《斑马鱼的性腺发育》PPT课件.ppt

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1、斑马鱼的性腺发育 精巢的组织学结构和不同发育阶段生殖细胞形态n n精巢一对，位于腹腔背部两侧，体积较小，以系膜与体壁相联，左右精巢一对，位于腹腔背部两侧，体积较小，以系膜与体壁相联，左右精巢彼此分开，在尾端合并成一条很短的输精管，和一般鲤科鱼类相精巢彼此分开，在尾端合并成一条很短的输精管，和一般鲤科鱼类相同。同。n n生殖上皮随着结缔组织向精巢内部延伸，形成许多隔膜，把精巢分成生殖上皮随着结缔组织向精巢内部延伸，形成许多隔膜，把精巢分成许多不规则的精小叶，从其横切面上可见许多精小叶紧密排列，但没许多不规则的精小叶，从其横切面上可见许多精小叶紧密排列，但没有一定的规律性，精小叶为精巢的实质部分，

2、因其呈管状又可称为精有一定的规律性，精小叶为精巢的实质部分，因其呈管状又可称为精小管。小管。n n在精小叶内由许多精小囊组成，随着精巢的发育，精小叶内各精小囊在精小叶内由许多精小囊组成，随着精巢的发育，精小叶内各精小囊间生精细胞发育不同步，而在同一精小囊内生精细胞发育是同步的。间生精细胞发育不同步，而在同一精小囊内生精细胞发育是同步的。n n精小叶中央为小叶腔，小叶腔在精巢内相互连接成网状，最后通到输精小叶中央为小叶腔，小叶腔在精巢内相互连接成网状，最后通到输精管，精原细胞位于精小叶的边缘处，在分化过程中，当生殖细胞在精管，精原细胞位于精小叶的边缘处，在分化过程中，当生殖细胞在精小囊内发育成为

3、成熟的精子时，精小囊破裂，成熟的精子释放到小精小囊内发育成为成熟的精子时，精小囊破裂，成熟的精子释放到小叶腔中，各小叶腔内的精子最后汇集到输精管内并可借助于输精管排叶腔中，各小叶腔内的精子最后汇集到输精管内并可借助于输精管排出，因此成熟的精子只在小叶腔和输精管内存在。出，因此成熟的精子只在小叶腔和输精管内存在。n n生殖细胞在发生上由外向里可分为精原细胞、初级精母细胞、次级精生殖细胞在发生上由外向里可分为精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子。母细胞、精子细胞和精子。繁殖期，繁殖期，繁殖期，繁殖期，V V 期精巢期精巢期精巢期精巢III III 期精巢；小叶腔明显，初级精母细胞排

4、列多层，比期精巢；小叶腔明显，初级精母细胞排列多层，比期精巢；小叶腔明显，初级精母细胞排列多层，比期精巢；小叶腔明显，初级精母细胞排列多层，比例尺示例尺示例尺示例尺示 24m24mSg,Sg,精原细胞；精原细胞；ScSc,初级精母细胞；初级精母细胞；ScSc，次级精母细胞；，次级精母细胞；St,St,精精子细胞；子细胞；Sz,Sz,精子；精子；LLLL，小叶腔；，小叶腔；LCLC，间质细胞；，间质细胞；SC,SC,支持细胞；支持细胞；ST,ST,精小囊精小囊VI VI 期晚期精巢期晚期精巢期晚期精巢期晚期精巢,示精小囊内发育同步的各期生殖细胞，示精小囊内发育同步的各期生殖细胞，示精小囊内发育同

5、步的各期生殖细胞，示精小囊内发育同步的各期生殖细胞，比例尺示比例尺示比例尺示比例尺示 24m24mSg,Sg,精原细胞；精原细胞；ScSc,初级精母细胞；初级精母细胞；ScSc，次级精母细胞；，次级精母细胞；St,St,精精子细胞；子细胞；Sz,Sz,精子；精子；LLLL，小叶腔；，小叶腔；LCLC，间质细胞；，间质细胞；SC,SC,支持细胞；支持细胞；ST,ST,精小囊精小囊V V 期早期精巢，示精原细胞，精母细胞，精子细胞和期早期精巢，示精原细胞，精母细胞，精子细胞和期早期精巢，示精原细胞，精母细胞，精子细胞和期早期精巢，示精原细胞，精母细胞，精子细胞和精子，比例尺示精子，比例尺示精子，比

6、例尺示精子，比例尺示 24m24mSg,Sg,精原细胞；精原细胞；ScSc,初级精母细胞；初级精母细胞；ScSc，次级精母细胞；，次级精母细胞；St,St,精精子细胞；子细胞；Sz,Sz,精子；精子；LLLL，小叶腔；，小叶腔；LCLC，间质细胞；，间质细胞；SC,SC,支持细胞；支持细胞；ST,ST,精小囊精小囊V V 期中期精巢，示成熟的精子充满整个精小叶，期中期精巢，示成熟的精子充满整个精小叶，期中期精巢，示成熟的精子充满整个精小叶，期中期精巢，示成熟的精子充满整个精小叶，比例尺示比例尺示比例尺示比例尺示 24m24m；Sg,Sg,精原细胞；精原细胞；ScSc,初级精母细胞；初级精母细胞

7、；ScSc，次级精母细胞；，次级精母细胞；St,St,精精子细胞；子细胞；Sz,Sz,精子；精子；LLLL，小叶腔；，小叶腔；LCLC，间质细胞；，间质细胞；SC,SC,支持细胞；支持细胞；ST,ST,精小囊精小囊期精巢，示精子排出后留下的空腔，腔内有少量残期精巢，示精子排出后留下的空腔，腔内有少量残期精巢，示精子排出后留下的空腔，腔内有少量残期精巢，示精子排出后留下的空腔，腔内有少量残存的精子和第二次发育由精原细胞有丝分裂产生的初存的精子和第二次发育由精原细胞有丝分裂产生的初存的精子和第二次发育由精原细胞有丝分裂产生的初存的精子和第二次发育由精原细胞有丝分裂产生的初级精母细胞级精母细胞级精母

8、细胞级精母细胞.Sg,Sg,精原细胞；精原细胞；ScSc,初级精母细胞；初级精母细胞；ScSc，次级精母细胞；，次级精母细胞；St,St,精精子细胞；子细胞；Sz,Sz,精子；精子；LLLL，小叶腔；，小叶腔；LCLC，间质细胞；，间质细胞；SC,SC,支持细胞；支持细胞；ST,ST,精小囊精小囊 卵巢的组织学结构和不同发育阶段生殖细胞形态n n斑马鱼卵巢一对，左右两叶，大部分对称；斑马鱼卵巢一对，左右两叶，大部分对称；成熟卵巢呈囊状，位于体腔内，外被由平成熟卵巢呈囊状，位于体腔内，外被由平滑肌和结缔组织形成的卵巢膜，卵巢膜不滑肌和结缔组织形成的卵巢膜，卵巢膜不发达。发达。n n卵巢位于腹中线

9、两侧卵巢位于腹中线两侧 ,在鱼体后端汇合成在鱼体后端汇合成一短的输卵管一短的输卵管 ,进入泄殖腔进入泄殖腔,由泄殖腔开口由泄殖腔开口于体外。于体外。n n卵母细胞直径、核径和核质比在不同时相卵母细胞直径、核径和核质比在不同时相中的变化中的变化:卵母细胞在卵母细胞在时相增长不明显，在时相增长不明显，在、时相期增长时相期增长迅速迅速 胞核的直径在胞核的直径在时相增长迅速，在时相增长迅速，在时相中期、时相中期、时相增时相增长缓慢，几乎没有变化长缓慢，几乎没有变化 核质比在第核质比在第时相最大，随着卵母细胞的发育，核质比越时相最大，随着卵母细胞的发育，核质比越来越小来越小n n卵巢壁卵巢壁:由两层被膜

10、构成由两层被膜构成 ,外层为腹膜外层为腹膜 ,内层为白膜。内层为白膜。白膜由外到内依次为扁平上白膜由外到内依次为扁平上皮细胞、皮细胞、疏松结缔组织、疏松结缔组织、间质组织和生殖上皮。间质组织和生殖上皮。n n产卵板产卵板:白膜中的结缔组织白膜中的结缔组织向卵巢内部伸展与卵巢生殖向卵巢内部伸展与卵巢生殖上皮共同构成板层状结构上皮共同构成板层状结构 ,称产卵板称产卵板 ,是卵子产生的地是卵子产生的地方。方。n n卵巢腔卵巢腔:存在于卵巢内部的存在于卵巢内部的空腔空腔 ,与输卵管相通。与输卵管相通。S B 产卵板不同龄雌鱼卵巢发育n n0 01616日龄日龄:没有观察到性腺发育情况。没有观察到性腺发

11、育情况。n n17172222日龄日龄:原始生殖细胞没有两性分化原始生殖细胞没有两性分化 ,数数n n量开始增多量开始增多 ,并逐渐聚集成团并逐渐聚集成团 ,细胞质嗜酸性细胞质嗜酸性 ,核较大核较大 ,嗜碱性嗜碱性 ,有一明显核仁。有一明显核仁。n n2727日龄日龄:原始生殖细胞分化为卵原细胞原始生殖细胞分化为卵原细胞 ,体积变大体积变大 ,数量增多数量增多 ,成排排列成排排列 ,在在腹腔后背部分布腹腔后背部分布 ,与肝胰脏相连。与肝胰脏相连。n n32325757日龄日龄:卵巢体积较小卵巢体积较小 ,位于腹腔后背部位于腹腔后背部 ,靠近肝胰脏。卵巢内主要为靠近肝胰脏。卵巢内主要为第第 时相

12、卵母细胞时相卵母细胞 ,细细n n胞体积小胞体积小 ,圆形圆形 ,细胞质少细胞质少 ,有一明显细胞核。核中部有有一明显细胞核。核中部有 1 12 2个核仁个核仁 ,核内染核内染色质细丝状色质细丝状 。n n6262日龄日龄:主要为第主要为第 时相卵母细胞时相卵母细胞 ,细胞为多角形、细胞为多角形、圆形。细胞质较多圆形。细胞质较多 ,染染色较深色较深 ,为淡紫红色。为淡紫红色。n n核相应增大核相应增大 ,弱嗜酸性弱嗜酸性 ,核仁数个核仁数个 ,靠近核膜内侧分布。卵母细胞外面有一层靠近核膜内侧分布。卵母细胞外面有一层滤泡细胞。滤泡细胞。n n67677272日龄日龄:卵巢粗短卵巢粗短 ,主要存在

13、第主要存在第 时相和发育早期的第时相和发育早期的第 时相卵母细时相卵母细胞。早期第胞。早期第 时相卵母细胞比第时相卵母细胞比第 时相卵母细胞体积大时相卵母细胞体积大 ,圆形或椭圆形圆形或椭圆形 ,染色较浅染色较浅 ,核周细胞质内出现少量空泡。细胞核较大核周细胞质内出现少量空泡。细胞核较大 ,弱嗜酸性弱嗜酸性 ,核仁多个核仁多个 ,分布在核膜内缘分布在核膜内缘 ,被染成深蓝色。卵母细胞外周辐射带很薄被染成深蓝色。卵母细胞外周辐射带很薄 ,结构不明显结构不明显 ,细细胞外隐约能看到两层滤泡膜。胞外隐约能看到两层滤泡膜。n n7777日龄日龄:以第以第 、时相卵母细胞为主时相卵母细胞为主 ,大部分第

14、大部分第 时相卵母细胞处于发时相卵母细胞处于发育中期。中期第育中期。中期第 时相卵母细胞近圆形时相卵母细胞近圆形 ,体积明显增大。胞质的空泡内出现体积明显增大。胞质的空泡内出现了嗜酸性的卵黄颗粒了嗜酸性的卵黄颗粒 ,越靠近细胞核越靠近细胞核 ,卵黄颗粒越大。卵核体积增大卵黄颗粒越大。卵核体积增大 ,染色较染色较浅浅 ,核仁多个核仁多个 ,分布在核膜内缘。随卵母细胞的发育分布在核膜内缘。随卵母细胞的发育 ,核仁逐渐向核中央移动核仁逐渐向核中央移动 ,呈深蓝色。细胞周围辐射带明显呈深蓝色。细胞周围辐射带明显 ,并随着细胞体积的增大而增厚并随着细胞体积的增大而增厚 ,细胞外两细胞外两层滤泡膜发育明显

15、层滤泡膜发育明显 。n n82829090日龄日龄:以第以第 、第第 时相卵母细胞为主。晚期第时相卵母细胞为主。晚期第 时相卵母细胞时相卵母细胞体积较大体积较大 ,空泡内充满卵黄。第空泡内充满卵黄。第 时相卵母细胞由于卵黄物质不断积累时相卵母细胞由于卵黄物质不断积累 ,细细胞体积继续增大胞体积继续增大 ,圆球形的卵黄颗粒基本充满卵母细胞质。细胞核逐渐由中圆球形的卵黄颗粒基本充满卵母细胞质。细胞核逐渐由中央向动物极移动。卵巢壁随卵母细胞的数量增多和体积增加而逐渐变薄央向动物极移动。卵巢壁随卵母细胞的数量增多和体积增加而逐渐变薄 ,放放射带明显增厚。射带明显增厚。n n成熟小鱼成熟小鱼:卵巢白膜变

16、得很薄。卵巢以第卵巢白膜变得很薄。卵巢以第 时相卵母细胞为主时相卵母细胞为主 ,也存在有发也存在有发育早期的卵母细胞。第育早期的卵母细胞。第 时相卵母细胞已充分发育时相卵母细胞已充分发育 ,呈圆球形呈圆球形 ,卵黄颗粒卵黄颗粒相互融合相互融合 ,细胞质中充满粗大的卵黄颗粒细胞质中充满粗大的卵黄颗粒 ,散布于整个卵母细胞的胞质内。散布于整个卵母细胞的胞质内。至此至此 ,卵母细胞发育成熟卵母细胞发育成熟 ,不久不久 ,核膜崩解、消失核膜崩解、消失 ,卵母细胞进入第卵母细胞进入第 2 2次成次成熟分裂中期熟分裂中期 ,形成次级卵母细胞形成次级卵母细胞 ,排到卵巢腔。排到卵巢腔。n n产卵后小鱼产卵后

17、小鱼:卵巢细长卵巢细长 ,结构松散结构松散 ,包含有排卵后的空滤泡、包含有排卵后的空滤泡、第第 时相、时相、第第 时相和第时相和第 时相卵母细胞。时相卵母细胞。1 时相卵母细胞(皮层滤泡期或卵黄生成前期)n n主要是处在小生长期的卵母主要是处在小生长期的卵母细胞。卵母细胞直径在约为细胞。卵母细胞直径在约为54.5654.5694.24m94.24m，核径，核径约为约为29.7629.7659.52m59.52m，核质比约为：核质比约为：0.110.110.420.42。核形不规则，呈圆形、椭圆核形不规则，呈圆形、椭圆形或多角形，细胞质嗜碱性，形或多角形，细胞质嗜碱性，H.E H.E 染色呈深紫

18、色，核浅染色呈深紫色，核浅蓝色，位于细胞中央。在同蓝色，位于细胞中央。在同一切面上核内有一切面上核内有 3-10 3-10 个核个核仁，沿核膜内缘分布。根据仁，沿核膜内缘分布。根据卵径大小和结构形态的不同，卵径大小和结构形态的不同，这个时相又可以分为三个阶这个时相又可以分为三个阶段；在早期，卵母细胞形态段；在早期，卵母细胞形态仍然不规则，形状多变；在仍然不规则，形状多变；在发育中期，卵母细胞呈近圆发育中期，卵母细胞呈近圆球形；发育晚期，卵母细胞球形；发育晚期，卵母细胞内生长环迅速扩大。滤泡膜内生长环迅速扩大。滤泡膜仅一层。仅一层。时相卵母细胞(卵黄生成期)n n主要是处在大生长期早期的初级卵母

19、细胞。第 3 时相卵母细胞比第 2 时相卵母细胞大，但染色要浅。卵母细胞呈圆球形，该时相卵母细胞开始出现液泡，内含物被 H.E 染成淡红色。滤泡膜上皮细胞开始分裂，并与卵母细胞的质膜分离，出现不明显的放射带。根据卵母细胞的大小、卵黄沉积的多少以及放射膜的有无将其分为早、中、晚三个时期。时相早期n n卵母细胞直径在约为卵母细胞直径在约为 97.397.3155.68m 155.68m 之间，之间，核径约为核径约为 38.9238.9268.11m68.11m，核质比约为：，核质比约为：0.020.020.140.14。胞质弱嗜。胞质弱嗜碱性。核质嗜酸性，核仁碱性。核质嗜酸性，核仁位于核膜内缘，主

20、要为小位于核膜内缘，主要为小核仁，核仁，35 35 个左右。细胞个左右。细胞质外缘出现少许小液泡，质外缘出现少许小液泡，直径直径 1 12m2m，较透明，较透明，内含物极少。卵母细胞外内含物极少。卵母细胞外周的放射带很薄，结构不周的放射带很薄，结构不明显。此时已经形成两层明显。此时已经形成两层膜结构。膜结构。时相中期n n卵母细胞明显增大，卵母细胞明显增大，卵母细胞直径在约为卵母细胞直径在约为 124124198.4m198.4m，胞，胞核约核约 49.649.6119.04m119.04m，核质比，核质比为为 0.030.030.360.36。核质。核质被染成浅紫色，大核被染成浅紫色，大核仁

21、少见，小核仁约仁少见，小核仁约 40 40 个左右，其中较大的个左右，其中较大的分布于核膜内侧，较分布于核膜内侧，较小的散在于核质中。小的散在于核质中。放射带发育明显。内放射带发育明显。内层膜的细胞呈立方形，层膜的细胞呈立方形，而外层的仍为扁平形。而外层的仍为扁平形。时相晚期n n卵母细胞增大为卵母细胞增大为 145.95145.95330.82m330.82m，核径，核径为为 48.6548.6558.38m58.38m，核质比，核质比 0.0060.0060.060.06。液。液泡充满卵黄，放射泡充满卵黄，放射带的外周形成均染带的外周形成均染粉红色的胶质膜结粉红色的胶质膜结构，小核仁构，小

22、核仁 45 45 个个左右，多位于核膜左右，多位于核膜内侧周边。内侧周边。IV 时相卵母细胞(卵母细胞成熟期)n n主要是处在大生长期晚期主要是处在大生长期晚期的初级卵母细胞。由于卵的初级卵母细胞。由于卵黄物质不断积累，卵母细黄物质不断积累，卵母细胞细胞体积继续增大、卵胞细胞体积继续增大、卵黄迅速积累、液泡被积压黄迅速积累、液泡被积压到卵母细胞周边的细胞质到卵母细胞周边的细胞质中，圆球形的卵黄颗粒基中，圆球形的卵黄颗粒基本充满卵母细胞质，卵母本充满卵母细胞质，卵母细胞直径在约为细胞直径在约为 379.47379.47447.58m447.58m，胞核约，胞核约 38.9238.9268.11m

23、68.11m，核，核质比为质比为 0.00070.00070.0040.004，细胞质及细胞核开始由，细胞质及细胞核开始由中央直接移向动物极移动，中央直接移向动物极移动，卵母细胞开始表现出极性。卵母细胞开始表现出极性。放射带明显增厚。放射带明显增厚。V 时相卵母细胞(成熟卵期)n n卵母细胞已充分发卵母细胞已充分发育，呈圆球形，卵育，呈圆球形，卵径约为径约为 467.04467.04564.34m564.34m。卵黄。卵黄颗粒相互融合，细颗粒相互融合，细胞质中充满粗大的胞质中充满粗大的卵黄颗粒，卵黄颗卵黄颗粒，卵黄颗粒散布于整个卵母粒散布于整个卵母细胞的胞质内，至细胞的胞质内，至此，卵母细胞已

24、经此，卵母细胞已经成熟，以后便脱离成熟，以后便脱离滤泡膜而排入卵巢滤泡膜而排入卵巢腔。腔。2.2.2.5 VI 时相卵母细胞n n卵细胞排出，剩余的空滤泡膜，形状不规则，蜷曲于卵巢内。斑马鱼的繁殖斑马鱼为研究脊椎动物胚胎发育的理想模式生物n n子代数多n n可以光周期诱发产卵n n体外受精，胚体透明，胚胎发育快n n可以诱发产生突变种n n可以分子生物技术控制特定基因表现或产生基因转殖鱼n n在胚胎发育时期的讯号传递路径和哺乳动物有很高的同源性分辨斑马鱼雌雄n n公鱼：与性成熟前体态相似，保持原本的 流线型，臀鳍较母鱼长。在身上各 个鱼鳍末端，时常可看到有明显的 黄色出现。n n母鱼：性成熟后

25、肚子开始膨大，里面卵囊 形成卵，臀鳍较公鱼来得小、短且 较圆，鱼鳍末端有时也有黄色出 现，但相对于公鱼出现的时间比较 少。步骤一、布置环境光周期调控：斑马鱼需要在约14:10光照周 期下，才会产生交配产卵的 行为。水温：需在2428.5。n n在适当的水温下，将公鱼和母鱼分缸进行饲养约5-7天后，即可在光周期天亮后1小时内，看到斑马鱼进行交配行为。步骤二、交配前准备n n产卵前一天的准备：1.挑选出适当的公鱼跟母鱼，体长要尽量一样，挑选出适当的公鱼跟母鱼，体长要尽量一样，母鱼可以略大一些。母鱼可以略大一些。2.将公鱼与母鱼分别放置产卵缸的两侧，中间将公鱼与母鱼分别放置产卵缸的两侧，中间设置隔板

26、将其隔开。设置隔板将其隔开。3.产卵房的准备产卵房的准备步骤三、交配当天n n光周期控制的隔天清晨，当天亮后约十分钟，公鱼和母鱼会恢复清醒。n n当母鱼发现公鱼时，由于前一天的费洛蒙影响，母鱼在天亮后也释放另一种费洛蒙，使公鱼往母鱼方向前去的行为更加明显及强烈。n n此时就可以准备打开隔板，让公鱼跟母鱼进行交配。交配中n n公鱼在交配的过程中，采绝对主动方式，会先以眼睛观察并决定要向哪一只母鱼进行攻势。其次会进行求偶舞蹈，在想要交配的母鱼周围绕圈圈或是字型，游向母鱼后，利用腹部侧面摩擦母鱼，刺激母鱼排卵，公鱼便会同时射精。产卵n n母鱼会一次把全部腹中的卵包括卵囊全部排出，一胎约会生出200-

27、500颗卵。排出后母鱼会重新产生新的卵，约3-5天就可以再生下一次卵。n n伴随着卵的释放，会有其他激素一起排出，这种激素可以让母鱼顺利把卵排放出来，另外一个功能则是让其他还产生卵的母鱼，停止排卵的行为，这在演化上算是一种竞争的结果。注意事项（1）n n母鱼体内的卵，如果太长时间没有交配，或是没有完全排完，卵会留在体内，并不会重新被吸收回去，如果超过太久没有排卵，母鱼腹部中的卵会死亡，并且造成母鱼腹部类似囊肿的残留物，这种囊肿会让母鱼下次排卵不顺，甚至无法排卵而被公鱼激烈的追求之后而难产死亡，目前也没有较好的方式改善这种情况。一般认为，固定一段时间就让公鱼跟母鱼进行交配，让母鱼把卵排出，是较好

28、的方式。注意事项（2）n n斑马鱼的卵在受精后，约72小时即可孵化，在这段期间内，不需要给予打气，只要放在干净的水中即可孵化。放在解剖显微镜下，即可清楚的看到斑马鱼胚胎发育的整个经过。人工受精n n将鱼放入冰水中，直至不太活动为止。n n雌鱼：轻压腹部，卵子流出。收集到小培养皿中。n n雄鱼：同雌鱼。加1ml D-hanks液稀释。n n将稀释精子加入卵子中。卵细胞的分离及培养n n用用D-HanksD-Hanks溶液洗去卵巢周围附带的脂肪、结缔溶液洗去卵巢周围附带的脂肪、结缔组织及血块等杂质。组织及血块等杂质。n n将部分卵巢置于一装有新鲜将部分卵巢置于一装有新鲜DD一一HanksHanks

29、溶液的培养溶液的培养皿中，用眼科镊小心撕开卵巢外膜并轻轻抖动，同皿中，用眼科镊小心撕开卵巢外膜并轻轻抖动，同时用另一眼科镊将卵细胞从结缔组织中剥离。时用另一眼科镊将卵细胞从结缔组织中剥离。n n当卵细胞基本从卵巢中分散出来后，用移液管轻轻当卵细胞基本从卵巢中分散出来后，用移液管轻轻吹打卵细胞吹打卵细胞5 5一一1010次至卵细胞单个分离。次至卵细胞单个分离。n n用用DD一一HankSHankS溶液洗涤分离好的卵细胞溶液洗涤分离好的卵细胞2 2一一3 3次。次。n n卵细胞培养取卵细胞培养取2020一一3030个卵细胞于直径个卵细胞于直径n n35mm35mm无菌培养皿中，加人无菌培养皿中，加人3ml3ml培养液，封口，于培养液，封口，于培培n n养箱内养箱内2727、饱和湿度条件下成熟培养、饱和湿度条件下成熟培养18h18h。