分子标记原理和技术.ppt

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1、（Techniques of Molecular MarkersTechniques of Molecular Markers）分子标记技术分子标记技术课程基本情况课程基本情况:教学目的教学目的:使学生了解以使学生了解以Southerblot、PCR为基础为基础,能用于遗传多样性能用于遗传多样性研究的分子标记技术研究的分子标记技术,包括包括RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISH、DDRT-PCR、SNP等等.教学内容及基本要求教学内容及基本要求:DNA结构与功能；结构与功能；PCR技术；各种分子标记技术技术；各种分子标记技术基本原理；各种分子标记技术基本操作方法；分子标记技术的应用；实基

2、本原理；各种分子标记技术基本操作方法；分子标记技术的应用；实验中经常遇到的问题及解决方法。验中经常遇到的问题及解决方法。教学目标：使学生掌握常见分子标记技术使用的基本技能。教学目标：使学生掌握常见分子标记技术使用的基本技能。学习本课程的前期课程要求学习本课程的前期课程要求:遗传学、细胞生物学、分子生物学遗传学、细胞生物学、分子生物学.教教材材:郑成木郑成木主编主编.植物分子标记原理与方法植物分子标记原理与方法.湖南科技出版社湖南科技出版社,2002年年5月月考核：写一份读书报告，并做成考核：写一份读书报告，并做成PPT进行讲解。进行讲解。何谓读书报告，就是读完书之后的心得报告，何谓读书报告，就

3、是读完书之后的心得报告，是阅读者系统的收集、统整、研读与创作主题相是阅读者系统的收集、统整、研读与创作主题相关的各种材料，经分析、归纳、提炼等思维活动，提关的各种材料，经分析、归纳、提炼等思维活动，提出个人见解和观点的文字作品。出个人见解和观点的文字作品。写读书报告的目的在于增加新知、提升研究和表写读书报告的目的在于增加新知、提升研究和表达能力。达能力。第一章第一章绪论绪论1.1 1.1 遗传标记的类型及发展遗传标记的类型及发展1.2 1.2 遗传物质遗传物质DNADNA1.3 1.3 聚合酶链式反应聚合酶链式反应PCRPCR1.4 1.4 分子标记常用技术概述分子标记常用技术概述 1.1遗传

4、标记的类型及发展遗传标记的类型及发展AgeneticmarkerisanydifferenceinDNA,nomatterhowitisdetected,whosepatternoftransmissionfromgenerationtogenerationcanbedetected.GeneticmarkerthataredetectedbydirectanalysisoftheDNAarecalledDNAmarkers.1.1遗传标记的类型及发展遗传标记的类型及发展 遗传标记遗传标记(geneticmarkers)是研究生物遗传变异规律及其物是研究生物遗传变异规律及其物质基础的重要手段。

5、遗传标记主要有质基础的重要手段。遗传标记主要有4种类型种类型:形态标记（形态标记（morphologicalmarkers）细胞学标记（细胞学标记（cytologicalmarkers）生化标记（生化标记（biochemicalmarkers）分子标记（分子标记（molecularmarkers）在植物遗传育种研究中可被利用的遗传标记应具备以在植物遗传育种研究中可被利用的遗传标记应具备以下几个条件：下几个条件：（1）多态性高；）多态性高；（2）表现共显性；）表现共显性；（3）对农艺性状影响小；）对农艺性状影响小；（4）经济方便，容易观察记载。）经济方便，容易观察记载。多态性：多态性：群体内存在

6、着和等位基因相关的若干种表现型，群体内存在着和等位基因相关的若干种表现型，是单一基因座是单一基因座等位基因等位基因变异性在群体水平的体现。变异性在群体水平的体现。遗传多态性遗传多态性发生于基因组群体内，表现出由于等位基因受发生于基因组群体内，表现出由于等位基因受影响而产生不同的基因型，由此产生个体之间的多态性。影响而产生不同的基因型，由此产生个体之间的多态性。HLA基因多态性：基因多态性：人类白细胞抗原（人类白细胞抗原（HLAHLA）的主要功能是参与自我识）的主要功能是参与自我识别、免疫调节和对异体移植物排斥反应。别、免疫调节和对异体移植物排斥反应。HLA-DRB1HLA-DRB1基因是最具多

7、态基因是最具多态性的基因，存在性的基因，存在106106个等位基因，尤其是外显子个等位基因，尤其是外显子2 2处含有多达处含有多达4040个等位个等位基因，最常见的有基因，最常见的有1616个等位基因位点，此处含有与某些疾病的易感基个等位基因位点，此处含有与某些疾病的易感基因和保护基因。因和保护基因。共显性：共显性：杂合子的一对等位基因各自都具有自己的表型效杂合子的一对等位基因各自都具有自己的表型效应，当这一对等位基因杂合时，两种表现型共存。应，当这一对等位基因杂合时，两种表现型共存。便于鉴便于鉴别基因的别基因的纯合或杂合。纯合或杂合。形态标记（形态标记（morphologicalmarker

8、s）形态标记即植物的外部形态特征。形态标记即植物的外部形态特征。主要包括肉眼可见的外部特征，如：株高、穗长、主要包括肉眼可见的外部特征，如：株高、穗长、粒色、花色、粒重等；粒色、花色、粒重等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。关的一些特性。1864 1864年，孟德尔以豌豆的花色、种子形状、子叶颜色、年，孟德尔以豌豆的花色、种子形状、子叶颜色、豆荚形状、豆荚颜色、花序着生部位和株高豆荚形状、豆荚颜色、花序着生部位和株高7 7个不同的个不同的形态标记为对象，进行豌豆杂交试验，对杂交后代进行形态标记为对象，进行豌豆杂交试验，对杂交

9、后代进行分析研究，得出了著名的分离和独立分配规律。分析研究，得出了著名的分离和独立分配规律。形态标记简单直观、经济方便；但其数量在多形态标记简单直观、经济方便；但其数量在多数植物中是很有限的，且多态性较差，表现易数植物中是很有限的，且多态性较差，表现易受环境影响，并且有一些标记与不良性状连锁。受环境影响，并且有一些标记与不良性状连锁。此外形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合此外形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长。因此的过程，周期较长。因此,形态标记在作物遗形态标记在作物遗传育种中的作用是有限的。传育种中的作用是有限的。细胞学标记（细胞学标记（cytologicalmarker

10、s）细胞学标记即植物细胞染色体的变异。各个物种的染色细胞学标记即植物细胞染色体的变异。各个物种的染色体都有特定的特征。体都有特定的特征。包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（着丝粒位置等）和带型（C带、带、N带、带、G带等）的变化带等）的变化 与形态标记相比，细胞学标记的优点是能进行一些与形态标记相比，细胞学标记的优点是能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。但细胞学标记材重要基因的染色体或染色体区域定位。但细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大；料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大；同时

11、某些物种对染色体变异反应敏感；还有些变异难以同时某些物种对染色体变异反应敏感；还有些变异难以用细胞学方法进行检测。用细胞学方法进行检测。因此，到目前为止，真正应用于作物遗传育种研究因此，到目前为止，真正应用于作物遗传育种研究中的细胞学标记还很少。中的细胞学标记还很少。染色体显带（染色体显带（chromosomebanding）：借助于特殊的处理程序，）：借助于特殊的处理程序，使染色体显出深浅不同的带纹。染色体的数目、位置、宽窄与浓使染色体显出深浅不同的带纹。染色体的数目、位置、宽窄与浓淡具有相对的稳定性。淡具有相对的稳定性。染色体带型分析：通过蛋白酶或酸、碱、盐等化学因素或温度变染色体带型分析

12、：通过蛋白酶或酸、碱、盐等化学因素或温度变化等物理因素处理染色体，然后用化等物理因素处理染色体，然后用Giemsa、芥子喹吖因等染料进、芥子喹吖因等染料进行染色，可使各对染色体上表现出不同的染色带型或荧光域，因行染色，可使各对染色体上表现出不同的染色带型或荧光域，因而可以在经典的核型分析的基础上，进一步根据染色体的带型更而可以在经典的核型分析的基础上，进一步根据染色体的带型更精细地分析染色体。精细地分析染色体。生化标记（生化标记（biochemicalmarkers）生化标记主要包括同工酶和等位酶标记生化标记主要包括同工酶和等位酶标记,同工酶是指一个以上基因座位编码的酶的不同形式同工酶是指一个

13、以上基因座位编码的酶的不同形式;等位酶是指由一个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同分子等位酶是指由一个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同分子形式。形式。分析方法是从植物组织的蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色分析方法是从植物组织的蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。与形态标记、细胞学标记相比，生化标记具两个方面的优点：与形态标记、细胞学标记相比，生化标记具两个方面的优点：一是表现近中性，对植物经济性状一般没有大的不良影响；一是表现近中性，对植物经济性状一般没有大的不良影响；二是直接反映了基因产物差异，受环境影

14、响较小。二是直接反映了基因产物差异，受环境影响较小。但目前可使用的生化标记数量还相当有限，同时有组织特异性和但目前可使用的生化标记数量还相当有限，同时有组织特异性和发育时期特异性。且有些酶的染色方法和电泳技术有一定难度，因此发育时期特异性。且有些酶的染色方法和电泳技术有一定难度，因此其实际应用受到一定限制。其实际应用受到一定限制。同工酶与等位酶同工酶与等位酶电泳可区分的同一种酶（系统）的不同变化。电泳可区分的同一种酶（系统）的不同变化。同工酶同工酶(isozyme)：广义是指生物体内催化相同反应而广义是指生物体内催化相同反应而分子结构不同的酶。催化相同的化学反应，但其蛋白分子结构不同的酶。催化

15、相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶差异的一组酶。等位酶等位酶(allozyme)：由同一个位点的不同等位基因编由同一个位点的不同等位基因编码的同种酶的不同类型，其功能相同但氨基酸序列不码的同种酶的不同类型，其功能相同但氨基酸序列不同。同。同工酶与等位酶同工酶与等位酶材料的采集材料的采集研磨和酶的提取研磨和酶的提取酶的保存酶的保存凝胶制备凝胶制备电泳电泳凝胶切片凝胶切片酶的组织化学染色酶的组织化学染色酶谱的记录与分析酶谱的记录与分析数据分析数据分析同工酶与等位酶同工酶与等位酶分析的过程分析的过程同工酶与

16、等位酶同工酶与等位酶 酶谱照片酶谱照片在生物学中，同工酶可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种在生物学中，同工酶可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。和个体发育、组织分化等。例如最原始的脊椎动物七鳃鳗（例如最原始的脊椎动物七鳃鳗（Lamprey）只有一种）只有一种LDH肽链，肽链，进化到较高级的鱼类才有进化到较高级的鱼类才有A、B两类肽链。两类肽链。又如通过对地理分布不同的物种间某一同工酶谱的普查可以推测又如通过对地理分布不同的物种间某一同工酶谱的普查可以推测物种的地理来源、分类等。物种的地理来源、分类等。动、植物的遗传变异可通过子代和亲代同工酶谱的比较来鉴别。动、植物

17、的遗传变异可通过子代和亲代同工酶谱的比较来鉴别。法医学中也可用多种同工酶谱的分析来鉴定亲子关系。法医学中也可用多种同工酶谱的分析来鉴定亲子关系。细胞杂交或植物杂交育种后是否出现新品种也可用同工酶谱的比细胞杂交或植物杂交育种后是否出现新品种也可用同工酶谱的比较来确定。较来确定。在个体发育中，从胚胎到出生，再到成年，随着组织的分化和发在个体发育中，从胚胎到出生，再到成年，随着组织的分化和发育，各种同工酶谱也有一个分化转变的过程。育，各种同工酶谱也有一个分化转变的过程。酶是基因表达的直接产物，同工酶谱的器官组织特异性也反映了基酶是基因表达的直接产物，同工酶谱的器官组织特异性也反映了基因表达的特异性。

18、因表达的特异性。目前与目前与性别分化性别分化有关的同工酶研究大多集中在有关的同工酶研究大多集中在过氧化物酶同工酶过氧化物酶同工酶在在雌雄器官中的差异研究。雌雄器官中的差异研究。早在早在1972年，年，Penel等就注意到等就注意到菠菜菠菜的性别差异与过氧化物酶同工酶的性别差异与过氧化物酶同工酶谱带的数目有关。谱带的数目有关。沈德绪认为沈德绪认为葡萄和中华猕猴桃葡萄和中华猕猴桃中雌株酶带数也比雄株多。中雌株酶带数也比雄株多。范双喜等对范双喜等对芦笋芦笋雌雄株过氧化物酶同工酶雌雄株过氧化物酶同工酶(POD)进行了研究，结果进行了研究，结果表明雄株均比相应的雌株少一条酶带，说明芦笋性别差异与过氧化表

19、明雄株均比相应的雌株少一条酶带，说明芦笋性别差异与过氧化物酶同工酶谱带的数目有关，过氧化物酶同工酶谱的差异可以作为物酶同工酶谱带的数目有关，过氧化物酶同工酶谱的差异可以作为性别鉴定的指标。性别鉴定的指标。另外在另外在杨梅、猕猴桃杨梅、猕猴桃等中也有过类似的报道。等中也有过类似的报道。应振士等分析认为，过氧化物同工酶与雌性相关性的原因可能与其应振士等分析认为，过氧化物同工酶与雌性相关性的原因可能与其促进乙烯的释放有关。促进乙烯的释放有关。分子标记分子标记 分子标记指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特分子标记指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特 征的征的DNA片段，它直接反映基因组片段

20、，它直接反映基因组DNA间的差异。间的差异。与上述三种标记相比较，分子标记具有许多明显的优越与上述三种标记相比较，分子标记具有许多明显的优越性，表现为：性，表现为：直接以直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题等问题.数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限.多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造.表现为中性，不影响目标性状的表达表现为中

21、性，不影响目标性状的表达.许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体.广义的分子标记是指广义的分子标记是指可遗传并可检测的特异可遗传并可检测的特异DNA序列或蛋白质。序列或蛋白质。狭义的分子标记仅指狭义的分子标记仅指DNA或或(RNA)标记，而这标记，而这个界定现在被广泛采纳。个界定现在被广泛采纳。目前，分子标记技术（这里指目前，分子标记技术（这里指DNA或或cDNA分分子水平上的多态性检测技术）已有子水平上的多态性检测技术）已有:RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphisms)、RAPD(Rando

22、mAmplifiedPolymorphicDNA)、AFLP(Amplifiedfragmentlengthpolymorphisms)、SSR(Simplesequencerepeats)、GISH(Genomicinsituhybridization)、mRNADD(mRNADifferentialDisplay)、SSH(SuppressionSubtractionHybridization)、AP-PCR(Arbitray-primerPCR)、DAF(DNAamplifiedfingprinting)、SPARs(Singleprimeramplificationreactions)

23、、SCARs(Sequencedcharacteriedamplifiedregions)、AMO(AnchoredMicrosatelliteOligonucleotides)、STS(Sequenc-taggedSite)、SNP(SingleNucleotidePolymorphism).分子标记的种类与历史分子标记的种类与历史蛋白质：同工酶蛋白质：同工酶(等位酶等位酶)上世纪六上世纪六十年代以来十年代以来核苷酸序列和片段核苷酸序列和片段：tRNA（1965）1980年以来：年以来：RFLP1984年以来：年以来：SSR1990年以来：年以来：RAPD1993年以来：年以来：AFLP19

24、96年以来：年以来：DDRT-PCR1.2 1.2 遗传物质遗传物质DNA DNA结构原理结构原理 DNA分子的结构与功能分子的结构与功能 DNA的理化性质及应用的理化性质及应用1.2.1DNA结构原理结构原理 DNADNA双螺旋的发现双螺旋的发现 典型双螺旋结构典型双螺旋结构DNADNA双螺旋的发现双螺旋的发现OswaldAvery(1877-1955)Microbiologist Avery led the team that showed that DNA is the unit of inheritance.One Nobel laureate has called the disco

25、very the historical platform of modern DNA research,and his work inspired Watson and Crick to seek DNAs structure.19431943年年AveryAvery证明证明DNADNA携带遗传信息携带遗传信息ErwinChargaff(1905-2002)Chargaff discovered the pairing rules of DNA letters,noticing that A matches to T and C to G.He later criticized molecul

26、ar biology,the discipline he helped invent,as the practice of biochemistry without a licence,and once described Francis Crick as looking like a faded racing tout.19491949年年ChargaffChargaff发现发现A A与与T T及及C C与与G G 配对现象配对现象Rosalind Franklin(1920-58)Franklin,trained as a chemist,was expert in deducing th

27、e structure of molecules by firing X-rays through them.Her images of DNA-disclosed without her knowledge-put Watson and Crick on the track towards the right structure.She went on to do pioneering work on the structures of viruses.Maurice Wilkins(1916-)Like Crick,New Zealand-born Wilkins trained as a

28、 physicist,and was involved with the Manhattan project to build the nuclear bomb.Wilkins worked on X-ray crystallography of DNA with Franklin at Kings College London,although their relationship was strained.He helped to verify Watson and Cricks model,and shared the 1962 Nobel with them.19521952年底得到年

29、底得到DNADNA的的X-X-射线衍射图像射线衍射图像Linus Pauling(1901-94)The titan of twentieth-century chemistry.Pauling led the way in working out the structure of big biological molecules,and Watson and Crick saw him as their main competitor.In early 1953,working without the benefit of X-ray pictures,he published a pape

30、r suggesting that DNA was a triple helix.19531953年初提出了年初提出了DNADNA的三螺旋模型的三螺旋模型James Watson(1928-)Watson went to university in Chicago aged 15,and teamed up with Crick in Cambridge in late 1951.After solving the double helix,he went on to work on viruses and RNA,another genetic information carrier.He

31、also helped launch the human genome project,and is president of Cold Spring Harbor Laboratory in New York.Francis Crick(1916-)Crick trained and worked as a physicist,but switched to biology after the Second World War.After co-discovering the structure of DNA,he went on to crack the genetic code that

32、 translates DNA into protein.He now studies consciousness at Californias Salk Institute.1953年提出了年提出了DNA的双螺旋模型的双螺旋模型腺嘌呤腺嘌呤A鸟嘌呤鸟嘌呤G胸腺嘧啶胸腺嘧啶T胞嘧啶胞嘧啶C尿嘧啶尿嘧啶UOOHHHOHHOHHHOCH212345OOHHHHHOHHHOCH212345-D-核糖核糖OOHHHOHHOHHHOCH212345-D-2-脱氧核脱氧核糖糖1.2.2DNA分子的结构与功能分子的结构与功能 DNA的超螺旋结构的超螺旋结构 原核生物：大部分原核生物的原核生物：大部分原核生物

33、的DNA是共价封闭的环状是共价封闭的环状双螺旋，这种双螺旋还可以再次螺旋化形成超螺旋。双螺旋，这种双螺旋还可以再次螺旋化形成超螺旋。真核生物：真核生物：DNA和蛋白质组装成染色体，染色体的基和蛋白质组装成染色体，染色体的基本单位是核小体。本单位是核小体。核小体由核小体由DNA和组蛋白构成。组蛋白有和组蛋白构成。组蛋白有H1，H2A，H2B，H3和和H4。H2A，H2B，H3和和H4各两分子构成核小体各两分子构成核小体的核心，称为组蛋白八聚体。的核心，称为组蛋白八聚体。DNA双螺旋分子缠绕在八聚体双螺旋分子缠绕在八聚体上构成核小体的核心颗粒。核小体的核心颗粒之间再由上构成核小体的核心颗粒。核小体

34、的核心颗粒之间再由DNA和组蛋白和组蛋白H1构成的连接区连接起来形成串珠状结构。核小体构成的连接区连接起来形成串珠状结构。核小体进一步旋转折叠形成棒状染色体，将近进一步旋转折叠形成棒状染色体，将近1m长的长的DNA分子容分子容纳于直径只有数微米的细胞核中。纳于直径只有数微米的细胞核中。DNADNA的功能的功能 DNA的基本功能作为生物遗传信息复制的模的基本功能作为生物遗传信息复制的模板和基因转录的模板，它是遗传繁殖的物质板和基因转录的模板，它是遗传繁殖的物质基础。基础。基因组（基因组（genome）：）：一个生物体的全部基因一个生物体的全部基因序列。最简单的生物如序列。最简单的生物如SV40病

35、毒的基因组仅病毒的基因组仅含有含有5100碱基对（碱基对（basepairbp），），大肠杆菌大肠杆菌基因组的大小为基因组的大小为5700千碱基对（千碱基对（kbp），人），人的基因组则由大约的基因组则由大约3.0109个个bp组成。组成。1.2.3 1.2.3 DNA的理化性质及应用的理化性质及应用 核酸的一般理化性质核酸的一般理化性质:多元酸，较强的酸性多元酸，较强的酸性;DNA为线性高分子，粘度极大，而为线性高分子，粘度极大，而RNA分子远小于分子远小于DNA，粘度也小得多，粘度也小得多;由于碱基成分的紫外吸收特征，由于碱基成分的紫外吸收特征，DNA和和RNA溶液均具有溶液均具有260n

36、m紫外吸收峰。紫外吸收峰。DNA的变性的变性 DNA变性：在某些理化因素作用下，变性：在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间分子互补碱基对之间的氢键断裂，使的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链。监测指标为双螺旋结构松散，变成单链。监测指标为A260的变化。的变化。常用的变性方法为加热。常用的变性方法为加热。增色效应（增色效应（hyperchromiceffect）：）：DNA解链过程中，其解链过程中，其A260增增加，并与解链程度有一定的关系加，并与解链程度有一定的关系 解链曲线：在连续加热过程中以温度对解链曲线：在连续加热过程中以温度对A260的关系作图。的关系作图。解链温度

37、：解链温度：DNA变性从开始到完全解链是在一个相当窄的范围变性从开始到完全解链是在一个相当窄的范围内完成内完成的。这一范围内的。这一范围内A260达到最大值的达到最大值的50%时的温度称为解时的温度称为解链温度，又称为融解温度（链温度，又称为融解温度（meltingtemperature，Tm）。）。Tm的大小与其所含碱基中的的大小与其所含碱基中的G+C比例相关，比例相关，G+C比例越高，比例越高，Tm值越高。值越高。DNADNA的复性的复性 复性复性:变性变性DNA在适当条件下，两条互补链在适当条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象，称为复性。可重新恢复天然的双螺旋构象，称为复性。热变

38、性热变性DNA经缓慢冷却后即可复性，也称经缓慢冷却后即可复性，也称为退火（为退火（annealing）。）。DNA复性速度受温度的影响，复性时温度复性速度受温度的影响，复性时温度缓慢下降才可使其重新配对复性；如加热后缓慢下降才可使其重新配对复性；如加热后将其迅速冷却至将其迅速冷却至4以下，则不可能发生复以下，则不可能发生复性。性。比比Tm低低25为为DNA复性的最佳条件复性的最佳条件。DNA分子杂交分子杂交(hybridization)双链双链DNA单链单链DNA杂交杂交在在DNA复性过程中，双链分子的再形成可以发生在序复性过程中，双链分子的再形成可以发生在序列完全互补的核酸分子之间，也可以发

39、生在碱基序列部分列完全互补的核酸分子之间，也可以发生在碱基序列部分互补的不同的互补的不同的DNA之间或之间或DNA与与RNA之间之间，这种现象称，这种现象称为分子杂交。为分子杂交。（polymerase chain reactionpolymerase chain reaction）1.3 1.3 聚合酶链式反应聚合酶链式反应关于关于PCRPCR，您能告诉我们，您能告诉我们 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)简称，是一项在短时间内大量扩增特定的简称，是一项在短时间内大量扩增特定的片段的分子生物学技术。片段的分子生物学技术。无论是化石中的古生物、历史人

40、物的残骸，还无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的或血液，只要能分离出一丁点的DNADNA，就能用，就能用PCRPCR加以放大，进行比对。这也是加以放大，进行比对。这也是“微量证据微量证据”的威力之所在。的威力之所在。PCR技术简史技术简史 PCR的最早设想的最早设想核核酸酸研研究究已已有有100多多年年的的历历史史，上上世世纪纪60年年代代末末、70年年代代初初人人们们致致力力于于研研究究基基因因的的体体外外分分离离技技术术，Khorana于于1971年年最最早早提提出出核核酸酸体体

41、外外扩扩增增的的设设想想：“经经过过DNA变变性性，与与合合适适的的引引物物杂杂交交，用用DNA聚聚合合酶酶延延伸伸引引物物，并并不不断断重重复复该该过过程程便便可可克克隆隆tRNA基因基因”。PCR的实现的实现1985年年美美国国PE-Cetus公公司司人人类类遗遗传传研研究究室室的的Mullis等等发发明明了了具具有有划划时时代代意意义义的的聚聚合合酶酶链链反反应应。其其原原理理类类似似于于DNA的的体体内内复复制制，只只是是在在试试管管中中给给DNA的的体体外外合合成成提提供供一一种种合合适适的的条条件件模模板板DNA，寡寡核核苷苷酸酸引引物物，DNA聚聚合合酶酶，合合适适的的缓缓冲冲体

42、体系系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间变性、复性及延伸的温度与时间。Mullis最初使用的最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I的的Klenow片段。片段。缺点：不耐热缺点：不耐热 1988年初，年初，Keohanog改用改用T4DNA聚合酶。聚合酶。缺点：不耐热缺点：不耐热 1988年年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热中提取到一种耐热DNA聚合酶。此聚合酶。此酶命名为酶命名为TaqDNA多聚酶多聚酶(TaqDNAPolymerase)。优点：耐热优点：耐热此酶的发现

43、使此酶的发现使PCR广泛的被应用。广泛的被应用。PCR PCR的改进与完善的改进与完善:Old Faithful Geyser-Yellowstone National ParkOld Faithful Geyser-Yellowstone National ParkAn alien and inhospitable place,characterized by extreme An alien and inhospitable place,characterized by extreme heat,spewing steam into the frigid air heat,spewing

44、steam into the frigid air such is the scene of such is the scene of old faithful geyser in Yellowstone National park.This old faithful geyser in Yellowstone National park.This seemingly prohibitive habitat is home to Thermus aquaticus,seemingly prohibitive habitat is home to Thermus aquaticus,the ba

45、cterium from which the the bacterium from which the heat stable heat stable DNA polymerase DNA polymerase essential to PCR is obtained.essential to PCR is obtained.耐热性KaryMullisacceptingtheNobelPrize Brilliant,gifted,genius,rebel Brilliant,gifted,genius,rebel Dr Kary Mullis has been thus Dr Kary Mul

46、lis has been thus described,and more.Mullis discovered the PCR procedure,for described,and more.Mullis discovered the PCR procedure,for which he was awarded the Nobel prize in 1993.The procedure he which he was awarded the Nobel prize in 1993.The procedure he devised has revolutionized molecular bio

47、logy,forensics,and DNA devised has revolutionized molecular biology,forensics,and DNA based identification technology.based identification technology.PCR仪仪1.3.1 PCR1.3.1 PCR原理原理模板模板PCRPCR原理原理变性变性5353复性复性PCRPCR原理原理引物引物引物引物5353延伸延伸PCRPCR原理原理变性变性PCRPCR原理原理复性复性PCRPCR原理原理延伸延伸PCRPCR原理原理变性变性PCRPCR原理原理复性复性P

48、CRPCR原理原理延伸延伸PCRPCR原理原理 DNADNA以指数形式扩增以指数形式扩增(2(2n n)，其中长片段以线其中长片段以线性形式扩增性形式扩增(2(2n+2)n+2)，最终主产物片段长度在两最终主产物片段长度在两个引物之间。个引物之间。2402401616256256114114525222228 82 20 00 0短片段短片段（单链（单链)1414121210108 86 64 42 2长片段长片段（单链（单链)128128646432321616总片段总片段（单链（单链)循环数循环数预变性预变性(92-95(92-95 C,2-5m)C,2-5m)变性变性(92-95(92-

49、95 C,30s)C,30s)复性复性(40-60(40-60 C,30s)C,30s)延伸延伸(72(72 C,30-60s)C,30-60s)总延伸总延伸(72(72 C,7m)C,7m)(25-35)(25-35)PCRPCR的的一一般般过过程程经过经过3030次循环次循环,扩增的扩增的DNADNA片段可达片段可达100100万倍以上。万倍以上。PCR产物的积累规律产物的积累规律DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。扩增过程遵循酶促动力学原理。反反应应初初期期，目目的的DNA片片段段呈呈指指数数形形式式（2n）增增加加，随随着着目目的的DNA的的积积累累，在在引引物物、模模板板与与DNA聚聚

50、合合酶酶达达到到一一定定比比例例时时，酶酶的的催催化化反反应应趋趋于于饱饱和和平平台台期期。（25个循环）个循环）PCR反应的自动化反应的自动化 PCR反反应五要素：五要素：引物、引物、酶、dNTP、模板和模板和Mg2+TaqDNA聚合酶聚合酶来源：水生栖热菌来源：水生栖热菌Thermus aquaticus特性：良好的耐热性特性：良好的耐热性Mg2+依赖性依赖性无校正功能无校正功能？1.3.2PCR引物设计引物设计 引物长度：引物长度：15-3015-30bpbp，常用为常用为2020bpbp左右。左右。引引物物扩扩增增跨跨度度：以以200-500200-500bpbp为为宜宜，特特定定条条