琼脂糖凝胶电泳检测dna.ppt

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1、琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测DNA丁新伦丁新伦【一】背景知背景知识凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术；分离、鉴定和提纯核酸首选的标准方法。分离、鉴定和提纯核酸首选的标准方法。根据制备凝胶的材料:琼脂糖电泳琼脂糖电泳凝胶电泳 聚丙烯酰胺电泳【二二】实验目的目的n学学习琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳分离泳分离DNA的原理和方法的原理和方法n检测碱裂解法提取碱裂解法提取质粒的粒的结果果n检测双双酶切法切法鉴定重定重组质粒的粒的结果果n检测PCR法法鉴定重定重组质粒的粒的结果果【三三】实验原理原理（1）某物）某物质质在在电场电场作用下的迁移速度叫做作用下的迁移速度叫做电电泳泳的速率，的速率，电

2、电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。泳的速率与核酸分子大小和构型有关。DNADNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。作用下向正极泳动。分子分子质质量越小跑得越快，量越小跑得越快，紧紧密构型快于松散型开密构型快于松散型开环环分子或分子或线线性分子，从而可性分子，从而可以分离大小不同的以分离大小不同的DNA或或RNA分子。分子。（2 2）琼脂糖是一种）琼脂糖是一种线性多糖聚合物线性多糖聚合物，可以形成具有刚，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就

3、越强。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。琼脂糖浓度琼脂糖浓度琼脂糖浓度琼脂糖浓度(%)(%)线型线型线型线型DNADNA分子的分离范围分子的分离范围分子的分离范围分子的分离范围(Kb)(Kb)0.30.35 560600.60.61 120200.70.70.80.810100.90.90.50.57 71.21.20.90.96 61.51.50.20.23 312.012.00.10.12 2配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。分子大小来确定。（3 3）溴化乙）溴化乙锭为扁平状分子，在紫外光照射扁平状分子，在紫外光照射下下发

4、射射荧光。光。EBEB可与可与DNADNA分子形成分子形成EB-DNAEB-DNA复复合物，其合物，其荧光光强度与度与DNADNA的含量成正比。据的含量成正比。据此可判断此可判断DNADNA分子量大小和粗略估分子量大小和粗略估计样品品DNADNA浓度。度。琼脂糖是一种线性多糖聚合物。琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。琼脂糖浓度琼脂糖浓度琼脂糖浓度琼脂糖浓度(%)(%)线型线型线型线型DNADNA分子的分离范围分子的分离范围分子的分离范围分子的分离范围(Kb)(Kb)0.30.35 560600.60.61 120200.70

5、.70.80.810100.90.90.50.57 71.21.20.90.96 61.51.50.20.23 312.012.00.10.12 2【四】仪器、材料与试剂质粒粒样品、品、酶切切样品和品和PCRPCR样品。品。凝胶凝胶电泳系泳系统和和电泳泳图像分析系像分析系统(凝胶成凝胶成像系像系统)等。等。琼脂糖、脂糖、1XTBE电泳泳缓冲液冲液、溴化乙溴化乙锭、6X载样缓冲液冲液（6Xloadingbuffer）和）和DNA分子量分子量标准（准（LambdaDNA/EcoRI+HindIIIMarker）等。）等。凝胶凝胶电泳系泳系统DYY-6C型型双稳定时电泳仪电源（北京六一）双稳定时电泳

6、仪电源（北京六一）输出范围（显示分辨率）：6-600V(1V)4-400mA(1mA)240W美国美国Bio-rad伯乐伯乐小型水平电泳槽小型水平电泳槽Mini-SubCellGTCell凝胶成像分析系凝胶成像分析系统LambdaDNA/EcoRI+HindIIIMarker（Ferments）一个已知分子质量的一个已知分子质量的DNA样品做最对照，样品做最对照，用来确定待测样品的用来确定待测样品的相对分子质量。相对分子质量。常用电泳缓冲液常用电泳缓冲液 缓冲液缓冲液缓冲容量缓冲容量迁移速度迁移速度分辨率分辨率用途用途TAETAE最低最低最快最快(高高1010)高分子量高分子量高高高度复杂高度

7、复杂DNA混合混合物；超螺物；超螺旋旋DNATBETBE很高很高较慢较慢低分子量低分子量高高价格昂价格昂贵，不贵，不常用常用TPETPE电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400400组成上样缓冲液。组成上样缓冲液。作用：作用：增加样品比重，以确保增加样品比重，以确保DNADNA均匀沉入加样孔均匀沉入加样孔内。内。形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。度和位置。使样品呈色，使加样操作更方便。使样品呈色，使加样操作更方便。上样缓冲液上样缓冲液溴化乙锭溴化乙溴化乙

8、锭（3 3，8-8-二氨基二氨基-5-5-乙基乙基-6-6-苯基菲苯基菲啶溴溴盐EthidiumEthidiumBromideBromide，EBEB），EBEB染色（染色（EB可很好地可很好地掺入到双入到双链DNA中），在紫外光下会中），在紫外光下会发出橙出橙红色色的的荧光，用于光，用于对DNA进行染色和行染色和观察。察。用于用于观察的紫外光有种波察的紫外光有种波长，一般使用中波紫外，一般使用中波紫外光（）。光（）。短波紫外光（）短波紫外光（）观察效果察效果较好，但好，但对DNA的破的破环很大。很大。长波紫外光（）：回收。波紫外光（）：回收。EBEB染染料料优点点：染染色色操操作作简便便，快

9、快速速，室室温温下下15-2015-20minmin；不不会会使使核核酸酸断断裂裂；灵灵敏敏度度高高，1010ngng或或更更少少的的DNADNA即即可可检出出；可可以以加加到到样品品中或胶中。中或胶中。EBEB是是诱变剂，使使用用时一一定定要要戴戴手手套套。EBEB废液要液要经过处理才能理才能丢弃。弃。SYBR:SYBR:新新型型低低毒毒，高高灵灵敏敏度度染染料料，加加入入样品品中，价格中，价格较昂昂贵。【五】实验步骤1.1.制备琼脂糖凝胶（制备琼脂糖凝胶（1%1%）2.2.制制备凝胶板凝胶板3.3.加加样4.4.电电泳泳 5.5.染色染色6.6.结结果果观观察察 （1）制）制备凝胶和胶板凝

10、胶和胶板：45琼脂糖（脂糖（三角瓶三角瓶），），煮胶，溶解，煮胶，溶解，冷却至冷却至60(不不烫手手)，倒板，倒板(4-6mm)，室温，室温下充分凝固，下充分凝固，竖直拔下梳子直拔下梳子。胶板胶板设计（44人）：人）：每18孔胶板（5人X3样品+1marker），8胶板每8孔胶板（2人X3样品+1marker），2胶板（2）加加样：5l质粒粒DNA+1lloadingbuffer，混匀混匀15lPCR产物物+3lloadingbuffer，混匀，混匀10l酶切切产物物+2lloadingbuffer，混匀，混匀6lDNAMark（每板胶加一孔）（每板胶加一孔）（3）电泳泳：电压3-5V/cm，约80-90V，注意，注意电极方向极方向（4）染色）染色：EB染色染色约15min（5）观察：紫外透射分析察：紫外透射分析仪下下观察。察。【六】实验结果