药物分析05体内药物分析.ppt

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1、药物分析药物分析药物分析药物分析主讲主讲主讲主讲:秦大伟秦大伟秦大伟秦大伟第五章第五章 体内药物分析体内药物分析第五章第五章 体内药物分析体内药物分析第五章第五章 体内药物分析体内药物分析第五章第五章 体内药物分析体内药物分析第五章第五章 体内药物分析体内药物分析第五章第五章 体内药物分析体内药物分析第五章第五章 体内药物分析体内药物分析四、体内药物分析的特点四、体内药物分析的特点五、体内药物分析方法五、体内药物分析方法第一节 常用体内样品的制备与贮藏常用样品的种类常用样品的种类(一一)血样血样:药物在体内主要依靠血液运输药物在体内主要依靠血液运输,血药浓血药浓度可作为药物在作用部位浓度的指标

2、度可作为药物在作用部位浓度的指标.血浆(plasma)血清(serum)全血(二二)唾液唾液:很少采用很少采用(三三)尿液尿液:用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度，药物代谢物及其代谢途径、类型、速率等的研究；临床上用于判断患者是否违反医嘱用药。v其它：头发、肝器组织、乳汁、精液、脑脊液、其它：头发、肝器组织、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便。泪液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便。常用样品的种类常用样品的种类采集和制备采集和制备v1、血样：一般从肘静脉采血，也可从毛细管采、血样：一般从肘静脉采血，也可从毛细管采血。每次采血血。每次采血1-5ml，动物采血时一般不超过动

3、，动物采血时一般不超过动物总血量的十分之一。物总血量的十分之一。v2、血浆：静脉离心、血浆：静脉离心5-10分钟，使与血细胞分离；分钟，使与血细胞分离；v3、血清：静脉血放置、血清：静脉血放置30-60分钟。分钟。1000g离心离心5-10分钟。分钟。v4、全血：加抗凝剂，不离心，血浆和血细胞分、全血：加抗凝剂，不离心，血浆和血细胞分布均匀。布均匀。2尿样尿样 目的：药物剂量回收，药物清除，药物代谢和目的：药物剂量回收，药物清除，药物代谢和生物利用度生物利用度 特点：浓度高，易于收集，体内代谢研究，应特点：浓度高，易于收集，体内代谢研究，应水解分水解分 离离 采集方法：随时尿、晨尿、白天尿、夜

4、间尿等，采集方法：随时尿、晨尿、白天尿、夜间尿等，定时采集。定时采集。贮藏贮藏:健康人排出的尿液颜色淡黄至黄褐色健康人排出的尿液颜色淡黄至黄褐色,pH在之间。在之间。3唾液唾液 唾液中药浓与血浓相关性密切唾液中药浓与血浓相关性密切 收集方法收集方法 濑口濑口15min钟后采集，离心钟后采集，离心 收集收集v组织采集：先取各种组织，应用匀浆器均匀化制组织采集：先取各种组织，应用匀浆器均匀化制成水性基质匀浆液，再以适当方法萃取。成水性基质匀浆液，再以适当方法萃取。v组织样品要经过蛋白沉淀：甲醇、乙腈、高氯酸、组织样品要经过蛋白沉淀：甲醇、乙腈、高氯酸、三氯乙酸沉淀。三氯乙酸沉淀。v酸、碱水解：将组

5、织水解掉酸、碱水解：将组织水解掉v酶水解：应用酶将组织水解掉酶水解：应用酶将组织水解掉v其它：头发等其它：头发等第二节 体内样品分析的前处理全血/血浆，组织(1)蛋白沉淀(2)调节pH选择性溶剂提取RIA残渣化学衍生化(提取烃基化)碱回提酸回提HPLCUV、FLD、ECDTLC分光光度法UV、FLDGCFIDECDN/P-FIDGC-MS蛋白质的去除加入与水混融的有机溶剂加入与水混融的有机溶剂(乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃)加入中性盐加入中性盐(饱和硫酸铵、硫酸钠、枸橼酸盐饱和硫酸铵、硫酸钠、枸橼酸盐)加入强酸加入强酸(三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸)

6、加入金属沉淀剂加入金属沉淀剂(CuSOCuSO4 4-Na-Na2 2WOWO4 4、ZnSOZnSO4 4-NaOH-NaOH)缀合物的水解酸水解酸水解(盐酸盐酸)酶水解酶水解(葡糖酸苷酶、硫酸酯酶、枯草菌溶素葡糖酸苷酶、硫酸酯酶、枯草菌溶素)有机破坏(硝酸硝酸-高氯酸消化高氯酸消化)分离、纯化与浓集液液-液萃取法液萃取法 (Liquid-Liquid Extraction,LLE)液液-固萃取法固萃取法 (Liquid-Solid Extraction,LSE)P181P185溶解剂法(硝酸硝酸-高氯酸消化高氯酸消化)（1）优点：）优点：与杂质分离与杂质分离 简便简便 浓集浓集提取率高提取

7、率高（2）提提取取率率：在在有有机机相相与与水水相相中中的的溶溶解解度度的的比比值值分分配配系系数数，一一般般少少量量多多次次，对对生生物物样样品品一一般般一一次次萃萃取取，70%重现性重现性（3）影响提取率的因素）影响提取率的因素 pH 碱性药物在碱性碱性药物在碱性pH 酸性酸性 酸性酸性pH 提提取取溶溶剂剂 相相似似相相溶溶原原理理 沸沸点点低低，不不影影响响检检测测,性性质稳定，不起化学反应质稳定，不起化学反应(化学惰性）化学惰性）离子强度离子强度 加入中性盐加入中性盐 增加离子强度，与水结合强，增加离子强度，与水结合强，便于有机溶剂提取便于有机溶剂提取 对于离子性特强，水溶性极大的药

8、物，可采用离子对提取对于离子性特强，水溶性极大的药物，可采用离子对提取原理原理应用应用阴离子：阴离子：COOH+SO3H-反离子反离子 四丁基铵四丁基铵阳离子：阳离子：NH2+反离子烷基或芳基磺酸盐反离子烷基或芳基磺酸盐提取溶剂用量提取溶剂用量:一般在试管中进行一般在试管中进行 有机相与水相比有机相与水相比1:1到到5:1用有机溶剂(甲醇)冲洗洗净用水冲洗活化上样用水或缓冲液冲洗，洗去内源性物质有机溶剂洗脱药物收集洗脱液固相选择固相选择 样品样品1ml 1ml规格固相规格固相 125ml 3ml规格固相规格固相固相处理固相处理 反相反相C18 固定相的固定相的610倍体积甲醇洗柱，使溶剂化倍体

9、积甲醇洗柱，使溶剂化 610倍水缓冲服液冲洗达分离状态倍水缓冲服液冲洗达分离状态上样上样分离分离 用适当的弱溶剂洗涤用适当的弱溶剂洗涤 洗去杂质，通洗去杂质，通N2干燥固相干燥固相洗脱待测物洗脱待测物 改变改变pH或极性或极性（1）流速）流速 流速快，按触不充分，样品流失流速快，按触不充分，样品流失 回收率低回收率低 柱处理柱处理 510mlmin-1 洗脱洗脱 0.21mlmin-1（300mg 25mlmin-1（300mg）（2）装样）装样 过载过载 突破性试验突破性试验 已知浓度样品液已知浓度样品液 小体积上柱小体积上柱洗脱回收百分率洗脱回收百分率 加大体积加大体积洗脱回收百分率洗脱回

10、收百分率 绘图绘图 当回收率下降时为过载当回收率下降时为过载?第四节第四节 体内样品分析方法与方法验证体内样品分析方法与方法验证(一一)、特异性、特异性 所测的物质是原型药物或特定的活性代谢物，内源性物质和响应的其他代谢物及其他药物不影响样品的测定。空白血浆空白血浆空白血浆标准物质空白血浆标准物质受试血浆受试血浆第四节第四节 体内样品分析方法与方法验证体内样品分析方法与方法验证(二二)、标准曲线与线性范围、标准曲线与线性范围6.412.819.225.6 3232.41.81.20.60茶碱(g/ml)Y10-2X+6.15310-3 ru至少6个浓度点建立标准曲线u线性范围必须覆盖全部待测浓

11、度，不得外推u最低浓度点偏差在20%u其余浓度点的偏差在 15%。(三三)精密度与准确度精密度与准确度(四四)定量下限定量下限(五五)稳定性稳定性(六六)提取回收率提取回收率(七七)质控样品质控样品(八八)质量控制质量控制(九九)测定结果测定结果第四节第四节 体内样品分析方法与方法验证体内样品分析方法与方法验证标准物标准物品？品？标准物标准物品？品？质控样质控样品？品？质控样质控样品？品？标准物标准物品？品？质控样质控样品？品？标准物标准物品？品？质控样质控样品？品？标准物标准物品？品？质控样质控样品？品？液相色谱技术简介液相色谱技术简介液相色谱技术简介液相色谱技术简介液相色谱技术简介液相色谱

12、技术简介液相色谱技术简介液相色谱技术简介液相色谱技术简介液相色谱技术简介高压输液系统高压输液系统分离系统分离系统检测系统检测系统进样系统进样系统液相色谱技术简介液相色谱技术简介液相色谱技术简介液相色谱技术简介固定相固定相：固定相是色谱的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。流动相流动相：在色谱过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱色谱中一般称为洗脱剂，薄层色谱时称为展层剂。v分配系数 可由可由Langmuir方程得出方程得

13、出 Kd-分配系数分配系数 q、c-溶质在固相和液相中的浓度溶质在固相和液相中的浓度v保留时间保留时间（tR）和保留体积（和保留体积（VR）反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一。基本热力学参数之一。v分离度:又称分辨率，用来表示两种洗脱曲线相邻的溶质相互分离的程度。两个相邻洗脱峰之间的距离与两个峰宽的代数平均值两个相邻洗脱峰之间的距离与两个峰宽的代数平均值.v理论板，理论板当量高度（HETP），理论塔板数（N）、反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系。分离度与柱高之

14、间的关系。理论板：将溶质达到一次分配平衡的色谱柱将溶质达到一次分配平衡的色谱柱段段。理论板当量高度：该段色谱柱的高度该段色谱柱的高度。v理论板数的计算方法N N-理论塔板数理论塔板数 t tR R-保留时间保留时间W W1/21/2-半峰宽半峰宽 W Wb b-峰底宽度峰底宽度n理论塔板高度：理论塔板高度：L-柱长柱长液相色谱技术简介液相色谱技术简介介绍介绍种质中心种质中心Waters HPLC仪器全图仪器全图 由图可以看出，由图可以看出，HPLC仪器排出仪器排出了大量的有毒了大量的有毒废液，而这些废液，而这些实验室的废液实验室的废液是直接经下水是直接经下水道排到环境中道排到环境中去的，造成大

15、去的，造成大量污染量污染Waters HPLC仪器分离检测单元图仪器分离检测单元图v由图可以由图可以看出看出HPLC仪仪器需要大器需要大量的有毒量的有毒流动相流动相Agilent HPLC色谱仪器色谱仪器vAgilent HPLC仪器仪器使用的废使用的废液瓶，这液瓶，这些废液并些废液并没有专门没有专门的处理方的处理方法法Waters HPLC仪器内部结构仪器内部结构 Waters仪仪器内部结器内部结构，右边构，右边内部是真内部是真空脱气机，空脱气机，外边是比外边是比例阀，右例阀，右边是泵和边是泵和单向阀，单向阀，管路众多，管路众多，结构复杂结构复杂Waters仪器的分离通道仪器的分离通道vWaters仪仪器的样品器的样品分离通道，分离通道，上面是色上面是色谱柱，下谱柱，下面是一个面是一个小的预柱小的预柱开尔文探针显微镜描述单个分子里的开尔文探针显微镜描述单个分子里的“电荷分布电荷分布”图片图片