《药基基因工程》PPT课件.ppt

《《药基基因工程》PPT课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《药基基因工程》PPT课件.ppt（86页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、基因工程技术基因工程技术(Genetic engineering)2.2.基因工程（基因工程（genetic engineeringgenetic engineering）：在分）：在分子水平上用人工方法提取或制备子水平上用人工方法提取或制备DNADNA，在体外切割，在体外切割，与载体连接成重组体，然后采用一定方法把重组与载体连接成重组体，然后采用一定方法把重组的的DNADNA分子导入受体细胞，使外源分子导入受体细胞，使外源DNADNA在受体细胞在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要表达不同的蛋中进行复制与表达，按人们的需要表达不同的蛋白产物或定向的创造生物的新性状，并使之稳定白产物或定向的

2、创造生物的新性状，并使之稳定的遗传给子代。的遗传给子代。一、基本概念一、基本概念1.1.基因（基因（genegene）：是生物体传递遗传信息和表）：是生物体传递遗传信息和表达遗传信息的基本单位。目前认为它是合成有功达遗传信息的基本单位。目前认为它是合成有功能的蛋白质或能的蛋白质或RNARNA所必需的全部核苷酸序列。所必需的全部核苷酸序列。l分：目的基因的获取、载体的选择分：目的基因的获取、载体的选择l切：限制性内切酶的应用切：限制性内切酶的应用l接：用连接酶将目的基因和载体连接重组体接：用连接酶将目的基因和载体连接重组体l转：将重组体导入到受体细胞转：将重组体导入到受体细胞l筛：采用适当的方筛

3、选出含有目的基因的阳性克隆筛：采用适当的方筛选出含有目的基因的阳性克隆l表：目的基因在受体细胞表达，获取表达产物表：目的基因在受体细胞表达，获取表达产物二、基因工程的基本程序：二、基因工程的基本程序：分、切、接、转、筛、表分、切、接、转、筛、表GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAG分分分分切切切切接接接接转转转转筛筛筛筛表表三、基因工程实验特点及要求三、基因工程实验特点及要求l1.微量操作微量操作 l 2.连续性操作连续性操作 l 3.低温操作低温操作 l 4.防止污染（杂质污染、细菌污染）防止污染（杂质污染、细菌污染）l 5.实验物品切忌乱扔乱丢实验物品切忌乱扔乱丢 l 6.认真写

4、好实验纪录认真写好实验纪录l第一次实验第一次实验:质粒质粒DNADNA大量制备、浓度分析大量制备、浓度分析l第二次实验：第二次实验：DNADNA限制性内切酶消化、电泳、片段限制性内切酶消化、电泳、片段回收、重组连接回收、重组连接l第三次实验：重组质粒的转化、第三次实验：重组质粒的转化、PCRPCR l第四次实验：重组质粒的鉴定（质粒第四次实验：重组质粒的鉴定（质粒DNADNA小量快速小量快速制备）、杂交制备）、杂交l第五次实验：显色、考试第五次实验：显色、考试实验一实验一 质粒质粒DNADNA大量制备、浓度及纯度分析大量制备、浓度及纯度分析l目的：获得高浓度、高纯度的质粒目的：获得高浓度、高纯

5、度的质粒DNADNA。为。为酶切和基因转染作准备。酶切和基因转染作准备。质粒质粒 （plasmidplasmid）：）：存在于细菌染色体存在于细菌染色体外的环状双链外的环状双链DNA,DNA,能在宿主细胞内独立自主复能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些会赋予宿主细胞一些遗传性状。遗传性状。载体的选择标准载体的选择标准l能自主复制；能自主复制；l具有遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；具有遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；l有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；一酶切位点，称

6、为多克隆位点；l分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNA。基本步骤：基本步骤：l细菌的生长和质粒的扩增细菌的生长和质粒的扩增:将表达质将表达质粒粒DNADNA的活细菌进行大量培养。的活细菌进行大量培养。l细菌的采集和裂解细菌的采集和裂解,抽提质粒抽提质粒DNADNA：碱变性法提质粒碱变性法提质粒 ；l质粒质粒DNADNA的提纯的提纯:除蛋白质、除蛋白质、RNARNA和与质粒和与质粒DNADNA分子量相近的断裂染色体分子量相近的断裂染色体DNA DNA。碱变性抽提质粒碱变性抽提质粒DNA原理：原理：l利用质粒利用质粒DNADNA与染色体与染色体DNADNA分子大小不同，变性和分

7、子大小不同，变性和复性的差异。复性的差异。l在的在的NaOH-SDSNaOH-SDS环境下，质粒环境下，质粒DNADNA与染色体与染色体DNADNA的氢的氢键均破坏，但是染色体键均破坏，但是染色体DNADNA断裂成线状，而质粒断裂成线状，而质粒DNADNA仍为闭环，且相互缠绕没有分开。当仍为闭环，且相互缠绕没有分开。当pHpH调整到，调整到，质粒质粒DNADNA复性存在溶液中，而染色体复性存在溶液中，而染色体DNADNA不能复性不能复性与变性的蛋白质、与变性的蛋白质、SDSSDS相互缠绕形成沉淀，经离心相互缠绕形成沉淀，经离心被分离。被分离。质粒质粒DNA的纯化：的纯化：l蛋白质的清除：蛋白质

8、的清除：蛋白质的变性剂蛋白质的变性剂酚和氯仿酚和氯仿.lRNARNA的清除：的清除：RNARNA酶消化；酶消化；LiClLiCl沉淀沉淀;层析层析。l与质粒分子量相近的线状断裂的染色体与质粒分子量相近的线状断裂的染色体DNADNA的清除：的清除：等体积等体积NaCl,13%PEG;CsClNaCl,13%PEG;CsCl梯度超速梯度超速离心等离心等。CsCl密度梯度超速离心法：密度梯度超速离心法：lCsClCsCl是一种高分子量的重金属盐，在较长时间超速离心是一种高分子量的重金属盐，在较长时间超速离心后，形成浓度梯度，当后，形成浓度梯度，当DNADNA的沉降速度与扩散速度达到的沉降速度与扩散速

9、度达到平衡时，染色体平衡时，染色体DNADNA、质粒、质粒、RNARNA等各分离颗粒，在密度等各分离颗粒，在密度梯度中沉降或漂浮。他们在密度梯度中的位置分布不依梯度中沉降或漂浮。他们在密度梯度中的位置分布不依据沉降速率、分子大小及离心时间，而是取决于密度。据沉降速率、分子大小及离心时间，而是取决于密度。EBEB是一种丫啶类染料，可嵌入双链是一种丫啶类染料，可嵌入双链DNADNA的碱基之间，使的碱基之间，使DNADNA的解旋体积增大，浮力密度变小。的解旋体积增大，浮力密度变小。EBEB与环状质粒与环状质粒DNADNA的结合量小于线状染色体的结合量小于线状染色体DNADNA的结合量，故质粒的结合量

10、，故质粒DNADNA的浮的浮力密度大与线状染色体力密度大与线状染色体DNA,DNA,位于离心管的下层。位于离心管的下层。RNARNA总总是与是与Cs+Cs+结合，密度最大，超离时位于管底。结合，密度最大，超离时位于管底。Sepharose 2B柱层析法（琼脂糖凝胶柱）柱层析法（琼脂糖凝胶柱）l利用分子筛效应，分子量大的分子不能利用分子筛效应，分子量大的分子不能进入凝胶颗粒网孔，顺着颗粒间隙先流进入凝胶颗粒网孔，顺着颗粒间隙先流出，分子量小的分子进入凝胶颗粒孔经出，分子量小的分子进入凝胶颗粒孔经内，流程长，后流出来。质粒内，流程长，后流出来。质粒DNADNA分子分子量大于量大于RNARNA，故先

11、洗脱下来。，故先洗脱下来。LiClLiCl沉淀法：沉淀法：Li+Li+可与可与RNARNA结合，形成锂结合，形成锂盐沉淀，而盐沉淀，而DNADNA不与锂结合，故经离心不与锂结合，故经离心可将二者分离。注意在变性阶段，操作可将二者分离。注意在变性阶段，操作要温柔，不要使染色体要温柔，不要使染色体DNADNA断裂。断裂。聚乙二醇沉淀法：聚乙二醇沉淀法：只沉淀环状只沉淀环状DNADNA操作步骤操作步骤:收集细菌收集细菌GET悬浮悬浮SDS-NaOH碱变性碱变性KAc质粒质粒DNA完全复性完全复性染色体染色体DNA不能复性不能复性离心离心上清上清:质粒质粒,小分子小分子RNA,少量蛋白质少量蛋白质 沉

12、淀沉淀:染色体染色体DNA,大分子大分子RNA,SDS-蛋白质复合物蛋白质复合物取上清取上清,加等体积异丙醇加等体积异丙醇沉淀沉淀DNA(缩小体积缩小体积)离心离心沉淀溶于沉淀溶于TE等体积等体积LiCl沉淀沉淀RNA离心离心加等体积酚加等体积酚氯仿异戊醇氯仿异戊醇去杂蛋白去杂蛋白离心离心,取上取上层水相层水相酚氯仿异戊醇酚氯仿异戊醇重复一次重复一次离心离心,取上取上层水相层水相2 2倍体积倍体积无水乙醇无水乙醇体积体积NaAc沉淀沉淀DNA离心离心70%乙醇乙醇清洗沉淀清洗沉淀晾干晾干TE(50ul)溶溶解沉淀解沉淀取取5ul电电泳鉴定泳鉴定取上清取上清,加等体积加等体积异丙醇沉淀异丙醇沉淀

13、DNA(缩小体积缩小体积)离心离心沉淀溶于沉淀溶于500ul TE，RNA酶消化酶消化30minDNA片段的琼脂糖凝胶电泳分离片段的琼脂糖凝胶电泳分离l原理以琼脂糖为电泳支持物，原理以琼脂糖为电泳支持物，DNADNA因分子大小、形状、构象不同，因分子大小、形状、构象不同，在相同的电泳条件下，因迁移率不同而被分离。在相同的电泳条件下，因迁移率不同而被分离。DNADNA可与荧光染料可与荧光染料溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）结合，在紫外灯照射下呈桔红色荧光条带。）结合，在紫外灯照射下呈桔红色荧光条带。DNADNA可与荧光染料可与荧光染料GoldviewGoldview结合，在紫外灯照射下呈绿色荧光条

14、带。结合，在紫外灯照射下呈绿色荧光条带。l琼脂糖凝胶电泳的优点：操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理；琼脂糖凝胶电泳的优点：操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理；琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98-9998-99），近似自由电泳，），近似自由电泳，样品扩散较自由电泳小，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率高，样品扩散较自由电泳小，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；凝胶透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用字外监重复性好；凝胶透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用字外监测及定量测定；区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定，制成干测及定量测定；区

15、带易染色，样品易洗脱，便于定量测定，制成干膜可长期保存。膜可长期保存。DNA的琼脂糖凝胶电泳影响因素：的琼脂糖凝胶电泳影响因素：l1.1.核酸分子大小：迁移率与分子量的对数成反比，核酸分子大小：迁移率与分子量的对数成反比，但当但当20kb20kb时，迁移率不在依赖于分子大小；时，迁移率不在依赖于分子大小；l2.2.核酸构型核酸构型:分子量相同的情况下，共价闭环分子量相同的情况下，共价闭环DNADNA直线直线DNADNA开环环状开环环状DNA DNA l3.3.与凝胶浓度关系与凝胶浓度关系:一定大小的一定大小的DNADNA在不同凝胶浓在不同凝胶浓度中迁移率不同；度中迁移率不同；l4.4.其它影响

16、因素：缓冲液的成分、离子强度及电其它影响因素：缓冲液的成分、离子强度及电压（压（5v/cm5v/cm）等）等DNA浓度及纯度分析浓度及纯度分析:紫外分光光度法紫外分光光度法l双链双链DNA:1OD260nm=50ug/mll单链单链DNA或或RNA:1OD260nm=40ug/mll核苷酸核苷酸:1OD260nm=20ug/mlRNA:OD260nmOD280nmDNA:OD260nmOD280nm1.7,RNA污染污染1.7,蛋白质污染蛋白质污染结果分析：结果分析：线状线状DNA超螺旋超螺旋DNA第二次试验：构建重组第二次试验：构建重组DNAl载体的酶切消化载体的酶切消化l酶切产物琼脂糖凝胶

17、电泳酶切产物琼脂糖凝胶电泳lDNADNA片段回收片段回收l目的基因、载体重组连接目的基因、载体重组连接一、质粒一、质粒DNA的限制性内切酶消化酶解的限制性内切酶消化酶解 l原理原理 限制性内切酶（限制性内切酶（restriction enzymerestriction enzyme）是）是细菌体内含有的一类能特异识别双链细菌体内含有的一类能特异识别双链DNADNA分子的特分子的特定序列，并对其进行切割的核酸内切酶。共有三定序列，并对其进行切割的核酸内切酶。共有三类，其中二类因其有固定的切割位点，只有酶限类，其中二类因其有固定的切割位点，只有酶限制性无修饰性，不需要制性无修饰性，不需要ATPAT

18、P，实用性大，是基因工，实用性大，是基因工程常用工具酶之一。程常用工具酶之一。l作用：作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源限制外源DNA，保护自身保护自身DNA。l其识别序列特点及酶切产物：其识别序列特点及酶切产物：4-6bp4-6bp，回文结构；，回文结构；粘性末端或平端粘性末端或平端BamHBamHGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口l命名方式（以命名方式（以Hind III为例）：为例）：属：属：HHaemaphilus

19、种：种：ininfluenza 株：株：d株株 编号：编号：同功异源酶同功异源酶 来来源源不不同同的的限限制制酶酶，但但能能识识别别和和切切割割同一位点，这些酶称同一位点，这些酶称同功异源酶同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst同尾酶同尾酶 有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然识识别别序序列列不不完完全全相相同同，但但切切割割DNA后后，产产生生相相同同的的粘粘性性末末端端，称称为为同同尾尾酶酶。这这两两个个相相同同的的粘粘性性末末端端称称为为配配伍未端伍未端(compatible end)。Ba

20、m Bam HHBg Bg l l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT Al限制性内切酶（）单位及实际用量：限制性内切酶（）单位及实际用量：在限定的温度和反应环境中，小时消化在限定的温度和反应环境中，小时消化1ugDNA1ugDNA所需的酶量为一个酶单位。由于种种原所需的酶量为一个酶单位。由于种种原因，一般使用因，一般使用3-5u/ugDNA3-5u/ugDNA，延长小时以上，延长小时以上，是酶切反应更彻底。是酶切反应更彻底。lRERE保存条件保存条件：50%50%甘油中，用时需稀释甘油中，用时需稀释1010倍以倍以上才

21、能解除抑制。上才能解除抑制。酶切系统组成及计算方法：酶切系统组成及计算方法：根据根据DNADNA量计算酶量计算酶的用量，再计算酶切系统总体积、缓冲液和水的的用量，再计算酶切系统总体积、缓冲液和水的用量。用量。质粒质粒DNA10ug(10ul)1ug/ull 10 l RE 30-50U(1.5-2.5ul)20U/ull d3H2O 6ulll 总体积总体积15-25ul l 加样顺序：先加水，再加加样顺序：先加水，再加buffer和和DNA，最后加酶，最后加酶操作步骤：操作步骤：l质粒质粒DNA 20ul(10ug)l10 buffer 3 ull Xbal 1.5 ul(30U)l Hin

22、d III 1.5ul(30U)l d3H2O 4ulll 总体积总体积 30ul l加样，短暂离心，加样，短暂离心，370C水浴消化。水浴消化。三、三、DNA片段回收及纯化片段回收及纯化lDEAE纤维素膜的电泳回收方法纤维素膜的电泳回收方法：紧靠目的：紧靠目的DNA片段前方切一裂隙，将一条片段前方切一裂隙，将一条DEAE纤维素膜插入纤维素膜插入裂隙中，继续电泳直至条带中所有的裂隙中，继续电泳直至条带中所有的DNA均收集到均收集到膜上，然后从裂隙取出膜，用低离子强度的缓冲液膜上，然后从裂隙取出膜，用低离子强度的缓冲液洗掉污染物，最后在高离子强度的缓冲液中将洗掉污染物，最后在高离子强度的缓冲液中

23、将DNA洗脱下来。此方法简单，可同时用于许多片段，且洗脱下来。此方法简单，可同时用于许多片段，且获得的获得的DNA极纯，但仅适用于小片段极纯，但仅适用于小片段DNA（15Kb的的DNA片段和单链片段和单链DNA不不适合，因难以洗脱下来。适合，因难以洗脱下来。三、三、DNA片段回收及纯化片段回收及纯化l透析袋电洗脱法：透析袋电洗脱法：将含有将含有DNADNA片段的凝胶切下置于充满片段的凝胶切下置于充满1xTAE1xTAE的的透析袋中，使凝胶块沉下，去掉大部分缓冲液，在凝胶上方透析袋中，使凝胶块沉下，去掉大部分缓冲液，在凝胶上方夹紧透析袋，不留气泡，将透析袋浸泡在夹紧透析袋，不留气泡，将透析袋浸泡

24、在1xTAE1xTAE电泳槽中，电电泳槽中，电泳泳2-32-3小时，使小时，使DNADNA从凝胶中电洗脱下来。此法可以回收大小从凝胶中电洗脱下来。此法可以回收大小范围较宽的范围较宽的DNADNA，但很不方便。，但很不方便。l从低溶点琼脂糖凝胶中回收从低溶点琼脂糖凝胶中回收DNADNA：琼脂糖的糖链上引入了羟乙琼脂糖的糖链上引入了羟乙基，在基，在30300 0C C左右成胶，大约在左右成胶，大约在65650 0C C熔化，在大多数双链熔化，在大多数双链DNADNA熔熔点温度以下。点温度以下。l采用挖槽法采用挖槽法l酚冻法酚冻法。纯化：纯化：lSephacelSephacel柱层析法：将带负电荷的

25、柱层析法：将带负电荷的DNADNA结合到一种阳离子基质上而将污染物洗结合到一种阳离子基质上而将污染物洗脱下来，在提高缓冲液的离子强度将脱下来，在提高缓冲液的离子强度将DNA DNA 洗脱下来。洗脱下来。l2.2.有机溶剂抽提法：有机溶剂抽提法：用用2-2-丁醇和丁醇和酚氯酚氯仿抽提仿抽提。l制胶制胶l点样点样l电泳分离电泳分离l回收片段回收片段l抽提沉淀抽提沉淀DNA。操作步骤操作步骤:结果分析：结果分析：l分子量标准：分子量标准：噬菌体的噬菌体的DNA，全长，经，全长，经Hind消化产生消化产生7条带，条带，l完全酶解的质粒有两条带及目的基因和载体，分完全酶解的质粒有两条带及目的基因和载体，

26、分别为和，应位于别为和，应位于1.98 和及之间和及之间l溴酚蓝前的绿色带为溴酚蓝前的绿色带为RNAl若酶解未完全可能出现超螺旋、线性、开环三种若酶解未完全可能出现超螺旋、线性、开环三种构象。构象。开环开环线性线性超螺旋超螺旋 marker plasmidRE digested四、四、DNA片段的重组连接片段的重组连接l原理原理 1.1.在在T T4 4DNADNA连接酶的催化下，载体基因片段与连接酶的催化下，载体基因片段与目的基因片段的粘性末端共价结合目的基因片段的粘性末端共价结合,连接连接,环化成环化成重组环状重组环状DNADNA分子。分子。l2.2.连接方式：粘接、平接、尾接、人工接头器

27、连接方式：粘接、平接、尾接、人工接头器l3.3.影响重组连接因素影响重组连接因素:目的基因的浓度与载体目的基因的浓度与载体的比例的比例(3-5:1)(3-5:1)；离子浓度；温度：；离子浓度；温度：14-1614-160 0C C。l连接酶单位：用连接酶单位：用WeissWeiss单位对酶进行标化：单位对酶进行标化：1 1个个WeissWeiss单位指在单位指在37370 0C C下下2020分钟内催化分钟内催化1nmol1nmol3232PiPi从焦磷酸根置换到从焦磷酸根置换到,-,-3232PiATPPiATP所需的酶量。所需的酶量。（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接1.

28、1.粘性末端连接粘性末端连接 方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接 配伍末端连接配伍末端连接 非配伍末端连接非配伍末端连接Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam H切割切割载体载体DNA用用Bam H切割切割重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同同一一限限制制酶酶切切位位点点连连接接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接Eco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点+Ec

29、oR+Bg l双酶切双酶切Eco R+Bg l双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体 配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。2.平端连接平端连接 适用于：适用于：限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连3.同聚物加尾连接同聚物加尾连接 在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的作的作

30、用下，在用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。造出粘性末端，再进行粘端连接。5335载体载体DNA5335目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶53 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT355 3 35 5 3 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+dATP末端转移酶末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体4.4.人工接头人工接头(linker)连接：连接：由平端加上新的酶切位点

31、，再用限制酶切除由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接产生粘性末端，而进行粘端连接。人人工工接接头头及及其其应应用用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R连接体系连接体系l目的基因：8ull载体质粒 2ullT4 DNA连接酶 1ull水 总体积：15ul第三次实验第三次实验 感受态细菌的制备及转化实验感受态细菌的制备及转化实验l原理原理 l1.1.将重组将重组DNADNA分子导入受体细菌中进行复制扩增，分子导入受体细菌中进行复制扩增，再进行检测，以获得正确的阳性重组体。再进行检测，以获得正确的阳性重组体。将重组将重组

32、DNADNA导入受体细胞的过程中叫做转化或转染。导入受体细胞的过程中叫做转化或转染。一般一般受体细菌对重组受体细菌对重组DNADNA分子的摄取能力很低，难以转分子的摄取能力很低，难以转化成功。后来人们发现，用氯化钙处理后的细菌化成功。后来人们发现，用氯化钙处理后的细菌细胞对细胞对DNADNA的摄取能力大为增加，转化效率提高。的摄取能力大为增加，转化效率提高。这种这种细菌细胞能摄取外来细菌细胞能摄取外来DNADNA的生理状态称为感受的生理状态称为感受态态，此阶段的细菌称感受态细菌。，此阶段的细菌称感受态细菌。l2.2.感受态形成假说：感受态形成假说：局部原生质体假说：用特定的化学或物理因素局部原

33、生质体假说：用特定的化学或物理因素处理细胞后，局部的细胞壁被破坏，形成一些处理细胞后，局部的细胞壁被破坏，形成一些小孔，允许外来小孔，允许外来DNADNA分子进入。分子进入。酶酶-受体假说：用特定的化学或物理因素处理受体假说：用特定的化学或物理因素处理细胞后，细胞壁是完整的，但在壁上产生了一细胞后，细胞壁是完整的，但在壁上产生了一些酶的位点，可以把外来些酶的位点，可以把外来DNADNA转入胞内。转入胞内。l3.3.制备方法：制备方法：l电击法电击法:将细菌置入一定的容器内，通入高将细菌置入一定的容器内，通入高脉冲电压，使细菌处于感受态，此法成功效脉冲电压，使细菌处于感受态，此法成功效率高，可达

34、率高，可达10101010/1ugDNA/1ugDNA，但细胞容易死亡，但细胞容易死亡，约一半以上的细胞死亡。约一半以上的细胞死亡。l化学法：如：化学法：如：Ca2+、DMSO、还原剂、氯化还原剂、氯化六氨合高钴等，成功率可达六氨合高钴等，成功率可达105-8/ug DNA。4.受体菌的改造与选择：受体菌的改造与选择：l限制与修饰系统：限制与修饰系统：R-,M-R-,M-或或R-,M+R-,M+的突变体，（的突变体，（R R：restriction;M:modificationrestriction;M:modification）l重组系统：选用重组系统：选用rec+rec+的转化（提高转化效

35、率），的转化（提高转化效率），再转到再转到rec-rec-受体菌中保存（防治整合到染色体受体菌中保存（防治整合到染色体DNADNA基因组中去）。基因组中去）。l有明显的选择性差异：例如，载体有明显的选择性差异：例如，载体Ampr,Ampr,目的基目的基因因StrrStrr，应选择，应选择Amps/StrsAmps/Strs的受体菌。的受体菌。l空菌空菌l选择能够发展成为感受态细胞的菌株做受体菌：选择能够发展成为感受态细胞的菌株做受体菌：肺炎双球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母系统。肺炎双球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母系统。转化时期选择：转化时期选择：l细菌生长时相分为：静细菌生长时相分为：静止期、

36、对数生长期、稳止期、对数生长期、稳定期和衰亡期。定期和衰亡期。l转化最佳时期应选择在转化最佳时期应选择在对数生长期的后期对数生长期的后期。OD550nm（5-6 108细胞细胞/ml）5.转化：外来转化：外来DNA进入细菌内部的过程。进入细菌内部的过程。l具体过程：具体过程：a.吸附：吸附：dsDNA吸附在细菌表面；吸附在细菌表面；b.转入：一转入：一条条ssDNA进入细胞并被蛋白质保护起来，另一条降解；进入细胞并被蛋白质保护起来，另一条降解；c.自稳：自稳：ssDNAdsDNA；d.复制表达复制表达l*在革兰氏阴性菌中，产生感受态因子，并将在革兰氏阴性菌中，产生感受态因子，并将dsDNA吸附

37、吸附到胞壁上；在革兰式阳性菌中，因没有分离到感受态因子，到胞壁上；在革兰式阳性菌中，因没有分离到感受态因子，DNA以双链进入。以双链进入。l现选用一种常用制备感受态细菌的方法（现选用一种常用制备感受态细菌的方法（CaCl2），供实验），供实验应用。细菌在低渗的应用。细菌在低渗的CaCl2溶液中逐渐膨胀成球形，溶液中逐渐膨胀成球形，DNA与与Ca2+形成羟基钙磷酸复合物，被吸附在细菌表面，形成羟基钙磷酸复合物，被吸附在细菌表面，细菌经短暂热休克刺激被细菌摄取。细菌经短暂热休克刺激被细菌摄取。l操作步骤：（见讲义，穿插PCR、southern转膜）l注意事项：1.冰浴操作，增加感受态量及延长感受态

38、时间。l 2.无菌操作，防止杂菌污染。l 3.试剂要求纯度高l 4.重组时的高盐，在转化时要稀释l 5.涂皿时不要来回涂布预期结果及结果分析：预期结果及结果分析：l1.正常结果：空白对照不长菌，阳性对照和重组组长菌。l2.所有的皿都不长菌：转化系统有问题。l3.都长菌：试剂或操作过程中被污染。l4.连接不成功。PCR。PCR(polymerase chain reaction)聚合酶链反应，聚合酶链反应，其原理是其原理是依据细胞中DNA半保留复制机理，DNA在不同温度下变性、复性的特性，人为控制温度高温变性、低温复性、适温延伸，循环多次后，可使目的基因得到扩增。以待扩增的DNA分子为模板，以一

39、对分别于模板5末端和3末端互补配对的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸至完成新的DNA合成，重复这一过程（变性、退火、延伸），即可使目的DNA片段得到扩增。5 引物引物A5 引物引物B第二次循环第二次循环第一次循环第一次循环5 5 5 5 5 5 模板模板DNA5 5 5 5 5 5 5 5 一、基本工作原理一、基本工作原理2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。第三次循环第三次循环5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 lPCR反应体系的基本成分反应体系的基本成分：模

40、板DNA（ng，无严格要求）；特异性引物（通常）；DNA聚合酶（）；dNTP(20-200umol/L)；含Mg2+的缓冲液（Mg2+1.5mmol/L,Tris-HCl pH8.3-8.8,KCl50mmol/L,明胶0.1%,甲酰胺5%）lPCR的基本反应步骤：的基本反应步骤：变性，退火、延伸，可循环25-30次，扩增效率为P=A*(1+X)n三、三、PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5Cl主要用途：主要用途：目的基因克隆；基因的体外突变；DNA的微量分析lPCR的特点：的特点：高度的敏感性；高度的特异性；操作简便，快速；广泛的适用性lPCR在医学

41、中的应用：在医学中的应用：遗传性疾病的基因诊断；病原体的检测；癌基因与抑癌基因的检测；在法医学上的应用。lPCR引物设计原则：引物设计原则：引物长度15-30bp；GC含量40%-55%；Tm高于550C；引物与模板非特异性配对的配对率70%;引物之间配对的碱基数3；引物自身配对15kb)(15kb)转移不转移不完全完全,转移效率取决于在其脱水前离开凝胶的分子所占比例。转移效率取决于在其脱水前离开凝胶的分子所占比例。先经弱酸作用引起部分脱嘌呤作用，然后用强碱处理水解先经弱酸作用引起部分脱嘌呤作用，然后用强碱处理水解脱嘌呤部位的磷酸二酯键，产生的脱嘌呤部位的磷酸二酯键，产生的DNADNA片段可高

42、效率转移片段可高效率转移,双链变成单链双链变成单链.lSouthernSouthern转移：毛细管转移转移：毛细管转移(转移的速率取决于转移的速率取决于DNADNA片断的片断的大小和凝胶中琼脂糖的浓度）；电转移；真空转移。大小和凝胶中琼脂糖的浓度）；电转移；真空转移。l制备探针：制备探针：DNADNA的切口平移（利用的切口平移（利用DNADNA聚合酶具有聚合酶具有3355聚合活性和聚合活性和5533外切酶活性进行标记）；随机引物合外切酶活性进行标记）；随机引物合成成l预杂交，杂交及杂交信号检测预杂交，杂交及杂交信号检测Dot blot(斑点杂交）斑点杂交）lDNA转移固化转移固化l探针标记探针

43、标记l杂交杂交l免疫检测免疫检测l一、一、DNA转移固化转移固化待检测待检测DNA的分离纯化的分离纯化DNA变性：变性：1000C 10min快速置冰浴（作系快速置冰浴（作系列稀释：列稀释：total 10ul,2ug,0.2ug,20ng,2ng,0.2ng,20pg,2pg）变性后的变性后的DNA点到点到NC膜上（膜上（NC膜先在膜先在10SSC中浸泡中浸泡30min吸去多余水分后待用）吸去多余水分后待用）800c干烤干烤1-3h,固化固化DNA后待用。后待用。l1.取取1 ug,模板模板DNA补水总体积补水总体积16ul，1000C，10min，快速置冰浴，快速置冰浴l2.混匀混匀Dig

44、-Prime(1#)混合液，加混合液，加4ul到变性模到变性模板中，短暂离心，板中，短暂离心，370C，1hourl3.加加0.2MEDTA pH 8.0 2 ul终止反应终止反应（可得（可得到到850ng新合成带新合成带dig-dUTP的探针的探针DNA）二二.探针标记探针标记 三三.杂交杂交l预热预杂交液至预热预杂交液至420C，（，（10ml/cm2）l将已固化将已固化DNA的的NC膜放入杂交袋中，加入预杂交膜放入杂交袋中，加入预杂交液，封口，液，封口，420C水浴水浴1-3小时（不时摇动）小时（不时摇动）(封闭其封闭其它位点它位点)。l变性变性dig标记探针：煮沸标记探针：煮沸5min

45、，快速置冰浴。，快速置冰浴。（32ng/ml）l将变性探针加入加入杂交液中（将变性探针加入加入杂交液中（2）混匀。混匀。l剪开杂交袋，弃去预杂交液，加入杂交液，（含变剪开杂交袋，弃去预杂交液，加入杂交液，（含变性性dig标记探针）去尽泡，重新封口。标记探针）去尽泡，重新封口。l420C，4-16hrl漂洗杂交后的漂洗杂交后的NC膜，漂洗膜，漂洗2次，次，5分钟，用分钟，用2SSC 0.1%SDS 室温，不断振荡室温，不断振荡l漂洗漂洗2次，次，15分钟，分钟，680C，用（预热）不断振摇。，用（预热）不断振摇。l用免疫检测漂洗液洗膜用免疫检测漂洗液洗膜1-5分钟分钟l加入适量封闭液，室温加入适

46、量封闭液，室温30分钟。分钟。l加入适量抗体溶液，加入适量抗体溶液，30分钟分钟l用免疫检测漂洗液洗膜用免疫检测漂洗液洗膜2次，次，15分钟分钟l用碱性磷酸梅反应液平衡用碱性磷酸梅反应液平衡2-5分钟分钟l在滤纸中加入适量显色液，将在滤纸中加入适量显色液，将NC膜放在滤纸上膜放在滤纸上（中间不留气泡），暗出显色，（中间不留气泡），暗出显色，30分钟至分钟至16小时小时四、免疫检测四、免疫检测试剂用途：试剂用途：DNA结合与硝酸纤维素滤膜的作用取决于转移缓结合与硝酸纤维素滤膜的作用取决于转移缓冲液的离子强度。冲液的离子强度。DNA片段越小，使其有效的保片段越小，使其有效的保留在硝酸纤维素滤膜上所

47、需要的离子强度越高。当留在硝酸纤维素滤膜上所需要的离子强度越高。当DNA500bp时需要时需要20 xSSC。2预杂交液：封闭探针在滤膜表面上的非特异性结预杂交液：封闭探针在滤膜表面上的非特异性结合，包括合，包括Denhardt试剂、肝素及脱脂奶粉，往往试剂、肝素及脱脂奶粉，往往与经变性并经断裂成片段的鮭精与经变性并经断裂成片段的鮭精DNA或酵母或酵母DNA以及以及SDS一类去污剂一起使用。可使背景杂交得到一类去污剂一起使用。可使背景杂交得到完全抑制。完全抑制。重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成 PCR产物产物 限制酶消化限制酶消化线性载体线性载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶 重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交