基因操作原理display基因展示技术.ppt

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1、以微生物细胞表面展示为主线的基因操作原理2004年4月22日星期四通常是指通过遗传操作将外源大分子定位表达在微生物细胞表面以便直接利用全细胞进行后续工作而无须基因产物的 提取、纯化、和重新折叠等操作一、微生物细胞表面展示 Microbial cell surface display,MCSD微生物细胞表面展示微生物细胞表面展示第一部分MCSD主要以构建融合蛋白方式来实现即将外源蛋白与菌体的某一表面蛋白相融合借助后者的表面识别和表面定位功能将前者携带并定位在细胞表面前者称为乘客蛋白，后者称为运载蛋白即将外源蛋白与菌体的某一表面蛋白相融合借助后者的表面识别和表面定位功能将前者携带并定位在细胞表面前

2、者称为乘客蛋白，后者称为运载蛋白宿主菌细菌和酵母菌展示了病原菌的抗原表位、多聚组氨酸肽、蛋白质文库、金属硫蛋白、多种酶类、多种单链抗体和T细胞受体的信号分子运载蛋白膜蛋白、附属结构蛋白、粘附蛋白、凝集素、以及S-层蛋白等宿主菌细菌和酵母菌展示了病原菌的抗原表位、多聚组氨酸肽、蛋白质文库、金属硫蛋白、多种酶类、多种单链抗体和T细胞受体的信号分子运载蛋白膜蛋白、附属结构蛋白、粘附蛋白、凝集素、以及S-层蛋白等二、微生物细胞表面展示技术的应用二、微生物细胞表面展示技术的应用MCSD技术广泛应用于生物工程领域，可开发和利用来进行蛋白构象的分析、活菌疫苗的研制、临床诊断、表面抗原的直接克隆、以及抗体工程

3、应用等。1.1.构建和筛选蛋白质文库构建和筛选蛋白质文库 2.2.开发活菌体疫苗，制备抗血清和多克隆抗体开发活菌体疫苗，制备抗血清和多克隆抗体 3.3.构建全细胞催化剂构建全细胞催化剂4 4开发新型微生物吸附剂开发新型微生物吸附剂5 5研制新型生物传感器研制新型生物传感器三、举例Display of Poly-His Peptides on Escherichia coli Cell Surface在大肠杆菌细胞表面展示多聚组氨酸肽Schematic Presentation of E.coli OmpC LQ 位点含PstI位点GATAGATACCTGCAGGTCGACCCAAGCGGACA

4、TCACCATCATCACCATTCTGGTCTCGAGGATATCCTGCAGTTGGCTATCTATGGACGTCCAGCTGGGTTCGCCTGTAGTGGTAGTAGTGGTAAGACCAGAGCTCCTATAGGACGTCAACCPoly(His)6XhoIPstIPstISalIL Q V D P S GS G L E D I L Q GATAGATACCTGCAGGTCGACCCAAGCGGACATCACCATCATCACCATTCTGGTCTCGAGGATATCCTGCAGTTGGCTATCTATGGACGTCCAGCTGGGTTCGCCTGTAGTGGTAGTAGTGGTAA

5、GACCAGAGCTCCTATAGGACGTCAACCGTCGACCAGCTGCTCGAGGAGCTCGTCGAGCAGCTCCTCGACGAGCTGSalIXhoIXhoIPstIPstISalISequence Inserted into OmpC L7Expression of OmpC-(6His)n at 30 CFraction of OmpC or its derivates of the total outer membrane proteins123456Expression of OmpC-(6His)n at 25 CFraction of OmpC or its der

6、ivates of the total outer membrane proteins12Interaction Between Neighboring Histidines and Ni-NTA Agarose Each Ni2+require six pairs of electrons to form a stable coordination sphere around;four of them are available from NTA,and two of the other two are expected from neighboring histidines.NTA:nit

7、rilotriacetic acid 次氮基三乙酸Ni-NTA-Agarose Surface bound cells of(a)MC4100(pTCHP2)and(b)MC4100(pTCHP3)Attachment to Ni-NTA-Agarose beads碘化丙锭 染色细胞,543nm氦/氖激光，570nm 光栅 Attachment to Ni-NTA-Agarose beadspTCdPpTCHP1pTCHP2pTCHP12pTCHP6pTCHP3All recombinant cells could attach to the surface of Ni-NTA-Agarose

8、 Poly-His peptides were exposed successfullybeads,except MC4100(pTCHP18)Cd2+Adsorption of MC4100(pTCHPn)The adsorption capacity increased along with the increasing MC4100(pTCHPn)can be used as bioadsorbents.number of 6His units.三、三、S-S-层蛋白用于表面展示层蛋白用于表面展示细菌表面S-层 细胞膜细胞壁S-层Cell surface layerS-layer第二部分

9、 细菌细胞表面S层简介一、S-layer 的分布广泛存在于许多古细菌和真细菌的细胞最外表面在绝大多数古细菌当中，S层是细胞唯一的外壁层在所有的主干细菌类群中的几百个种中都检测到对于发现S-层的某个种来说，并不是每一个分离株都存在S-层尽管S-layer分布广泛，但其存在在相当长一段时间内并没有引起人们的重视因为 S-layer 在实验室培养过程中容易丢失，Freeze-etching electron microscopy 能观察到S-层可在细胞生长的所有阶段完全覆盖在细胞表面二、S-层的结构和组成由蛋白质或糖蛋白构成的单分子晶格状的聚合层由蛋白质或糖蛋白构成40kDa-200kDa50 nm

10、G-古细菌G+细菌G-真细菌a.嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius(古细菌);b.杀鲑气单胞菌(G-);c.苏云金芽胞杆菌(G+)。PM,质膜;PG,肽聚糖层；OM,外膜；CW,细胞壁；S,S-层。内标50nm。完整细胞表面覆盖5105 单体 500copies 单肽/秒 合成，转运至细胞表面，组装成晶格结构 Generation time:20-30minS-层蛋白的启动子是非常强的Lactobacillus acidophilus(嗜酸乳酸杆菌)S-层蛋白的启动子乳酸脱氢酶基因启动子的两倍 (是细菌中最强启动子之一)炭疽芽胞杆菌Sap蛋白由814aa组成含N-

11、末端29aa信号肽，其SLH位于N-末端200aa以内，通过该SLH已使聚蔗糖果聚糖酶成功地在细胞表面得到表达其表达的分子数与细胞表面S-层中S-层蛋白的分子数相当四、S-层的应用前景人们对S-层的应用潜力寄予厚望在生物技术和仿生学方面 1.S-层可开发成超滤膜分子筛2.S-层在开发疫苗方面具广阔前景与特异性抗原或半抗原结合可作为佐剂系统加以使用3.提高脂膜的稳定性通过S-层蛋白在脂膜上重结晶成S-层，可明显提高脂膜的稳定性，便于研究膜蛋白的生物学功能4.S-层在纳米材料方面有巨大应用潜力S-层可作为形成有序排列的纳米金属或半导体材料的模板;这些具有特殊物理性质的材料可广泛用于纳米电子学和非线

12、性光学的研究5.细胞表面展示Cell surface displayS-层是一个极有前途的、可用于细胞表面定位表达蛋白质的展示系统S-层蛋白表达量高，可达细胞蛋白的15%，而且可有效地与细胞壁结合第三部分 利用S-层蛋白进行表面展示的基因操作一、S-层蛋白的基因克隆 苏云金芽胞杆菌苏云金芽胞杆菌，具杀虫活性，具杀虫活性苏云金芽胞杆菌苏云金芽胞杆菌一种细菌广泛存在于土壤等自然环境简称 苏云金杆菌 或 BtBacillus thuringiensis伴胞晶体(kDa)200116664531SDS-PAGE profile of crystal protein of Bacillus thurin

13、giensis CTC and T02 strainM CTC T02 M苏云金芽胞杆菌苏云金芽胞杆菌 CTC测定测定 CTC 蛋白蛋白(100kDa)第一次：A G K S F P D V P A D H W G I第二次：A G K S F P D V(P)A Primer design CTC-46 GCA GGA AAA TCA TTC CCA GAC GTT CDigested CTC DNA with various restriction enzymesSouthern hybridization to CTC DNA(DIG-labeling)Kb ladderRestrict

14、 location of ctc gene9.0kb HpaII9.5kb EcoRI以9.0kb HpaII和9.5kb EcoRI为目标构建文库 X-Blue(pBMB982)重组 生长艰难 易于自溶构建亚基因组文库以基因组中某些DNA片段为目标所构建的DNA 文库但在以9.0kb HpaII和9.5kb EcoRI为目标构建的文库中，得不到阳性克隆子表达S-layer蛋白的3.1kb ClaI2.9kb XbaIX 2814082bp EcoRI-ClaIpBMB982第一个来自苏云金芽胞杆菌的第一个来自苏云金芽胞杆菌的S-层蛋白基因层蛋白基因(Sara et al,J.Bacterio

15、l,2000)DNA Sequencing EcoRI/ClaI fragment The 4082 bp sequenced 816 aa encoding capability GenBank AJ012290 3141 ATTAAAGAAG TAAAAGAAGT AAAATAATAA TTATTAAAGC I K E V K E V K -3181 CTATGAGAAA ATAGACAAAA GTCTATGAGT ATCATAGGCT 3221 TTTTATTTTG ATCTTATTTC ATATATATTT TAGATTGAAG X 2814082bp EcoRI-ClaIpBMB98

16、2Cloning of ctc-2 gene 2.9kb ClaI 2.9kb in pKS ClaIClaIClaIctc-2 genectc-1 geneFull length ctc-2 gene?Problem 1 ClaI-ctc-2 gene(2.9kb)can not be recovered ATCGATCGTGCTTCTGCAGCTGTAATCTTCACClaIDam methylation site ClaI is sensitive to methylationGM2163:dam-dcm-VJS987:dam-Purify plasmid from dam-E.coli

17、ClaIClaIClaIctc-2 genectc-1 geneProblem 2 ctc-1 gene can not be recovered at its 3-end 实际使用pIJ2925ATCGATTAGCTAGTCGACCAGCTGClaIAccIATCGACTAGCTGligationATCGACCGGCATGCAAGCTTTAGCTGGCCGTACGTTCGAASphIHindIIISphIATCGACCGGCATG CAAGCTTTAGCTGGCC GTACGTTCGAAKlenow /dATPATCGA CAAGCTTTAGCTGGCC AAMung Bean Nuclea

18、seATCGA CAAGCTTTAGCTGGCC AAMung Bean NucleaseATCGA TTTAGCT AAligationATCGATTTAGCTAARecovering ClaI8611/ClaI K23/ClaI二、表达载体 稳定 安全 高效表达（一）质粒复制区的克隆（一）质粒复制区的克隆利用利用Bt 内源质粒的复制片段作为内源质粒的复制片段作为载体稳定因素载体稳定因素任何一个质粒都含有一段与复制有关的区域，包括1.复制起点and/or2.复制蛋白复制起始蛋白基因and/or 3.其他任何一个质粒的复制有宿主特异性如在Gram+/Gram-有差异Gram+细菌质粒复制区克隆

19、载体Amp 抗性基因 (E.coli or Gram)Sp 壮观霉素抗性基因(Gram)1.ori 9741 GenBank AF202532 2.ori 2062 GenBank AF050161cry3AapBMB608pBMB685稳定性为 99.5%无抗生素选择压力40代 stability test*以内源质粒为基础的质粒载体以内源质粒为基础的质粒载体 在无选择压力的情况下，能够稳定遗传在无选择压力的情况下，能够稳定遗传（二）解离载体的构建（二）解离载体的构建Res tnpI tnpATn4430转座子通过体内重组通过体内重组可去掉非可去掉非 Bt DNA Bt DNA 片段片段解决

20、环境释放安全问题解决环境释放安全问题cry geneoriBtresresermamporiEccry geneoriBtresresermamporiEc受体菌中受体菌中发生解离发生解离TnpI只能在苏云金芽胞杆菌中复制只能在苏云金芽胞杆菌中复制 只能在大肠杆菌中复制只能在大肠杆菌中复制 解离载体的解离解离载体的解离IRSIRS解离载体解离载体pBMB801的构建及解离的构建及解离resolutionori/tsTcori/E AmptnpI tnpA2.整合在染色体整合在染色体 转座子整合载体转座子整合载体三、S-层蛋白用于表面展示的前景信号肽SLH 锚定序列1 1六聚组氨酸肽六聚组氨酸肽

21、Poly(His)Poly(His)6 6 Poly(His)6)对重金属二价阳离子如镉(Cd2+)、镍(Ni2+)、铜(Cu2+)、锌(Zn2+)和铅(Pb2+)等具有螯合(吸附)作用,可用于重金属污水处理目前几乎所有的表达重金属结合能力的细菌都限定在大肠杆菌成功的重组菌在固定化之后在重金属污水处理方面，以及重金属矿物富集方面将有重要的应用潜力金属硫蛋白具有相似作用ctc-(6His)n融合基因的构建6His PCR产物电泳图1 2 31，100bp Ladder；2，3，6His PCR产物PvuIIPCRXbaI PvuII EcoRIXbaIHincIISphIEcoRIXbaISph

22、IEcoRIKpnIBamHIXbaISalISphIslhXbaI(6His)slh(6His)1slh(6His)1pBMB-982pHT304重组质粒pBMB-SHA1构建示意图pBMB-SHA1重组质粒pBMB-SHB1构建示意图XbaI(6His)XbaIPCRXbaI XbaI XbaIpBMB982-304slh(6His)1pBMB-SHB1 slh(6His)1EcoRISalIXhoI slh(6His)1EcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIEcoRI+SalIEcoRISalIXhoIEcoRI+XhoIEcoRISalIXhoIctc-(6His)2融合

23、基因的构建 slh(6His)2EcoRISalIXhoI slh(6His)1EcoRISalIXhoIEcoRI+XhoIEcoRI+SalIEcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIctc-(6His)3融合基因的构建EcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIEcoRISalIXhoIctc-(6His)1 ctc-(6His)2 ctc-(6His)3 ctc-(6His)6 ctc-(6His)9 ctc-(6

24、His)15ctc-(6His)12 ctc-(6His)18ctc-(6His)n融合基因构建示意图1 2 3 4 5 6 7 8重组质粒pBMB-SHAn酶切验证电泳图1，/HindIII分子量标准2，pBMB-SHA18/ClaI+XhoI3，pBMB-SHA12/ClaI+XhoI4，pBMB-SHA6/ClaI+XhoI5，pBMB-SHA3/ClaI+XhoI6，pBMB-SHA2/ClaI+XhoI7，pBMB-SHA1/ClaI+XhoI8，100bp Ladder重组质粒pBMB-SHBn酶切验证电泳图1 2 3 4 5 6 71，/HindIII分子量标准；2，pBMB-S

25、HB15/ClaI+XhoI；3，pBMB-SHB9/ClaI+XhoI；4，pBMB-SHB3/ClaI+XhoI；5，pBMB-SHB2/ClaI+XhoI；6，pBMB-SHB1/ClaI+XhoI7，100bp Ladder携带ctc-(6His)n融合基因重组菌的构建将pBMB-SHAn系列重组质粒转入受体菌171/pBMB-CSA中将pBMB-SHBn系列重组质粒转入受体菌4Q7/pBMB-CSASDS-PAGE检测融合蛋白的表达1 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 8 重组质粒pBMB-SHAn在171中表达的SDS-PAGE1，分子量标记；2，171/pBM

26、B-CSA；3，171/pBMB-SHA1；4，171/pBMB-SHA2；5，171/pBMB-SHA3；6，171/pBMB-SHA6；7，171/pBMB-SHA12；8，171/pBMB-SHA181 2 3 4 5 6 7 重组质粒pBMB-SHBn在4Q7中表达的SDS-PAGE1 2 3 4 5 6 71，4Q7/pBMB-CSA；2，4Q7/pBMB-SHB15；3，4Q7/pBMB-SHB9；4，4Q7/pBMB-SHB3；5，4Q7/pBMB-SHB2；6，4Q7/pBMB-SHB1；7，分子量标记。CTC-(6His)n融合蛋白活性的检测CTC-（6His）n融合蛋白对镍

27、离子的吸附CTC-（6His）n融合蛋白对镉离子的吸附CTC-（6His）n融合蛋白对镍离子的吸附检测表达了CTC-（6His）n融合蛋白的重组菌与Ni-NTA-Agarose 吸附作用用碘化丙锭对细胞染色荧光显微镜观察使用波长为532nmInteraction Between Neighboring Histidines and Ni-NTA Agarose 含质粒pBMB-SHAn的重组菌与Ni-NTA-琼脂糖微球的吸附作用A,171/pBMB-CSA；B，171/pBMB-SHA1；C，171/pBMB-SHA2；D，171/pBMB-SHA3；E，171/pBMB-SHA6；F，171

28、/pBMB-SHA12；G，171/pBMB-SHA18ABCDEFG含质粒pBMB-SHBn的重组菌与Ni-NTA-琼脂糖微球的吸附作用A，4Q7/pBMB-CSA；B，4Q7/pBMB-SHB1；C，4Q7/pBMB-SHB2；D，4Q7/pBMB-SHB3；E，4Q7/pBMB-SHB9；F，4Q7/pBMB-SHB15ABCDEFCTC-（6His）n融合蛋白对镉离子的吸附定量测定采用全谱直读等离子体发射光谱仪测定使用波长为1 2 3 4 5 6 74107310721071107重组菌171/pBMB-SHAn和 4Q7/pBMB-SHBn对Cd2+的吸附作用系列1：1，171/pB

29、MB-CSA；2，171/pBMB-SHA1；3，171/pBMB-SHA2；4，171/pBMB-SHA3；5，171/pBMB-SHA6；6，171/pBMB-SHA12；7，171/pBMB-SHA18系列2：1，4Q7/pBMB-CSA；2，4Q7/pBMB-SHB1；3，4Q7/pBMB-SHB2；4，4Q7/pBMB-SHB3；5，4Q7/pBMB-SHB9；6，4Q7/pBMB-SHB15抗病蛋白在细胞表面的展示但该蛋白为胞内蛋白，若在细胞表面表达可增强其抗病作用ctc-aii融合基因 的构建CGGCTCTAGACATGACCGTAAAGAAGCTTTAaii-up:aii-do

30、wn:AGCTGCATGCCTATGTATACTCCGGGAACAXbaISphI以pGEMT-4Q7aii为模板aii基因及pBMB-SAII重组质粒PCR扩增产物电泳图 1 2 31，100bps Ladder；2，aii基因PCR产物；3，pBMB-SAII重组质粒PCR扩增产物XbaISphIslhpGEMT-4Q7aiiXbaI SphIaiipBMB982-304XbaI+SphIslhaiipBMB-SAII重组质粒pBMB-SAII的构建示意图pBMB-SAII质粒图谱重组质粒pBMB-SAII的酶切验证电泳图1 2 3 41，pBMB-SAII/HindIII；2，pBMB-

31、SAII/SphI；3，pBMB-SAII/XbaI；4，/HindIII 分子量标准重组质粒pBMB-SAII在4Q7中的表达1，4Q7/pBMB-CSA；2，分子量标准；3，4Q7/pBMB-SAII；4，CTC1 2 3 4携带ctc-aii融合基因重组菌 的构建CTC-Aii融合蛋白活性的检测胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1AI致病基因表达重组菌分解在马铃薯上重组菌4Q7/pBMB-SAII对胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1引发病灶的抑制作用3 42 14 13 23 42 1A B CA，B，C三个平板分别代表SCG1与待测菌株混合培养、2h、4h每个平板上 1为SCG1+无菌水 2为SCG1+

32、4Q7/pBMB-SAII 3为SCG1+4Q7/pBMB-CSA 4为4Q7/pBMB-CSA+无菌水在大白菜上重组菌4Q7/pBMB-SAII对胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1引发病灶的抑制作用1 2 3 4 1 2 3 41，SCG1+4Q7/pBMB-SAII 2，SCG1+4Q7/pBMB-CSA3，4Q7/pBMB-CSA+无菌水 4，SCG1+无菌水(2)(2)在在S S层蛋白突变株中的层蛋白突变株中的表达表达1.Saii-Tr5Saii-Tr5混合混合SCG1 SCG1 混合混合SCG1SCG1混合混合SCG1SCG14.4.软腐病菌软腐病菌SCG1SCG1上图：混合上图：混合80min80min下图：混合下图：混合120min120min转转aiiAaiiA 融合基因融合基因菌株菌株3439-Tr53439-Tr5、Saii-Tr5Saii-Tr5、Saii-4Q7Saii-4Q7的抗软腐病检测的抗软腐病检测Thanks许朝晖许朝晖张琼张琼王莉王莉刘欣刘欣张蕾张蕾刘小锦刘小锦吴怀光吴怀光周燚周燚朱晨光朱晨光国家国家“863“863计划计划”国家自然科学基金国家自然科学基金教育部重点资助项目教育部重点资助项目芽胞杆菌分子生物学研究组芽胞杆菌分子生物学研究组参考资料考试题型1.名词解释2.填空3.简答题4.问答题