显示不同细胞组织的形态及其中某些化学成份含量的变化，就可以在显微镜下清楚的看到其中不成份含量的变化，就可以在显微镜下清楚的看到其中不同的区域组分状态，切片也便于保存，所以是教学和科同的区域组分状态，切片也便于保存，所以是教学和科研中常用的方法。研中常用的方法。第1页/共40页二、实验方法二、实验方法 生物显微制片有许多不同的方法，一般可分为生物显微制片有许

3、多不同的方法，一般可分为非切片法与切片法两大类：非切片法与切片法两大类：非切片法有涂片、铺片、压片、磨片、整装片非切片法有涂片、铺片、压片、磨片、整装片等。等。切片法又包括石蜡切片法、火棉胶切片法、冰切片法又包括石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法等。冻切片法等。显微制片技术虽是生物学中很基本的操作技术，显微制片技术虽是生物学中很基本的操作技术，但由于生物材料的个体差异，化学试剂的多样性，但由于生物材料的个体差异，化学试剂的多样性，因此操作技术相当细致而复杂，方法也很多，每一因此操作技术相当细致而复杂，方法也很多，每一步骤的失误都可导致整体的失败，因此需要耐心细步骤的失误都可导致整体的失败，因

4、此需要耐心细致，不断总结经验，才能得到较好的结果。致，不断总结经验，才能得到较好的结果。第2页/共40页 即不用切片机，不经切片手续而制成切片的方法，即不用切片机，不经切片手续而制成切片的方法，根据材料性质的不同，有不同的处理方法，该类方法操根据材料性质的不同，有不同的处理方法，该类方法操作简单快捷，其中铺片法，封藏法可使原有组织结构不作简单快捷，其中铺片法，封藏法可使原有组织结构不被破坏，涂片法，压片法弥补了用包埋，切片法所不可被破坏，涂片法，压片法弥补了用包埋，切片法所不可能观察清楚的不足，因此是显微标本制备的中常用的手能观察清楚的不足，因此是显微标本制备的中常用的手段。段。1.1 1.1

5、 涂片法涂片法 主要用于血液、精液、尿液、痰液、微生物等不能主要用于血液、精液、尿液、痰液、微生物等不能切片成薄片的液态颗粒性材料，可在载玻片上涂成单层切片成薄片的液态颗粒性材料，可在载玻片上涂成单层细胞，再经固定，脱水，染色等手段制成永久标本。细胞，再经固定，脱水，染色等手段制成永久标本。1 1、非切片法、非切片法第3页/共40页1.2 1.2 铺片法铺片法 主要用于动、植物组织的表皮层观察，主要用于动、植物组织的表皮层观察，可活体取待观察动、植物组织，用尖镊子撕可活体取待观察动、植物组织，用尖镊子撕去一层表皮，迅速平铺在载玻片上。去一层表皮，迅速平铺在载玻片上。如如:洋洋葱表皮细胞的铺片制

6、备。葱表皮细胞的铺片制备。1.3 1.3 压片法压片法 一些较幼嫩，柔软的材料可将其置载玻一些较幼嫩，柔软的材料可将其置载玻片上，用小解剖刀将其分散，加染料一滴，片上，用小解剖刀将其分散，加染料一滴，再盖上盖玻片，用拇指垂直用力挤压，使组再盖上盖玻片，用拇指垂直用力挤压，使组织散成一薄片，再进行观察，如植物根尖观织散成一薄片，再进行观察，如植物根尖观察染色体，花粉粒观察发育阶段等。察染色体，花粉粒观察发育阶段等。第4页/共40页1.4 1.4 离析法离析法 该方法是利用化学试剂使组织的细胞间该方法是利用化学试剂使组织的细胞间质溶解，使细胞能分散成单个个体。经染色，质溶解，使细胞能分散成单个个体

7、。经染色，脱水，透明即可观察其个体形态，适用于肌脱水，透明即可观察其个体形态，适用于肌肉，叶片，茎等部位。肉，叶片，茎等部位。1.5 1.5 磨片磨片(Ground section)Ground section)用于很坚硬的组织，如骨和牙。用于很坚硬的组织，如骨和牙。第5页/共40页2 2、切片法、切片法 切片法是必须依靠手或切片机将组织切成切片法是必须依靠手或切片机将组织切成薄片来进行观察的方法，为了能清晰地观察到薄片来进行观察的方法，为了能清晰地观察到动、植物的组织结构及细胞形态，必须先经过动、植物的组织结构及细胞形态，必须先经过一系列步骤将组织内渗入某些支持物质，使组一系列步骤将组织内渗

8、入某些支持物质，使组织变硬以利于切成薄片，根据所用支持剂的种织变硬以利于切成薄片，根据所用支持剂的种类不同，可分为徒手切片法，石蜡切片法，火类不同，可分为徒手切片法，石蜡切片法，火棉胶切法，冰冻切片法等类型，切成薄片后还棉胶切法，冰冻切片法等类型，切成薄片后还需要去蜡，染色，脱水，透明等步骤，将其制需要去蜡，染色，脱水，透明等步骤，将其制成永久标本。成永久标本。下下边边以以石石蜡蜡切切片片为为例例，介介绍绍显显微微标标本本的的制制备方法。备方法。第6页/共40页2.1 2.1 取材取材 根据不同的实验目的，选择相应的材料，根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要求新鲜、准确、完整，材料要避免

9、挤材料要求新鲜、准确、完整，材料要避免挤压、挫伤、干枯。压、挫伤、干枯。所采集材料应立即放入固定剂，并编号，所采集材料应立即放入固定剂，并编号，注明采集时间、地点、名称、组织部位，所注明采集时间、地点、名称、组织部位，所取组织块要大小适当，即要能说明问题，又取组织块要大小适当，即要能说明问题，又要考虑固定剂的穿透能力。要考虑固定剂的穿透能力。一般组织学取材稍大，细胞学取材稍小，一般组织学取材稍大，细胞学取材稍小，植物组织取材稍小，动物组织取材要稍大。植物组织取材稍小，动物组织取材要稍大。第7页/共40页2.1.12.1.1动物的麻醉和杀死动物的麻醉和杀死 从活的动物体上采取材料不象采集植物从活

10、的动物体上采取材料不象采集植物材料那么容易，因为在不施加麻醉的情况下，材料那么容易，因为在不施加麻醉的情况下，有的动物会收缩有的动物会收缩(如蚯蚓、水蛭如蚯蚓、水蛭)，有的会骚，有的会骚动动(如蛙、鼠如蛙、鼠)，使我们无法下手。但制片所，使我们无法下手。但制片所需的材料又要求越新鲜越好，尤其是细胞学需的材料又要求越新鲜越好，尤其是细胞学方面的研究对材料的新鲜程度要求更严。因方面的研究对材料的新鲜程度要求更严。因此，要割取生活着的动物组织，在一般情况此，要割取生活着的动物组织，在一般情况下，就要对动物施行麻醉，然后再割取材料下，就要对动物施行麻醉，然后再割取材料加以固定。但是，所用的麻醉药品，必

11、须以加以固定。但是，所用的麻醉药品，必须以不影响细胞结构为原则。不影响细胞结构为原则。第8页/共40页 若是一般的组织学制片，要求不太严格的若是一般的组织学制片，要求不太严格的话则可将动物先杀死然后速取其组织进行固话则可将动物先杀死然后速取其组织进行固定。蛙、蟾蜍、鼠等较小的动物，可用断头定。蛙、蟾蜍、鼠等较小的动物，可用断头法杀死，即用普通剪刀剪断颈部。较大的动法杀死，即用普通剪刀剪断颈部。较大的动物，如大竺鼠、免、猫等可用木槌猛击头后物，如大竺鼠、免、猫等可用木槌猛击头后部，使其昏倒，或用部，使其昏倒，或用5050m1m1的注射器从耳静脉的注射器从耳静脉向心脏注入空气，使动物发生急性空气栓

12、塞向心脏注入空气，使动物发生急性空气栓塞痉挛而死。痉挛而死。第9页/共40页 上述动物若需麻醉后取材，则可用脱脂上述动物若需麻醉后取材，则可用脱脂棉球蘸氯仿或乙醚、置于动物的鼻尖部，令棉球蘸氯仿或乙醚、置于动物的鼻尖部，令其吸入麻醉。大动物其吸入麻醉。大动物(狗、猴等狗、猴等)应用氨基甲应用氨基甲酸乙酯作静脉注射麻醉剂量一般为每酸乙酯作静脉注射麻醉剂量一般为每kgkg动动物体重用物体重用1 1 g g。麻醉后的动物也需放血后进行麻醉后的动物也需放血后进行取材固定。取材固定。昆虫等小动物可投入充满氯仿或乙醚蒸昆虫等小动物可投入充满氯仿或乙醚蒸气的大口瓶中，令其麻醉。若要杀死，可将气的大口瓶中，令

13、其麻醉。若要杀死，可将其投入含氰化钾的毒瓶中。其投入含氰化钾的毒瓶中。第10页/共40页 2.1.2 2.1.2动物组织块的切割动物组织块的切割 割取动物组织块时，需注意以下几点：割取动物组织块时，需注意以下几点：第一，要考虑所取的材料应包括各脏器的第一，要考虑所取的材料应包括各脏器的重要结构或全部结构，如消化管就应包括粘膜、重要结构或全部结构，如消化管就应包括粘膜、粘膜下层、肌层和外膜四层结构。若所取的器粘膜下层、肌层和外膜四层结构。若所取的器官太大，不易全部制片时，则可切取能代表该官太大，不易全部制片时，则可切取能代表该器官的部分材料，如狗的肾脏，可切取包括皮器官的部分材料，如狗的肾脏，可

14、切取包括皮质、髓质和肾盂的一部分为材料。质、髓质和肾盂的一部分为材料。第二，应注意切割方向如在管状器官第二，应注意切割方向如在管状器官(肠等肠等)取材时，一般是取其横切面制片，但要取材时，一般是取其横切面制片，但要观察小肠的环行皱壁时，就应取其纵切面制片。观察小肠的环行皱壁时，就应取其纵切面制片。第11页/共40页 第三，组织块必须切得小而薄。细胞学制第三，组织块必须切得小而薄。细胞学制片的组织块不能超过片的组织块不能超过2 2mmmm，一般组织块的大小一般组织块的大小以以0.5*0.5*0.5*0.5*0.2cm0.2cm为宜，柔软组织不易切小为宜，柔软组织不易切小,可先取稍大的组织块固定可

15、先取稍大的组织块固定2-32-3h h。等组织稍等组织稍硬后再切成薄的小块继续固定。硬后再切成薄的小块继续固定。第12页/共40页2.2固定固定 割取组织块后，应立即进行固定。割取组织块后，应立即进行固定。固定是制片极为关键的一个步骤，制片质量固定是制片极为关键的一个步骤，制片质量的优劣。除与材料的新鲜程度有关外，还取决于的优劣。除与材料的新鲜程度有关外，还取决于最初的固定是否适当和完全。最初的固定是否适当和完全。2.2.1 2.2.1固定的意义固定的意义 新鲜的组织被割取后新鲜的组织被割取后,由于细胞内酶的作用和由于细胞内酶的作用和细菌的繁殖，可引起组织的自溶和腐败。因此，细菌的繁殖，可引起

16、组织的自溶和腐败。因此，割取组织块后，应立即采用一割取组织块后，应立即采用一 种方法将组织尽种方法将组织尽可能保持原有的形态结构，且有利于保存和适于可能保持原有的形态结构，且有利于保存和适于制片的操作，这一步骤称为固定。制片的操作，这一步骤称为固定。第13页/共40页固定的目的和作用在于：固定的目的和作用在于：防止组织自溶和腐败；防止组织自溶和腐败；使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀保存下来从而保存细胞的各种组成成分使其淀保存下来从而保存细胞的各种组成成分使其保持与生活时相近似的形态和结构；保持与生活时相近似的形态和结构；因沉淀及凝固的关系，使细胞内

17、不同的成分因沉淀及凝固的关系，使细胞内不同的成分产生不同的折光率，造成光学上的差别使原来产生不同的折光率，造成光学上的差别使原来在生活情况下看不清楚的结构变得清晰易见，在生活情况下看不清楚的结构变得清晰易见，且有的固定剂还有助染作用且有的固定剂还有助染作用(如醋酸、苦味酸如醋酸、苦味酸)，从而使细胞各部易于染色；，从而使细胞各部易于染色；固定剂还兼有硬化作用，使柔软组织硬化而固定剂还兼有硬化作用，使柔软组织硬化而不易变形，有利于操作。不易变形，有利于操作。第14页/共40页2.2.22.2.2固定的方法固定的方法 固定有物理方法和化学方法两种。固定有物理方法和化学方法两种。物理方法固定有干燥、

18、高热和低温骡冷物理方法固定有干燥、高热和低温骡冷等。例如，血液涂片就是干燥固定；细菌涂等。例如，血液涂片就是干燥固定；细菌涂片可用加热法固定；许多组织化学反应的制片可用加热法固定；许多组织化学反应的制片是以低温骡冷固定作冰冻切片的。片是以低温骡冷固定作冰冻切片的。化学方法固定就是用化学试剂配制成固化学方法固定就是用化学试剂配制成固定液使之固定。定液使之固定。第15页/共40页2.2.32.2.3固定液的选择固定液的选择 固定液的种类很多。可分为两大类：简固定液的种类很多。可分为两大类：简单固定液和混合固定液。单固定液和混合固定液。简单固定液又称单纯固定液，就是用一简单固定液又称单纯固定液，就是

19、用一种化学试剂作为固定液，如乙醇、甲醛溶液、种化学试剂作为固定液，如乙醇、甲醛溶液、冰醋酸等冰醋酸等,它们只是对细胞的某种成分固定得它们只是对细胞的某种成分固定得较好；不能将细胞所有的成分都保存下来。较好；不能将细胞所有的成分都保存下来。如升汞固定蛋白质、冰醋酸固定核蛋白、无如升汞固定蛋白质、冰醋酸固定核蛋白、无水乙醇可固定糖原等，单纯固定液是有局限水乙醇可固定糖原等，单纯固定液是有局限性的。性的。混合固定液就是用几种化学药品，按一混合固定液就是用几种化学药品，按一定的比例混合配制而成的，由于各种药品的定的比例混合配制而成的，由于各种药品的优缺点互相弥补，因此可产生较好的效果。优缺点互相弥补，

20、因此可产生较好的效果。第16页/共40页2.2.42.2.4常用的固定液常用的固定液福尔马林福尔马林醋酸醋酸酒精混合固定液（酒精混合固定液（FAAFAA液）液）是植物制片技术中较为良好的固定液和是植物制片技术中较为良好的固定液和保存液。除单细胞和丝状藻类外，均可用此保存液。除单细胞和丝状藻类外，均可用此液固定也通用于昆虫和甲壳类的固定。液固定也通用于昆虫和甲壳类的固定。FAA FAA液配方：液配方：福尔马林福尔马林 5 5m1m1 冰醋酸冰醋酸 5 5m1 m1 50 50或或7070酒精酒精 90 90m1m1第17页/共40页BouinBouin氏液氏液 是常用的良好固定液，广泛应用于一般

21、动是常用的良好固定液，广泛应用于一般动物组织、昆虫组织、无脊椎动物的卵和幼虫，物组织、昆虫组织、无脊椎动物的卵和幼虫，以及胚胎学材料的固定。也适用于裸子植物以及胚胎学材料的固定。也适用于裸子植物的雌配子体和被子植物的胚囊的固定。的雌配子体和被子植物的胚囊的固定。Bouin Bouin氏液配方：氏液配方：苦味酸饱和水溶液苦味酸饱和水溶液 75 75份份 福尔马林福尔马林 25 25份份 冰醋酸冰醋酸 5 5份份 此液穿透迅速而均匀，使组织收缩少，此液穿透迅速而均匀，使组织收缩少，不使组织变硬变脆，着色良好。一般动物组不使组织变硬变脆，着色良好。一般动物组织固定织固定12241224h h，小块组

22、织数小时即可。固定小块组织数小时即可。固定后直接入后直接入7070酒精中洗去黄色，但留一点黄酒精中洗去黄色，但留一点黄色对染色并无妨碍。植物材料的固定时间为色对染色并无妨碍。植物材料的固定时间为12481248h h。第18页/共40页2.2.52.2.5固定的注意事项固定的注意事项 (1)(1)固定的材料越新鲜越好。因此，采集或割固定的材料越新鲜越好。因此，采集或割取后须立即投入预先准备好的固定液中进行取后须立即投入预先准备好的固定液中进行固定，切勿耽误。固定，切勿耽误。(2)(2)材料大小以直径不超过材料大小以直径不超过5 5mmmm为宜，材料与为宜，材料与固定液的比例为固定液的比例为 1

23、:20 1:20。(3)(3)根据材料的性质和制片的目的选择固定液。根据材料的性质和制片的目的选择固定液。(4)(4)所固定的植物材料，若表面有毛茸或其它所固定的植物材料，若表面有毛茸或其它不易穿透的物质，则可用含有酒精的固定液不易穿透的物质，则可用含有酒精的固定液固定。固定。(5)(5)含有气泡的材料投入团定液后，材料不会含有气泡的材料投入团定液后，材料不会下沉，故须将气泡抽出使材料下沉。最简易下沉，故须将气泡抽出使材料下沉。最简易的抽气方法是将材料和固定液一并例入的抽气方法是将材料和固定液一并例入1010mlml的注射器中，抽动几次。也小用抽气装置进的注射器中，抽动几次。也小用抽气装置进行

24、抽气。行抽气。第19页/共40页(6)(6)固定时，要防止材料变形。固定时，要防止材料变形。(7)(7)外有被膜，而内部站构又极易松散的器官，外有被膜，而内部站构又极易松散的器官，应将整个器官投入固定液应将整个器官投入固定液2222h h后，再将其修后，再将其修成小块材料继续则定。成小块材料继续则定。(8)(8)含行粘液、污物或血液的材料需用生理盐含行粘液、污物或血液的材料需用生理盐水洗净后再行固定。水洗净后再行固定。(9)(9)材料投入固定液后须经常摇晃。材料投入固定液后须经常摇晃。(10)(10)容器外需贴标签。容器外需贴标签。第20页/共40页2.3 2.3 脱水脱水 脱水是用一种即能与

25、水又能与透明液混脱水是用一种即能与水又能与透明液混合的液体来逐渐置换样品中游离的水。合的液体来逐渐置换样品中游离的水。现采用的脱水剂一般是丙酮或乙醇来进现采用的脱水剂一般是丙酮或乙醇来进行梯度脱水，脱水的时间，可根据组织的类行梯度脱水，脱水的时间，可根据组织的类型，大小而定。型，大小而定。脱水的过程：一般是脱水的过程：一般是30%30%乙醇乙醇50%50%乙醇乙醇70%70%乙醇乙醇80%90%100%100%80%90%100%100%脱水应逐步而不应跨越太大进行，否则脱水应逐步而不应跨越太大进行，否则将引起组织强烈的收缩或变形，在经无水乙将引起组织强烈的收缩或变形，在经无水乙醇处理时，应保

26、证试剂的纯度。醇处理时，应保证试剂的纯度。第21页/共40页2.4 2.4 透明透明 透明是用一种即能与乙醇又能与包埋介透明是用一种即能与乙醇又能与包埋介质互溶的液体来置换样品中的乙醇，从而为质互溶的液体来置换样品中的乙醇，从而为最终的包埋创造一个有利的条件。最终的包埋创造一个有利的条件。现采用的现采用的透明剂一般是二甲苯，甲苯，氯仿等。透明剂一般是二甲苯，甲苯，氯仿等。其过程为：其过程为：1/3 1/3二甲苯二甲苯+2/3+2/3乙醇混合液乙醇混合液1/21/2二甲苯二甲苯+1/2+1/2乙醇混合液乙醇混合液2/32/3二甲苯二甲苯+1/3+1/3乙醇混合液乙醇混合液二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯

27、 二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，它二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，它具有渗透力强，溶解石蜡量大，又易挥发的具有渗透力强，溶解石蜡量大，又易挥发的优点，其缺点是易使组织收缩，变硬，变脆，优点，其缺点是易使组织收缩，变硬，变脆，因此透明时间应根据组织块大小及质地酌情因此透明时间应根据组织块大小及质地酌情而定。而定。第22页/共40页2.5 2.5 渗蜡渗蜡 将将完完成成透透明明步步骤骤的的组组织织块块浸浸入入透透明明剂剂与与石石蜡蜡混混合合液液中中，不不断断提提高高石石蜡蜡的的比比例例，直直至至用用石石蜡蜡完完全全置置换换了了组组织织块块中中的的透透明明剂剂，便便于于今今后后的的包包理理与与切切

28、片片。石石蜡蜡有有液液态态与与固固态态二二种种，渗渗蜡蜡要要在在恒恒定定温温箱箱（6060c c）中中进进行行，以以保保证证石蜡处于液态中。石蜡处于液态中。第23页/共40页2.6 2.6 包埋包埋 样品经石蜡渗透后，其内部间隙已完全被石蜡样品经石蜡渗透后，其内部间隙已完全被石蜡占据，此时还需要用同种硬度的石蜡包埋成蜡块以占据，此时还需要用同种硬度的石蜡包埋成蜡块以利于后边的切片，包埋可用相同的器具，也可折叠利于后边的切片，包埋可用相同的器具，也可折叠一牛皮纸盒。一牛皮纸盒。将液态石蜡缓缓倒入纸盒中，再用镊子轻轻将将液态石蜡缓缓倒入纸盒中，再用镊子轻轻将浸好蜡的组织块夹入纸盒，摆好位置，待石蜡

29、冷却浸好蜡的组织块夹入纸盒，摆好位置，待石蜡冷却成固态即包埋完毕。成固态即包埋完毕。至此，一块组织已完成前处理过程，可以切片，至此，一块组织已完成前处理过程，可以切片，前边的步骤看来既无高深的理论，又无复杂的技术，前边的步骤看来既无高深的理论，又无复杂的技术，一切看似简单，但一步做不到都会造成整个制片的一切看似简单，但一步做不到都会造成整个制片的前功尽弃。前功尽弃。第24页/共40页我们可以看到：我们可以看到：水和酒精可以相溶。水和酒精可以相溶。酒精和二甲苯相溶。酒精和二甲苯相溶。二甲苯和石蜡可以相溶。二甲苯和石蜡可以相溶。因为以上相邻步骤所使用的液体均可以因为以上相邻步骤所使用的液体均可以互

30、溶，所以保证每一步骤液体能置换完全。互溶，所以保证每一步骤液体能置换完全。水和二甲苯不能相溶，乙醇和石蜡不能水和二甲苯不能相溶，乙醇和石蜡不能相溶，所以如果有一个步骤的处理不彻底，相溶，所以如果有一个步骤的处理不彻底，残留的液体带到下一个步骤将不能互溶，最残留的液体带到下一个步骤将不能互溶，最终带到渗蜡步骤中，成为细小的空洞，以至终带到渗蜡步骤中，成为细小的空洞，以至不能成为质地致密的石蜡块，也就切不成良不能成为质地致密的石蜡块，也就切不成良好的切片。好的切片。第25页/共40页2.7 2.7 切片切片修块：修块：切片前需修整蜡块，即将包埋好的一大块蜡切片前需修整蜡块，即将包埋好的一大块蜡块切

31、开，使每一小块都含有一块组织，从切面看组块切开，使每一小块都含有一块组织，从切面看组织周围的石蜡相等。织周围的石蜡相等。固着：将修好的蜡块粘在大小适宜的样品台上，以便固着：将修好的蜡块粘在大小适宜的样品台上，以便于固定在切片机上。于固定在切片机上。切片：一手持毛笔，一手转动切片机，切片的蜡片连切片：一手持毛笔，一手转动切片机，切片的蜡片连成一长条蜡带。切下的蜡带放在一干净黑纸上。成一长条蜡带。切下的蜡带放在一干净黑纸上。贴片：用小刀根据需要切成数段，分别用粘片剂贴在贴片：用小刀根据需要切成数段，分别用粘片剂贴在干净载玻片上。在恒温展片台上展平，烘干。干净载玻片上。在恒温展片台上展平，烘干。第2

32、6页/共40页 2.8.1 2.8.1染料、染色液染料必须具备两个条件：染料、染色液染料必须具备两个条件：要具有颜色要具有颜色 和被染物体之间具有亲和力。和被染物体之间具有亲和力。如果只有颜色而与被染物体之间无亲和力，如果只有颜色而与被染物体之间无亲和力，那只能是颜料或合色物质，而不是染料。染料的那只能是颜料或合色物质，而不是染料。染料的颜色和亲和力都是由分子结构决定的，即由产生颜色和亲和力都是由分子结构决定的，即由产生颜色的发色团和与组织产生亲和力的助色团所决颜色的发色团和与组织产生亲和力的助色团所决定。定。发色团：能使染料分子产生颜色的原子团称发色团：能使染料分子产生颜色的原子团称为发色团

33、，也就是能吸收一定波长的光线并因之为发色团，也就是能吸收一定波长的光线并因之而呈现颜色的化学结构。而呈现颜色的化学结构。助色团：能使染料对织物纤维或组织成分产助色团：能使染料对织物纤维或组织成分产生亲和力的原子团称为助色团，也就是使化合物生亲和力的原子团称为助色团，也就是使化合物具有成盐性质的原子团。具有成盐性质的原子团。2.82.8染色染色第27页/共40页 2.8.2染色剂的分类染色剂的分类 2.8.2.1 2.8.2.1根据来源分根据来源分 (l)(l)天然染色剂天然染色剂 此类染色剂是从动、植物体中提取的，为天此类染色剂是从动、植物体中提取的，为天然产物，产量少。目前常用的有苏木精、洋

34、红、然产物，产量少。目前常用的有苏木精、洋红、地衣红和靛蓝等。其中最常用的为苏木精和洋地衣红和靛蓝等。其中最常用的为苏木精和洋红。红。(2)(2)合成染色剂合成染色剂 全是由芳香环或具有芳香性的杂环化合物所全是由芳香环或具有芳香性的杂环化合物所构成。最早是由煤焦油蒸馏产物合成而得的，构成。最早是由煤焦油蒸馏产物合成而得的，所以又称为煤焦油染料。所以又称为煤焦油染料。除上述两类外，在生物染色中还使用一些无除上述两类外，在生物染色中还使用一些无机化合物，如硝酸银、氯化金、锇酸等。机化合物，如硝酸银、氯化金、锇酸等。第28页/共40页 2.8.2.2 2.8.2.2根据用途分根据用途分 (l)(l)

35、细胞核染色剂细胞核染色剂 用用于于细细胞胞核核的的染染色色剂剂有有天天然然染染色色剂剂的的苏苏木木精精、洋洋红红以以及及合合成成染染色色剂剂中中的的番番红红、结结品品紫紫、硫硫堇堇、甲苯胺蓝、甲基绿、美蓝、孔雀绿和焦油紫等。甲苯胺蓝、甲基绿、美蓝、孔雀绿和焦油紫等。(2)(2)细胞质染色剂细胞质染色剂 用用于于细细胞胞质质的的染染色色剂剂有有合合成成染染色色剂剂中中的的曙曙红红、亮亮绿绿、橘橘黄黄G G、酸酸性性品品红红、苦苦味味酸酸和和水水溶溶性性苯苯胺胺蓝等。蓝等。（3 3）脂质染色剂）脂质染色剂 用于显示脂质的染色剂有合成染色剂中的苏用于显示脂质的染色剂有合成染色剂中的苏丹丹IIIIII

36、、苏丹苏丹IvIv、硫酸尼罗蓝及油红等。硫酸尼罗蓝及油红等。第29页/共40页 2.8.2.3根据染色剂的化学性质分根据染色剂的化学性质分 碱性染色剂、酸性染色剂和中性染色剂。碱性染色剂、酸性染色剂和中性染色剂。碱性、酸性和中性染色剂都是由一种酸和碱性、酸性和中性染色剂都是由一种酸和一种碱所构成的盐类。一种碱所构成的盐类。碱性染色剂和酸性染色剂的主要区别，就碱性染色剂和酸性染色剂的主要区别，就在于染色剂的主要有色部分是阳离子还是阴离在于染色剂的主要有色部分是阳离子还是阴离子。若染色剂电离后，其分子的主要部分成阳子。若染色剂电离后，其分子的主要部分成阳离子为碱性染色剂若电离后，其分子的主要离子为

37、碱性染色剂若电离后，其分子的主要部分为阴离子即为酸性染色剂。部分为阴离子即为酸性染色剂。第30页/共40页 2.8.2 2.8.2染色原理染色原理 有关染色的理论至今是一个并末完全清楚的有关染色的理论至今是一个并末完全清楚的很复杂的问题。目前一般还是从物理和化学的作很复杂的问题。目前一般还是从物理和化学的作用来解释各种组织或细胞的染色现象。用来解释各种组织或细胞的染色现象。2.8.2.1 2.8.2.1染色的物理作用染色的物理作用 此理论认为组织细胞的染色是以物理作用为此理论认为组织细胞的染色是以物理作用为基础的，主要是依靠下列三种物理作用的一种或基础的，主要是依靠下列三种物理作用的一种或全部

38、，使染色剂进入组织或细胞内。全部，使染色剂进入组织或细胞内。(1)(1)毛细管作用及渗透作用毛细管作用及渗透作用 但染色剂与组织但染色剂与组织细胞没有牢固的结合细胞没有牢固的结合 (2)(2)吸收作用吸收作用 又称溶解学说。这种学说认为又称溶解学说。这种学说认为组织细胞所以能被染色，主要是吸收作用所致。组织细胞所以能被染色，主要是吸收作用所致。组织吸收染色剂，作牢固的结合。组织的着色与组织吸收染色剂，作牢固的结合。组织的着色与溶液的颜色相同，但不一定和干燥染色剂的颜色溶液的颜色相同，但不一定和干燥染色剂的颜色相同。相同。第31页/共40页 例如，品红溶液为红色，所染组织也为红例如，品红溶液为红

39、色，所染组织也为红色，而干燥的品红则为绿色。苏丹类染色剂色，而干燥的品红则为绿色。苏丹类染色剂使脂质着色，是一种溶解现象。因为苏丹类使脂质着色，是一种溶解现象。因为苏丹类染色剂在脂质中的溶解度大于在酒精等溶剂染色剂在脂质中的溶解度大于在酒精等溶剂中的溶解度。当苏丹类的酒精溶液与组织细中的溶解度。当苏丹类的酒精溶液与组织细胞中的脂质接触时染色剂就从酒精中溶解到胞中的脂质接触时染色剂就从酒精中溶解到脂质中，从而使其着色。脂质中，从而使其着色。(3)(3)吸附作用吸附作用 吸附作用是固体物质的特性，吸附作用是固体物质的特性，即较大的物体能从周围溶液即较大的物体能从周围溶液(染液染液)中吸附一中吸附一

40、些小颗粒些小颗粒(化合物或离子化合物或离子)到自身的特性。细到自身的特性。细胞中各种蛋白质或胶体有不同的吸附面，因胞中各种蛋白质或胶体有不同的吸附面，因此能选择性地吸收不同的离子，即某种蛋白此能选择性地吸收不同的离子，即某种蛋白质对某种染色剂有吸附作用质对某种染色剂有吸附作用,而对别种染色剂而对别种染色剂无吸附作用，这就可以解释鉴别染色现象。无吸附作用，这就可以解释鉴别染色现象。第32页/共40页 2.8.2.2 2.8.2.2染色的化学作用染色的化学作用 化学作用的主要理论根据化学作用的主要理论根据 是染色剂的性质可是染色剂的性质可分为酸性、碱性和中性染色剂，而动、植物的细分为酸性、碱性和中

41、性染色剂，而动、植物的细胞内胞内般也可区分为酸性般也可区分为酸性(阴离子阴离子)和碱性和碱性(阳离阳离子子)部分。当碱性染色剂溶液中的有色部分成为部分。当碱性染色剂溶液中的有色部分成为阳离子时，就能与细胞的阴离子阳离子时，就能与细胞的阴离子(酸件部分酸件部分)较牢较牢固地结合，当酸性染色剂溶液中的有色部分成为固地结合，当酸性染色剂溶液中的有色部分成为阴离子时，就能与细胞内的阳离子阴离子时，就能与细胞内的阳离子(碱性部分碱性部分)较较牢固地结合。牢固地结合。例如，细胞核，尤其是核内的染色质，主要例如，细胞核，尤其是核内的染色质，主要由核酸组成，是酸性的组成成分故和碱性染色由核酸组成，是酸性的组成

42、成分故和碱性染色剂剂(苏木精苏木精)的亲和力很强，易于着色。细胞质含的亲和力很强，易于着色。细胞质含碱性物质，故和酸性染色剂碱性物质，故和酸性染色剂(曙红曙红)的亲和力很大，的亲和力很大，易于着色。易于着色。第33页/共40页 所以，在苏木精所以，在苏木精曙红曙红(H HE E)染色中，细染色中，细胞核被碱性染色剂苏木精所染，细胞质被酸性染胞核被碱性染色剂苏木精所染，细胞质被酸性染色剂曙红所染。这也就是细胞核是嗜碱性的，细色剂曙红所染。这也就是细胞核是嗜碱性的，细胞质是嗜酸性的。除染色质外，粘液和软骨的基胞质是嗜酸性的。除染色质外，粘液和软骨的基质等都是嗜碱性的，细胞质内含的某些颗粒也为质等都

43、是嗜碱性的，细胞质内含的某些颗粒也为嗜酸性。须注意的是嗜碱性和嗜酸性是相对而不嗜酸性。须注意的是嗜碱性和嗜酸性是相对而不是绝对的，若细胞在碱性染色剂溶液中停留过久，是绝对的，若细胞在碱性染色剂溶液中停留过久，则细胞质也可染上碱性染色剂的颜色。某些细胞则细胞质也可染上碱性染色剂的颜色。某些细胞(如血细胞）具有特殊性质，能和中性染色剂发生如血细胞）具有特殊性质，能和中性染色剂发生亲和力而结合。亲和力而结合。由此可见，细胞各成分的染色强弱是与细胞成由此可见，细胞各成分的染色强弱是与细胞成分及染色剂的性质有密切关系：两者之间的亲和分及染色剂的性质有密切关系：两者之间的亲和力强，染色就深；亲和力弱或无，

44、染色也就浅或力强，染色就深；亲和力弱或无，染色也就浅或无。无。但是，染色的实际情况是极为复杂的，组织细但是，染色的实际情况是极为复杂的，组织细胞的染色作用，还随所用溶液的胞的染色作用，还随所用溶液的pHpH值而变动。值而变动。第34页/共40页2.8.32.8.3染色剂和染色液的配制染色剂和染色液的配制 Deiafield Deiafield氏苏木精氏苏木精 Deiafield Deiafield氏苏木精配方氏苏木精配方 苏木精苏木精 4 4g g 无水酒精无水酒精 25 25m l m l 10 10铵明矾铵明矾(硫酸铝铵硫酸铝铵)水溶液水溶液 400 400m1 m1 配制时先将苏木精溶于

45、无水酒精，待先全溶解后加配制时先将苏木精溶于无水酒精，待先全溶解后加入入1010铵明矾水溶液，充分搅动混合后，注入细口瓶内，铵明矾水溶液，充分搅动混合后，注入细口瓶内，瓶口用纱布封住。然后将瓶置于温暖有光处瓶口用纱布封住。然后将瓶置于温暖有光处3434天后过滤，天后过滤，滤后再加入滤后再加入100 100 m1m1甘油和甘油和100100mlml甲醇，混合均匀后，瓶口甲醇，混合均匀后，瓶口仍用纱布封口，再置于光线充足处仍用纱布封口，再置于光线充足处1212月使之成熟。待颜月使之成熟。待颜色变成紫褐色时即为成熟。成熟后过滤，塞紧瓶口置于阴色变成紫褐色时即为成熟。成熟后过滤，塞紧瓶口置于阴凉处贮存

46、，凉处贮存，可长期保存，多年不坏。此液着色力较强，可长期保存，多年不坏。此液着色力较强，染数分钟即可。也可用染液染数分钟即可。也可用染液l l份加蒸馏水份加蒸馏水3535份稀释后使份稀释后使用，染色时间需延长一至数小时。此液染细胞核及嗜碱颗用，染色时间需延长一至数小时。此液染细胞核及嗜碱颗粒效果良好。染植物细胞的纤维壁比用其它任何染液着色粒效果良好。染植物细胞的纤维壁比用其它任何染液着色更好。更好。第35页/共40页2.8.4 2.8.4 染色染色 切切片片可可用用不不同同方方法法，使使其其干干燥燥，然然后后进进行行染染色色。因因为为每每一一张张载载片片上上粘粘贴贴的的是是蜡蜡带带，因因此此必

47、必须须先先用用二二甲甲苯苯去去除除石石蜡蜡再再用用酒酒精精去去除除二二甲甲苯苯，再再进进入入水水中中，才才能能染染色色，染染色色的的方方法法很很多多，要要根根据据每每张张标标本本要要求求显显示示的的目目的的选选择择不不同同的的染染剂剂，最最常常用用的的是是苏苏木木精精，伊伊红红染染色色（简简称称 HE HE 染染色色）。苏苏木木精精使使细细胞胞核核显显深深紫紫色色，伊伊红红使使细细胞胞质质显显粉粉红红色色，以以此此显显示示清清晰晰的的细细胞胞形形态态和和核核的的大大小小，位位置置，染染色色后后再再根根据据制制片片的的基基本本原原理理，使使带带水水的的载载片片经经历历脱脱水水透透明明步步骤骤最最

48、后后用用树树胶胶封片。封片。第36页/共40页HEHE染色：苏木精（染色：苏木精（HematoxylinHematoxylin）伊红（伊红（EosinEosin）染色染色碱性染料碱性染料将嗜碱性物质（本身酸将嗜碱性物质（本身酸性）染成蓝色性）染成蓝色酸性染料酸性染料将嗜酸性物质（本身碱将嗜酸性物质（本身碱性）染成红色性）染成红色细胞核中的细胞核中的DNADNA、RNARNA细胞质中细胞质中的的RNARNA细胞质、膜性结构（线粒细胞质、膜性结构（线粒体、溶酶体、滑面内质网）体、溶酶体、滑面内质网）第37页/共40页其步骤如下：其步骤如下：二甲苯二甲苯二甲苯二甲苯1/21/2二甲苯二甲苯+1/2+

49、1/2乙醇混乙醇混合液合液100%100%乙醇乙醇95%95%乙醇乙醇85%85%乙醇乙醇70%70%乙醇乙醇50%50%乙醇乙醇30%30%乙醇乙醇苏木精染液苏木精染液0.01%0.01%盐酸盐酸0.01%0.01%氢氧化钠氢氧化钠蒸馏水蒸馏水30%30%乙醇乙醇50%50%乙醇乙醇70%70%乙醇乙醇85%85%乙醇乙醇伊红染液伊红染液95%95%乙醇乙醇100%100%乙醇乙醇100%100%乙醇乙醇1/21/2二甲苯二甲苯+1/2+1/2乙醇混合液乙醇混合液二甲苯二甲苯二二甲苯甲苯封片封片第38页/共40页2.92.9镜检、贴标签、干燥、记录。镜检、贴标签、干燥、记录。第39页/共40页感谢您的观看！第40页/共40页