生物化学实验-电泳.ppt

《生物化学实验-电泳.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物化学实验-电泳.ppt（96页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、生物化学实验-电泳 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望人员组成人员组成n主讲教师：吕晓玲（教授）主讲教师：吕晓玲（教授）刘常金（副教授博士）刘常金（副教授博士）曹东旭（副教授博士）曹东旭（副教授博士）王德培（副教授博士）王德培（副教授博士）白小佳（讲白小佳（讲 师博士）师博士）李昌模（副教授博士）李昌模（副教授博士）张张 燕（副教授博士）燕（副教授博士）方国臻（副教授博士）方国臻（副教授博士）n实验辅助：高实验辅助：高 辉（实验师）辉（实验师）姚秀玲（

2、实验师）姚秀玲（实验师）实验内容安排实验内容安排共共3636学时学时1 1、生物化学实验规则及常用仪器使用入门（、生物化学实验规则及常用仪器使用入门（2 2学时）学时）2 2、离子交换柱层析法分离氨基酸（、离子交换柱层析法分离氨基酸（5 5学时）学时）3 3、3 3，5 5二硝基水杨酸法测定还原糖（二硝基水杨酸法测定还原糖（5 5学时）学时）4 4、多酚氧化酶的制备、性质及其影响因素（、多酚氧化酶的制备、性质及其影响因素（6 6学时）学时）5 5、碱性蛋白酶活力的测定福林酚试剂法（、碱性蛋白酶活力的测定福林酚试剂法（4 4学时）学时）6 6、SDSSDSPAGEPAGE分离蛋白质（分离蛋白质（

3、6 6学时）学时）7 7、植物中核酸的分离与鉴定、植物中核酸的分离与鉴定(5(5学时学时)8 8、BradfordBradford法测定蛋白质的含量（法测定蛋白质的含量（3 3学时）学时）1实验目的实验目的l掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、纯化和测定技术的原理及方法；纯化和测定技术的原理及方法；l掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实验技能验技能；l培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学作风、创新能力等综合素质。作风、创新能力等综合素质。绪论绪论2 通过生物化

4、学实验应该做到通过生物化学实验应该做到l学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。理地安排实验步骤和时间。l训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器。物化学实验仪器。l学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验。行所有的实验。l掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，掌握

5、生物化学的各种基本实验方法和实验技术，尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。科研工作打下坚实的基础。3.1 3.1 实验记录实验记录u实验前写好实验预习报告实验前写好实验预习报告(钢笔和园珠笔钢笔和园珠笔)。u实验中应及时准确地记录实验中应及时准确地记录(专用纸，事先在记录纸上专用纸，事先在记录纸上设计好各种记录格式和表格）所观察到的现象和测量设计好各种记录格式和表格）所观察到的现象和测量的数据。的数据。u实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为“0.050”“0.050”，而不能记成，而不能

6、记成“0.05”“0.05”。每个结果都要尽。每个结果都要尽可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差很大，也都应如实记录，不得涂改。很大，也都应如实记录，不得涂改。u实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、编号、生产厂等；生物材料的来源、试剂的规格、试编号、生产厂等；生物材料的来源、试剂的规格、试剂的浓度等。剂的浓度等。3 3 实验记录与实验报告实验记录与实验报告3 3 实验记录与实验报告实验记录与实验报告3.2 3.2 实验报告实验报告实验报告的格式应为：实验报告的格式应为：实验目的；实验目的

7、；实验原理；实验原理；仪器、材料和试剂；仪器、材料和试剂；实验步骤；实验步骤；结果讨论（含数理据处）；结果讨论（含数理据处）；注意事项注意事项;(7)(7)思考题思考题 注意：实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅一些有注意：实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅一些有关的文献和教科书，充分运用己学过的知识和生物化关的文献和教科书，充分运用己学过的知识和生物化学原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析学原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析和见解，并欢迎对实验提出改进意见。和见解，并欢迎对实验提出改进意见。4 实验成绩评分方法实验成绩评分方法n实验预习情况（实验预习情况（10%10%）n实验

8、操作情况（实验操作情况（20%20%）n实验报告情况（实验报告情况（30%30%）n实验考试成绩（实验考试成绩（40%40%）生物化学实验技术理论生物化学实验技术理论层析技术l1903年，俄国科学家M.C.Jber首创了一种从绿叶中分离多种不同颜色色素成分的方法，命名为色谱法(Chromatography)，由于翻译和习惯的原因又常称为层析法。l80多年来，层析法不断发展，形式多种多样。50年代开始，相继出现了分配层析、离于交换层析、凝胶层析、亲和层析、吸附层析等。l几乎每一种层析法都已发展成为一门独立的生化高技术，在生化领域内得到了广泛的应用。一、层析技术一、层析技术一、层析技术一、层析技术

9、l1、层析技术原理l2、层析技术分类l3、常用层析技术原理1、层析技术原理、层析技术原理l层析原理：是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为固定相，另一相流过此相称作流动相，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。l可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸。2、层析技术分类、层析技术分类名称名称操作方式操作方式固定相固定相流动相流动相分离依据分离依据分配层析分配层析纸层析纸层析薄层层析薄层层析液体液体液体液体溶解度溶解度离子交换层析离子交换层析离子交换柱层析离子交换柱层析固体固体液体液体带电性带电性静电引力静电引力吸附层析吸

10、附层析吸附薄层层析吸附薄层层析气体吸附层析气体吸附层析固体固体固体固体液体液体气体气体吸附力吸附力亲合层析亲合层析酶与底物酶与底物抗原与抗体抗原与抗体固体固体液体液体配体专一性配体专一性凝胶层析凝胶层析 凝胶过滤凝胶过滤固体固体液体液体分子大小分子大小3、常用的层析原理、常用的层析原理l（1）分配层析纸层析l原理：溶质在互不相溶的两相中溶解度不同，在终点时达到一种平衡，其比值为一个常数，即分配系数（）。l 固定相内溶质的浓度 流动相内溶质的浓度 固定相：滤纸上吸附的水 流动相：有机溶剂（正丁醇）=128646432643216484816 8324832 8 4204040 20 4 2123

11、040 30 12 2纸层析纸层析l纸层析是最简单的液一液相分配层析。l滤纸是纸层析的支持物。当支持物被水饱和时，大部分水分子被滤纸的纤维素牢牢吸附，因此，纸及其饱和水为层析的固定相，与固定相不相混溶的有机溶剂为层析的流动相。l对某些特定化合物，在特定的展层系统，一定的温度条件下，Rf是个常数。（2）离子交换层析）离子交换层析l原理：将能与周围介质进行离子交换的不稳定离子固定于惰性基质上，从而分离介质中的组分。l常用的惰性基质：人工合成树脂（单体：苯乙烯、交联剂：二乙烯苯）l阳离子交换剂：磺酸甲基、羧甲基、磷酸基l阴离子交换剂：二乙基胺乙基、三乙基胺乙基 l可交换离子：阳离子：Na+、H+阴离

12、子：Cl-、OH-示意图（交换树脂表面）示意图（交换树脂表面）示意图（离子交换过程）示意图（离子交换过程）电离基团（磺酸根）可交换离子（钠离子）交换离子不交换离子示意图示意图水分子B物质A物质（3）吸附层析）吸附层析l原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面原理：当气体或液体中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才离开，此为吸时，分子会贴在固体表面上并停留一定时间然后才离开，此为吸附现象。附现象。l吸附现象形成的原因：吸附现象形成的原因：吸附作用可能由几种作用力形成，包括被吸附作用可能由几种作用力形成，包括被吸附物与吸附剂之间相反电荷基

13、团与基团之间的静电引力吸附物与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间的静电引力(形成离形成离子键子键)、氢键及范德华引力等。、氢键及范德华引力等。l在不同条件在不同条件 下，占主要地位的作用力可能不同，也可能几种力同下，占主要地位的作用力可能不同，也可能几种力同时起作用时起作用l吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉、聚酰胺；滑石、吸附剂：氧化铝、活性炭、硅胶；纤维素、淀粉、聚酰胺；滑石、陶土、粘土。陶土、粘土。吸附层析示意图吸附层析示意图 吸附剂易吸附分子不易吸附分子（4）亲和层析）亲和层析l原理：利用分子间具有专一亲和力而设计的层析利用分子间具有专一亲和力而设计的层析技术。技术。l专一亲和力

14、分子对：酶与底物、特异性抗原与酶与底物、特异性抗原与抗体、抗体、DNA和和RNA、激素和其受体、激素和其受体l载体：使亲和物固相化的水不溶性化合物。如：使亲和物固相化的水不溶性化合物。如：纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、聚苯乙烯、乙烯、多孔玻璃。烯、乙烯、多孔玻璃。（5）凝胶过滤凝胶过滤l原理：被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的被分离物质因分子大小不同，在凝胶中向下移动的速度不同。速度不同。l物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动和无定向物质进入凝胶柱之后有两种运动方式：垂直向下移动和无定向的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶

15、颗粒内，只能分的扩散运动。大分子物质直径大无法进入凝胶颗粒内，只能分布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒布于颗粒间隙中向下移动快，而小分子物质可扩散到凝胶颗粒内，因此向下移动慢。内，因此向下移动慢。l凝胶物质：马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰马铃薯淀粉凝胶、琼脂、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶。胺凝胶、葡聚糖凝胶。电 泳 技 术一一.电泳的概念电泳的概念二二.电泳技术分类电泳技术分类三三.电泳技术基本原理电泳技术基本原理四四.几种常见电泳方法的比较几种常见电泳方法的比较五五.聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理一.电泳的概念l带电质点在电场中

16、移动的现象带电质点在电场中移动的现象。二.电泳技术分类三.电泳技术基本原理1.基本原理基本原理 不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所带净电荷量，分子量及分子形状有关。带净电荷量，分子量及分子形状有关。pH pI 分子带负电荷分子带负电荷,在电场中向正极移动在电场中向正极移动;pH 蛋蛋 GlyGlylm mcl cl cl clmm蛋蛋 蛋蛋m m GlyGly GlyGlyl凝胶中凝胶中ClCl为快离子，为快离子，Gly Gly为慢离子，为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。蛋白质样品被夹在中间。缓冲缓冲液液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶缓

17、冲液成分及pH的不连续性导致蛋白质样品浓缩效应示意图l快离子l慢离子l蛋白质样品 lE：每厘米的电压降每厘米的电压降 E EI(I(电流强度电流强度)/)/(电导率电导率)lE E与电泳速度成正比与电泳速度成正比l电泳开始后，由于快离子泳动电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后面形成一率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低的低电导区，产个离子浓度低的低电导区，产生较高的电位梯度，使蛋白质生较高的电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样和慢离子加速移动，蛋白质样品被进一步浓缩。品被进一步浓缩。电位梯度的不连续性lE：每厘米的电压降每厘米的电压降 E EI(I(电流强度电流强度)/)/(

18、电导率电导率)lE E与电泳速度成正比与电泳速度成正比l电泳开始后，由于快离子泳动电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后面形成一率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低的低电导区，产个离子浓度低的低电导区，产生较高的电位梯度，使蛋白质生较高的电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样和慢离子加速移动，蛋白质样品被进一步浓缩。品被进一步浓缩。电位梯度的不连续性A.样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括理包括：l缓冲液成分及缓冲液成分及pHpH的不连续性的不连续性l电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性 缓冲液缓冲液浓缩胶浓缩胶样品样品分离胶分离胶A.

19、样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括理包括：l凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。度变慢，堆积浓缩。缓冲缓冲液液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶A.样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括理包括：l凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲

20、液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。度变慢，堆积浓缩。缓冲缓冲液液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶A.样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括理包括：l凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。度变慢，堆积浓缩。缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶

21、A.样品的浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括理包括：l凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。度变慢，堆积浓缩。缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶B.电荷效应l蛋白质样品进入分离胶后蛋白质样品进入分离胶后 pHpH增大增大(pH 8.9)(pH 8.9)，GlyGly解离度增解离度增大，不存在快、慢离子之分，大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均

22、一电场强度和蛋白质样品在均一电场强度和pHpH条件下泳动。条件下泳动。l由于各种蛋白质由于各种蛋白质pI不同，所载有不同，所载有效电荷不同，因此质点的效电荷不同，因此质点的 有效有效迁移率不同，形成不同区带。迁移率不同，形成不同区带。缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶C.分子筛效应l分离胶的孔径小，各分子分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同受阻力不同，表现出不同的的 泳动速度，即分子筛作泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为球用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。形的泳动速度最快。缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶实验一实验一 离子交

23、换层析法分离氨基酸离子交换层析法分离氨基酸一、实验目的一、实验目的 学习用阳离子交换树脂分离氨基酸学习用阳离子交换树脂分离氨基酸 的操作方法和基本原理的操作方法和基本原理二、原理二、原理氨基酸的氨基酸的PIPI不同，在同一不同，在同一pHpH下所带电荷的数量和下所带电荷的数量和性质不同，与树脂的亲和力就有差异，因此可性质不同，与树脂的亲和力就有差异，因此可根据亲和力从小到大的顺序依次被洗脱下来。根据亲和力从小到大的顺序依次被洗脱下来。阳离子交换树脂：可供交换的是阳离子；阳离子交换树脂：可供交换的是阳离子；阴离子交换树脂：可供交换的是阴离子；阴离子交换树脂：可供交换的是阴离子；离子交换层析法分离

24、氨基酸离子交换层析法分离氨基酸三、操作步骤三、操作步骤1 1、装柱、装柱装柱是装柱是最关键最关键的一步。的一步。重力沉降法装柱重力沉降法装柱陆续不断地添加糊状物，使其形成的胶粒床面陆续不断地添加糊状物，使其形成的胶粒床面上有胶粒连续上有胶粒连续均匀地沉降均匀地沉降，直至装柱物完全沉，直至装柱物完全沉降至适当的柱床体积为止。降至适当的柱床体积为止。柱的表面始终要保持着一层溶剂柱的表面始终要保持着一层溶剂(一般一般l l3cm3cm柱柱高高)柱的任何一部分绝对柱的任何一部分绝对不能不能“流干流干”。1 1、装柱、装柱l层析柱的形状，一般直径层析柱的形状，一般直径 与高度的比为与高度的比为l l：1

25、515为宜。为宜。l柱形必须根据层析介质和柱形必须根据层析介质和 分离目的而定。待分离物分离目的而定。待分离物 质的性质相近，柱越质的性质相近，柱越细长细长，则分离效果越好，但流速则分离效果越好，但流速 较慢。在样品组分并不复较慢。在样品组分并不复 杂的情况下，采用杂的情况下，采用“矮胖矮胖柱柱”。2 2、平衡、平衡 l层析柱正式使用前，必须平衡至所需的层析柱正式使用前，必须平衡至所需的pHpH和离子强度，和离子强度，一般用起始缓冲液在恒定压力下走柱，其洗脱体积相当一般用起始缓冲液在恒定压力下走柱，其洗脱体积相当于于4-64-6倍倍床体积，使交换剂充分平衡，柱床稳定。装好床体积，使交换剂充分平

26、衡，柱床稳定。装好的柱必须的柱必须均匀，无纹路，不含气泡均匀，无纹路，不含气泡，柱顶交换剂沉积表，柱顶交换剂沉积表面十分平坦。面十分平坦。l本实验平衡体积：本实验平衡体积：606080mL80mLl调节流速：调节流速：0.5mL/min0.5mL/min或或8-128-12滴滴/min/min3 3、加样、加样 l上样量：上样量：0.3-0.5mL0.3-0.5mLl0.5mL0.5mL缓冲液冲洗加样处缓冲液冲洗加样处2 2次次注意：注意：加样的同时开始收集加样的同时开始收集加样时且勿搅动树脂床面加样时且勿搅动树脂床面4 4、洗脱与收集、洗脱与收集 l尽量维持衡定柱压尽量维持衡定柱压l每每2

27、2分钟收集一管，共收集分钟收集一管，共收集2525管管5 5、氨基酸的鉴定、氨基酸的鉴定 每个收集管每个收集管 1mL1mL水合茚三酮水合茚三酮沸水浴沸水浴15min15min比色测定比色测定绘制洗脱曲线绘制洗脱曲线实验二实验二 SDS-PAGE分离蛋白质分离蛋白质一、实验目的一、实验目的 掌握掌握SDS-PAGESDS-PAGE的工作原理和操作方法的工作原理和操作方法二、原理二、原理不同蛋白质具有不同的分子量，并在一定的不同蛋白质具有不同的分子量，并在一定的pHpH溶溶液中带有不同的电荷。但经过液中带有不同的电荷。但经过SDSSDS处理后的蛋白处理后的蛋白质，分子表面完全被负电荷所覆盖，因此

28、在电质，分子表面完全被负电荷所覆盖，因此在电泳时，电泳迁移率近取决于蛋白质的分子量大泳时，电泳迁移率近取决于蛋白质的分子量大小而与其所带电荷的性质无关。小而与其所带电荷的性质无关。分子筛效应分子筛效应浓缩效应浓缩效应SDS-PAGE分离蛋白质分离蛋白质三、操作步骤三、操作步骤1.1.安装膜具安装膜具装封胶条，注意封胶条平面朝下，不能有裂口装封胶条，注意封胶条平面朝下，不能有裂口盖上凹玻璃盖上凹玻璃将凹玻璃冲外装进槽里将凹玻璃冲外装进槽里将楔子插进，将底部插紧将楔子插进，将底部插紧 2.配制凝胶溶液配制凝胶溶液w胶的配制(平行电泳两块胶板)胶母液：8.4ml 配胶缓冲液：13ml 蒸馏水：4ml

29、 10%TEMD：0.2ml，混匀 10%AP：0.2ml，混匀 3.灌胶，加到顶部，来回倾斜去气泡灌胶，加到顶部，来回倾斜去气泡插入梳子插入梳子胶凝后用夹子将玻璃夹出胶凝后用夹子将玻璃夹出用夹子夹紧玻璃将封胶条轻轻撕掉用夹子夹紧玻璃将封胶条轻轻撕掉旋转旋转180180度，凹玻璃向里度，凹玻璃向里将玻璃放进槽内将玻璃放进槽内加缓冲液加缓冲液4.4.样品制备：样品制备：将将0.5ml 0.5ml 样品液，样品液，0.25ml 10%SDS 0.25ml 10%SDS和和0.25ml 0.25ml 1%1%巯基乙醇于小试管中，置巯基乙醇于小试管中，置100100水浴中煮水浴中煮沸沸3 3分钟后，取

30、出冷却，然后，加入分钟后，取出冷却，然后，加入0.25ml 0.25ml 上样缓冲液（上样缓冲液（0.05%0.05%溴酚兰溴酚兰+40%+40%蔗糖溶液），蔗糖溶液），混合。取出混合样品混合。取出混合样品4040微升加入样品槽，每微升加入样品槽，每个样品重复两个。个样品重复两个。5.5.加加 样样6.6.电泳电泳电泳：电泳：接通电源，电流恒定为接通电源，电流恒定为80mA，待溴酚兰指示，待溴酚兰指示剂移至离下端剂移至离下端0.5cm（约（约3小时），切断电小时），切断电源，拔去插头，倒出电极缓冲液于大烧杯中源，拔去插头，倒出电极缓冲液于大烧杯中（如此缓冲液欲重用时，应把正负电极液分（如此缓冲

31、液欲重用时，应把正负电极液分别贮存）。别贮存）。7.7.剥剥 胶胶8 8 染色：染色：考马斯亮蓝染色，详见教材考马斯亮蓝染色，详见教材 9 9 脱色脱色凝胶（脱色之后）结果分析凝胶（脱色之后）结果分析 1、计算迁移率（、计算迁移率（Rm值）：计算公式见教材。值）：计算公式见教材。2 2、绘制标准曲线：以标准蛋白亚基的、绘制标准曲线：以标准蛋白亚基的R Rm m值为横坐值为横坐标，以相应分子量的对数值为纵坐标，即可绘标，以相应分子量的对数值为纵坐标，即可绘制出测定蛋白质分子量的标准的线图。制出测定蛋白质分子量的标准的线图。3 3、计算未知蛋白亚基样品的分子量：根据未知样、计算未知蛋白亚基样品的分

32、子量：根据未知样品样的品样的R Rm m值，从上述标准曲线图中即可查出其值，从上述标准曲线图中即可查出其分子量。分子量。实验三实验三 DNS法测定还原糖法测定还原糖一、实验目的一、实验目的 掌握还原糖定量测定的原理和方法掌握还原糖定量测定的原理和方法二、原理二、原理在碱性溶液中，还原糖变为烯二醇，烯二醇可被在碱性溶液中，还原糖变为烯二醇，烯二醇可被3 3，5 5二硝基水杨酸（二硝基水杨酸（DNSDNS）氧化为糖酸，加热）氧化为糖酸，加热进一步产生一种红棕色的氨基化合物，在一定进一步产生一种红棕色的氨基化合物，在一定浓度范围内，棕红色物质颜色的深浅程度与还浓度范围内，棕红色物质颜色的深浅程度与还

33、原糖的量成正比，以此测定糖的量。原糖的量成正比，以此测定糖的量。三、操作步骤三、操作步骤1 1、葡萄糖标准曲线的绘制、葡萄糖标准曲线的绘制详见教材详见教材2 2、还原糖的制备、还原糖的制备 样品：苹果样品：苹果 滤液测定前稀释滤液测定前稀释4倍倍 其余操作见教材其余操作见教材3 3、样品的酸水解和总糖的提取、样品的酸水解和总糖的提取 滤液测定前稀释滤液测定前稀释2倍倍 其余操作见教材其余操作见教材4 4、苹果样品中总糖和还原糖的测定、苹果样品中总糖和还原糖的测定详见教材详见教材实验四实验四 多酚氧化酶的制备、性质多酚氧化酶的制备、性质和影响因素和影响因素一、实验目的一、实验目的 学习从组织细胞

34、中制备酶的方法学习从组织细胞中制备酶的方法 掌握多酚氧化酶的作用、化学性质及影响因素掌握多酚氧化酶的作用、化学性质及影响因素二、原理二、原理多酚氧化酶催化儿茶酚氧化成儿茶醌，进一步聚合多酚氧化酶催化儿茶酚氧化成儿茶醌，进一步聚合成褐色物质；成褐色物质；通过反应液颜色的变化可大致判断反应的程度，进通过反应液颜色的变化可大致判断反应的程度，进而推测酶的作用及活力的大小；而推测酶的作用及活力的大小；酶是生物催化剂，易受到各种因素的影响，如温度、酶是生物催化剂，易受到各种因素的影响，如温度、pHpH、底物浓度、酶浓度等。、底物浓度、酶浓度等。三、操作步骤三、操作步骤1 1、酶的制备、酶的制备150g1

35、50g土豆土豆（3 3组）组）150mL NaF150mL NaF溶液溶液匀浆匀浆四层纱布四层纱布过滤过滤每组取每组取50mL50mL16g16g固体硫酸铵固体硫酸铵4430min30min离心离心15min15min4000r/min4000r/min沉淀溶于沉淀溶于15mL15mL缓冲液中缓冲液中粗酶液粗酶液2 2、多酚氧化酶的作用、多酚氧化酶的作用三、操作步骤三、操作步骤酶液酶液邻苯二酚邻苯二酚水水现象现象管管115d15d管管215d15d管管315d15d3737水浴反应，每间隔水浴反应，每间隔5min5min振荡，观察颜色变化，共振荡，观察颜色变化，共25min25min。3 3、

36、多酚氧化酶的化学性质、多酚氧化酶的化学性质三、操作步骤三、操作步骤酶液酶液变性剂变性剂邻苯邻苯二酚二酚反应反应现象现象管管115d15d3737水浴水浴10min10min管管210d10d三氯乙三氯乙酸，酸，2min10d3737水浴水浴10min10min管管315d苯硫脲结晶，苯硫脲结晶，5min15d3737水浴水浴10min10min3737水浴反应，水浴反应，10min10min。4 4、底物专一性、底物专一性三、操作步骤三、操作步骤酶液酶液邻苯二酚邻苯二酚间苯二酚间苯二酚对苯二酚对苯二酚现象现象管管115d15d管管215d15d管管315d15d3737水浴反应，每间隔水浴反应

37、，每间隔5min5min振荡，观察颜色变化，共振荡，观察颜色变化，共25min25min。5 5、底物浓度的影响、底物浓度的影响三、操作步骤三、操作步骤3737水浴反应，水浴反应，1min1min。酶液酶液邻苯二酚邻苯二酚水水反应反应现象现象管管15d1d39d3737水浴水浴1min1min管管25d10d30d3737水浴水浴1min1min管管35d40dd3737水浴水浴1min1min6 6、酶浓度的影响、酶浓度的影响三、操作步骤三、操作步骤3737水浴反应，水浴反应，2min2min。酶液酶液邻苯二酚邻苯二酚水水反应反应现象现象管管115d15d3737水浴水浴2min2min管管

38、21d15d14d3737水浴水浴2min2min7 7、H H+浓度的影响浓度的影响三、操作步骤三、操作步骤3737水浴反应，水浴反应，5min5min。0.8%HCl0.3%乳酸乳酸0.2%乳酸乳酸0.01%Na2CO30.5%Na2CO3酶液酶液邻苯邻苯二酚二酚现象现象管管140d8d7d管管240d8d7d管管340d8d7d管管440d8d7d管管540d8d7d实验五实验五 碱性蛋白酶活力的测定碱性蛋白酶活力的测定（福林酚试剂法）（福林酚试剂法）一、实验目的一、实验目的 学习测定蛋白酶活力的方法学习测定蛋白酶活力的方法 掌握分光光度计的原理和使用方法掌握分光光度计的原理和使用方法二

39、、原理二、原理酪蛋白酪蛋白蛋白酶蛋白酶酪氨酸酪氨酸比色测定比色测定钼蓝钼蓝钨蓝钨蓝酪氨酸酪氨酸福林酚福林酚1 1、样品处理、样品处理三、操作步骤三、操作步骤详见教材详见教材2 2、比色测定、比色测定4 4支试管，分别加入支试管，分别加入1mL1mL酶液酶液4040预热预热2 23min3min空白管空白管平行管平行管1mL 2%1mL 2%酪蛋白酪蛋白4040，10min10min1mL 2%1mL 2%酪蛋白酪蛋白4040，15min15min2mL 2mL 三氯乙酸三氯乙酸4040，15min15min2mL 2mL 三氯乙酸三氯乙酸4040，10min10min过滤，分别取过滤，分别取1

40、mL1mL滤液滤液（1）（2）（3）三、操作步骤三、操作步骤2 2、比色测定、比色测定过滤，分别取过滤，分别取1mL1mL滤液滤液（3）分别加入分别加入5mL Na5mL Na2 2COCO3 3溶液溶液1mL1mL福林酚试剂福林酚试剂（4）4040反应反应20min20min（5）（6）比色测定比色测定A A680680，管，管做参比做参比三、操作步骤三、操作步骤3 3、绘制标准曲线、绘制标准曲线（1 1）按教材表）按教材表3 32222加各种试剂，加各种试剂，福林酚试剂最后加入；福林酚试剂最后加入；（2 2）摇匀，）摇匀，40 40反应反应20min20min；（3 3）比色测定）比色测定

41、A A680680，管，管1 1做参比；做参比；（4 4）绘制标准曲线，求）绘制标准曲线，求K K值。值。4 4、酶活力的计算、酶活力的计算实验六实验六 菜花中核酸的分离与鉴定菜花中核酸的分离与鉴定一、实验目的一、实验目的 学习和掌握从植物组织中分离核酸的原理和方法学习和掌握从植物组织中分离核酸的原理和方法 掌握定糖法测定核酸的原理及操作方法掌握定糖法测定核酸的原理及操作方法二、原理二、原理核酸的提取：三氯乙酸或高氯酸除酸溶小分子核酸的提取：三氯乙酸或高氯酸除酸溶小分子 有机溶剂去脂类有机溶剂去脂类 浓盐溶液（浓盐溶液（1010NaClNaCl）提）提DNADNA 0.5M 0.5M高氯酸提高

42、氯酸提RNARNARNARNA核糖的测定核糖的测定:苔黑酚法苔黑酚法DNADNA脱氧核糖的测定：二苯胺法脱氧核糖的测定：二苯胺法三、操作步骤三、操作步骤1 1、核酸的分离、核酸的分离菜花花冠菜花花冠20g 20g 20mL9520mL95乙醇海砂乙醇海砂匀浆匀浆抽滤抽滤滤渣滤渣抽滤抽滤提取物一提取物一搅拌均匀搅拌均匀抽滤抽滤20mL20mL丙酮丙酮滤渣滤渣20mL20mL丙酮丙酮搅拌搅拌5min5min抽滤抽滤滤渣滤渣20mL20mL高氯酸高氯酸冰盐浴冰盐浴搅拌搅拌抽滤抽滤滤渣滤渣20mL9520mL95乙醇乙醇滤渣滤渣20mL20mL丙酮丙酮搅拌搅拌5min5min抽滤至干抽滤至干滤渣滤渣4

43、0mL1040mL10氯化钠氯化钠沸水浴沸水浴15min15min抽滤抽滤滤渣滤渣滤液滤液重复重复一次一次20mL20mL高氯酸高氯酸7070水浴水浴20min20min抽滤抽滤滤液滤液提取提取物二物二三、操作步骤三、操作步骤2 2、RNARNA和和DNADNA的定性鉴定的定性鉴定（1 1）二苯胺反应）二苯胺反应 按教材表按教材表3 31515加入各种试剂，反应加入各种试剂，反应后观察并记录结果。后观察并记录结果。（2 2）苔黑酚反应）苔黑酚反应 按教材表按教材表3 31616加入各种试剂，反应加入各种试剂，反应后观察并记录结果。后观察并记录结果。实验七实验七 Bradford法测定蛋白质的含

44、量法测定蛋白质的含量一、实验目的一、实验目的 学习考马斯亮蓝学习考马斯亮蓝G G250250染色法测定蛋白质含量染色法测定蛋白质含量的原理和方法。的原理和方法。二、原理二、原理考马斯亮蓝考马斯亮蓝G G250250与蛋白质结合后引起染料最大吸与蛋白质结合后引起染料最大吸收光的改变，从收光的改变，从465nm465nm变为变为595nm595nm；蛋白质染料复合物有较高的消光系数，蛋白最低蛋白质染料复合物有较高的消光系数，蛋白最低检出量为检出量为1 1微克，灵敏度高；微克，灵敏度高；反应迅速，反应迅速，2min2min，且结合物在，且结合物在1h1h内稳定；内稳定；干扰物质少。干扰物质少。三、操作步骤三、操作步骤1 1、牛血清白蛋白标准曲线的制作、牛血清白蛋白标准曲线的制作按教材表按教材表3 31212加入试剂；加入试剂；反应反应2min2min，以，以1 1号管为参比，测定号管为参比，测定A595A595；绘制标准曲线。绘制标准曲线。2 2、未知样品中蛋白质浓度的测定、未知样品中蛋白质浓度的测定详见教材详见教材