生物化学课件 复制.ppt

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1、生物化学课件 复制 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望遗传信息传递的中心法则遗传信息传递的中心法则DNA复制复制RNA转录转录蛋白质蛋白质翻译翻译RNA逆转录逆转录复制复制蛋白质蛋白质翻译翻译*DNADNA通过基因表达，决定了蛋白质的结构、通过基因表达，决定了蛋白质的结构、功能功能 *DNADNA通过复制，将基因信息代代相传通过复制，将基因信息代代相传 *RNARNA参与参与DNADNA遗传信息的表达遗传信息的表达*RNARNA也可作为某些病毒遗传信息

2、的载体也可作为某些病毒遗传信息的载体本本 章章 主主 要要 内内 容容1、复制（、复制（replicationreplication）2、基因表达、基因表达转录（转录（transcriptiontranscription）翻译（翻译（translationtranslation）（gene expression)gene expression)第第一节一节 DNA的生物合成的生物合成 本本节主要内容节主要内容：1 1、DNADNA复制的特征复制的特征2 2、参与参与DNADNA复制的物质复制的物质3 3、DNADNA生物合成过程生物合成过程5 5、逆转录和其他复制方式、逆转录和其他复制方式4

3、4、DNADNA损伤与修复损伤与修复一、一、DNADNA的的复制复制 (replication)(replication)由亲代由亲代DNADNA合成两个相同的子代合成两个相同的子代 DNADNA的过程。的过程。复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA（一）（一）DNA复制的复制的特征特征n 半保留复制半保留复制 （semi-conservative replication）n 半不连续复制半不连续复制 （semi-discontinuous replication）n 双向复制双向复制 （bidirectional replication）n 有特定的起点有特定的起点子链继承母链遗传信息的几种可

4、能方式子链继承母链遗传信息的几种可能方式 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 一、半保留复制一、半保留复制（一）半保留复制的定义（一）半保留复制的定义 复制时，母链的双链复制时，母链的双链DNA解开成两股单链，各解开成两股单链，各自作为模板指导子代合成新的互补链。子代细胞的自作为模板指导子代合成新的互补链。子代细胞的DNA双链，其中一股单链从亲代完整地接受过来，双链，其中一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全重新合成。由于碱基互补，两个另一股单链则完全重新合成。由于碱基互补，两个子细胞的子细胞的DNA双链，都和亲代母链双链，都和亲代母链DNA碱基序列一碱基序列一致。这种复

5、制方式称为致。这种复制方式称为半保留复制半保留复制。AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链母链DNA 复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉子代子代DNA （二）半保留复制的实验依据（二）半保留复制的实验依据（三）半保留复制的意义（三）半保留复制的意义 使亲代使亲代DNA所含的信息以极高的准确度所含的信息以极高的准确度传递给子代传递给子代DNA分子。分

6、子。3 5 3 5 解链方向解链方向35335领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)二二、复制的半不连续性、复制的半不连续性DNA双螺旋的两条链是反平行的，而双螺旋的两条链是反平行的，而DNA合成的合成的方向只能是方向只能是53。在在DNA复制时，复制时，1条链的合成方向和复制叉的前条链的合成方向和复制叉的前进方向相同，可以连续复制，叫作进方向相同，可以连续复制，叫作前导链前导链（leading strand）；而另一条链的合成方向和）；而另一条链的合成方向和复制叉的前进方向正好相反，不能连续复制，只复制叉的前进方向正好相反，不能连续复制，只能

7、分成几个片段（能分成几个片段（冈崎片段）冈崎片段）合成，称之为合成，称之为滞后滞后链链（lagging strand）。）。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的的半不连续复制半不连续复制。三三、双向复制、双向复制 双向复制的定义双向复制的定义 复制时，复制时，DNA从从起始点（起始点（origin）向两个方向解链，形成两个延伸方向相向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为反的复制叉，称为双向复制双向复制。53oriorioriori535533553复制子复制子3真核生物的双向复制真核生物的双向复制四、四、有特定的起始点有特定的起始点

8、u原核生物只有一个复制起始点原核生物只有一个复制起始点u真核生物有多个复制起始点真核生物有多个复制起始点（二）（二）参与参与DNA复制的复制的物质物质1底物：四种底物：四种 dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP2聚合酶：依赖聚合酶：依赖DNA的的DNA聚合酶，聚合酶，DNA-pol；3模板：指解开成单链的模板：指解开成单链的DNA母链；母链；4引物：提供引物：提供3OH末端，使末端，使dNP可以依可以依 次聚合；次聚合；5其他酶和蛋白质因子。其他酶和蛋白质因子。参与复制的主要酶类参与复制的主要酶类（一）（一）DNA聚合酶聚合酶（二）解链解旋酶（二）解链解旋酶（三）引物酶（三）引物酶

9、（四）（四）DNA连接酶连接酶u DNA聚合酶聚合酶全称：依赖全称：依赖DNA的的DNA聚合酶（聚合酶（DDDP）缩写：缩写：DNApol活性：活性：1.53 的聚合活性的聚合活性 2.核酸外切酶核酸外切酶活性活性复制的化学反应复制的化学反应在聚合酶的作用下，一个核苷酸在聚合酶的作用下，一个核苷酸 5 5-P和和相邻的核苷酸上核糖的相邻的核苷酸上核糖的3-OH生成磷酸二生成磷酸二酯键而逐一聚合的形成多核苷酸链。酯键而逐一聚合的形成多核苷酸链。（dNMP）ndNTP（dNMP）n+l ppi5 A G C T T C A G G A T A 3|3 T C G A A G T C C T A G

10、 C G A C 5 3 5 外切酶活外切酶活性性 5 3 外切酶活性外切酶活性?能切除能切除RNA引物和突变的引物和突变的 DNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。核酸外切酶活性核酸外切酶活性 1原核生物的原核生物的DNA聚合酶聚合酶DNA-pol IDNA-pol IIDNA-pol（1）DNA聚合酶聚合酶：结构特点结构特点单一多肽链，从单一多肽链，从N端到端到C端有端有3个酶促活个酶促活性结构域依次排列：性结构域依次排列：53外切酶、外切酶、35外切酶和外切酶和DNA聚合酶。聚合酶。DNA Pol I在蛋白酶的作用下，可分为大、在蛋白酶的作用下，

11、可分为大、小两个片段。小片段具有小两个片段。小片段具有53外切外切酶活性。大片段（又称为酶活性。大片段（又称为Klenow片段）片段）具有聚合酶活性及具有聚合酶活性及35 外切酶活性，外切酶活性，它对核酸技术十分有用。它对核酸技术十分有用。323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外核酸外切酶活性切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活核酸外切酶活性性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行，进行分子生物学研究中常用的工具酶。分子生物学研究中常用的工具酶。

12、DNA-pol I在活细胞内的功能在活细胞内的功能1）53聚合酶的活性：对复制和修复聚合酶的活性：对复制和修复中出现的空隙进行填补。中出现的空隙进行填补。2）35外切酶活性：对复制中错误进外切酶活性：对复制中错误进行即时校读，保证复制的准确性。行即时校读，保证复制的准确性。3）53外切酶活性：可去除外切酶活性：可去除RNA引物引物和突变碱基。和突变碱基。（2）DNA-pol II 53聚合酶活性聚合酶活性35外切酶活性外切酶活性无无53外切酶活性外切酶活性它只是在无它只是在无pol I及及pol 的情况下才起作用，的情况下才起作用，其真正的功能也未完全清楚，可能在其真正的功能也未完全清楚，可能

13、在损伤修损伤修复中有特殊作用。复中有特殊作用。（3）DNA pol-结构特点结构特点由由1010种亚基组成不对称异源二聚体。种亚基组成不对称异源二聚体。核心酶（核心酶（）亚基：亚基：53 聚合酶活性聚合酶活性 亚基：亚基：3 5外切酶活性和碱基选择功能外切酶活性和碱基选择功能 亚基亚基:可能起组装作用可能起组装作用亚基：夹稳模板链并使酶沿模板链滑动亚基：夹稳模板链并使酶沿模板链滑动复合物：促进全酶组装至模板及增强核心复合物：促进全酶组装至模板及增强核心 酶活性酶活性DNA-pol (250kD)DNA-pol 在活细胞内的功能在活细胞内的功能53聚合酶的活性：聚合酶的活性：是在复制延长中真正催

14、化新链核苷酸聚合的是在复制延长中真正催化新链核苷酸聚合的酶。酶。35外切酶活性：外切酶活性：对复制中错误进行即时校对复制中错误进行即时校读，保证复制的准确性。读，保证复制的准确性。催化催化DNA聚合聚合参与参与DNA损损伤的应急状态伤的应急状态修复修复修复合成、修复合成、切除引物、切除引物、填补空隙填补空隙功能功能2040400分子数分子数/细胞细胞1011亚基数亚基数+5 外切酶活性外切酶活性+5 外切酶活性外切酶活性+5 聚合酶活性聚合酶活性pol IIIpol IIpol IE.Coli中的中的DNA聚合酶聚合酶2真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶DNApol，。DNApo1：延长领

15、头链和随从链；：延长领头链和随从链；DNApoI：合成：合成RNA引物；引物；DNApol：校读、修复和填补缺口。：校读、修复和填补缺口。DNApol：在没有其他：在没有其他DNApol时时 发挥催化功能。发挥催化功能。DNApo1：催化线粒体：催化线粒体DNA的合成的合成真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶（二）与复制起始及解链解旋相关的酶类（二）与复制起始及解链解旋相关的酶类在复制起始时需要多种酶和蛋白因子，共同在复制起始时需要多种酶和蛋白因子，共同起解开、理顺起解开、理顺DNA链，维持链，维持DNA在一段时间在一段时间内处于单链状态的作用。内处于单链状态的作用。1.与复制起始及解链相关

16、的酶类及蛋白与复制起始及解链相关的酶类及蛋白（1）DnaA蛋白蛋白（2）DnaB蛋白（解螺旋酶）蛋白（解螺旋酶）（3）DnaC蛋白蛋白（1）DnaA蛋白蛋白DnaA蛋白是由相同亚基组成的四聚体。蛋白是由相同亚基组成的四聚体。复制起始时，复制起始时，DnaA蛋白辨认并结合蛋白辨认并结合E.coli上上复制起始点复制起始点oriC，1020个DnaA蛋白相互靠近形成蛋白相互靠近形成DNA蛋白质复合蛋白质复合体结构，促使体结构，促使oriC局部解链。局部解链。E.Coli 基因图基因图复制起始点（复制起始点（E E.coli-oriC.coli-oriC）GATTNTTTATTT GATCTNTTN

17、TATT GATCCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATTACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245串联重复序列串联重复序列反向重复序列反向重复序列5 3 5 3 识别区识别区AT富含区富含区（2 2）DnaB蛋白蛋白解螺旋酶解螺旋酶、复制蛋白复制蛋白rep，利用利用ATPATP供能，作供能，作用于氢键，使用于氢键，使DNADNA双链解开成为两条单链。双链解开成为两条单链。Dna BDna C解链

18、方向解链方向（3）DnaC蛋白蛋白 Dna C蛋白的作用是将具有解链酶活性的蛋白的作用是将具有解链酶活性的Dna B蛋白运送到复制模板，并协同蛋白运送到复制模板，并协同Dna B 蛋蛋白的作用。白的作用。解解链链过过程程中中，DNADNA分分子子会会过过度度拧拧紧紧、打打结结、缠绕、连环等现象。缠绕、连环等现象。2DNA拓扑异构酶拓扑异构酶（DNA topoisomerase）DNADNA拓扑异构酶，改变拓扑异构酶，改变DNADNA分子构象，分子构象，理顺理顺DNADNA链，使复制能顺利进行。链，使复制能顺利进行。分类：拓扑酶分类：拓扑酶和拓扑酶和拓扑酶作用特点：对作用特点：对DNA分子的作用

19、是既能水分子的作用是既能水解，又能连接磷酸二酯键。解，又能连接磷酸二酯键。DNA分子一边解链，一边复制，拓扑酶分子一边解链，一边复制，拓扑酶是在复制全过程中都是有作用的。是在复制全过程中都是有作用的。拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，闭切口，DNA变为松弛状态变为松弛状态。反应反应不需不需ATP。拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA分子分子两股两股链，断端通过链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。切口旋转使超螺旋松弛。利用利用ATP供能，连接断端，供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。分子进入

20、负超螺旋状态。作用机制作用机制 拓扑异构酶拓扑异构酶作用机制：作用机制：3单链单链DNA结合蛋白结合蛋白单链单链DNA结合蛋白（结合蛋白（single stranded DNA binding protein，SSB）的作用是在复制中的作用是在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。维持模板处于单链状态并保护单链的完整。模板的模板的DNA总要处于单链状态，而总要处于单链状态，而DNA分子只分子只要符合碱要符合碱基基配对，又总会有形成双链的倾向，配对，又总会有形成双链的倾向，以使分子达到稳定状态和免受胞内广泛存在的以使分子达到稳定状态和免受胞内广泛存在的核酸酶降解。核酸酶降解。（三）引物酶（

21、三）引物酶DNA聚合酶不能从头合成聚合酶不能从头合成DNA链，只能延长已链，只能延长已有的有的DNA或或RNA引物链。引物链。引物酶引物酶（primase）在复制起始时催化）在复制起始时催化引物引物（primerprimer）合成，合成，提供提供3 3-OHOH末端，使末端，使DNA-polDNA-pol能够催化能够催化dNTPdNTP聚合。聚合。引物酶属引物酶属DNA指导的指导的RNA 聚合酶，但不同于聚合酶，但不同于催化转录过程的催化转录过程的RNA聚合酶。在聚合酶。在E.coli，引物，引物酶是酶是dnaG基因的产物基因的产物DnaG。（四）（四）DNA连接酶连接酶（DNA ligase

22、）连接连接DNA链链3-OH末端和相邻末端和相邻DNA链的链的5 P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的邻的DNA链连成完整的链。链连成完整的链。特点：连接酶连接碱基互补基础上的双链中的特点：连接酶连接碱基互补基础上的双链中的单链缺口，它并没有连接单独存在的单链缺口，它并没有连接单独存在的DNA单链单链或或RNA单链的作用。单链的作用。功能：在复制中起最后接合缺口的作用，在功能：在复制中起最后接合缺口的作用，在DNA修复、重组、剪接中也起缝合缺口作用，修复、重组、剪接中也起缝合缺口作用，也是也是基因工程的重要工具酶之一基因工程的重要工具酶之一。H

23、O5335DNA连接酶连接酶ATPADP5353三种酶催化生成磷酸二酯键的比较三种酶催化生成磷酸二酯键的比较三三、原核生物、原核生物DNA生物合成生物合成（一）复制的起始（一）复制的起始（二）复制的延长（二）复制的延长（三）复制的终止（三）复制的终止1、DNA解链解链2、引发体的形成并合成引物、引发体的形成并合成引物3、超螺旋的转型、超螺旋的转型（一）复制的起始（一）复制的起始DnaADnaA蛋白辨认起始点蛋白辨认起始点,形成起始复合物形成起始复合物DnaBDnaB蛋白解螺旋蛋白解螺旋DnaCDnaC蛋白协助蛋白协助DnaBDnaB在多种蛋白质参与下，在多种蛋白质参与下，DNADNA解开成单链

24、解开成单链SSBSSB维持单链稳定维持单链稳定 Dna A Dna B、Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 引发体的形成引发体的形成含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为复制起始区域的复合结构称为引发体引发体。引物的合成引物的合成Dna ADna B、Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物酶引物酶OHSSB3 5 3 5 引物酶引物酶OH（三）超螺旋的转型（三）超螺旋的转型解链将导致下游发生打结现象或解链将导致下游发生打结现象或DNA超螺超螺旋的其他部分过度拧转。旋的其他部分过度拧转。拓扑酶通过切断、

25、旋转和再连结的作用，拓扑酶通过切断、旋转和再连结的作用，实现实现DNA超螺旋的转型超螺旋的转型。复制起始的过程复制起始的过程1DnaA蛋白辨认结合蛋白辨认结合oriC的重复序列，并与的重复序列，并与DNA形成复合物，引起解链；形成复合物，引起解链；2DnaB在在DnaC的辅助下结合于初步打开的双的辅助下结合于初步打开的双链，并用其解螺旋酶活性开链；链，并用其解螺旋酶活性开链；3拓扑酶通过切断、旋转和再连结的作用，实拓扑酶通过切断、旋转和再连结的作用，实现现DNA超螺旋的转型；超螺旋的转型；4SSB结合在已开链的结合在已开链的DNA模板上，使模板上，使DNA在一定的范围内保持开链状态。在一定的范

26、围内保持开链状态。5引物酶介入，形成的引发体，可按照模板的引物酶介入，形成的引发体，可按照模板的配对序列，催化配对序列，催化NTP的聚合，生成引物。的聚合，生成引物。（二）复制的延长（二）复制的延长脱氧单核苷酸逐个加入而延长脱氧单核苷酸逐个加入而延长DNA新链，新链，其化学反应本质是生成磷酸二酯键。其化学反应本质是生成磷酸二酯键。催化此反应的酶：催化此反应的酶：原核生物：原核生物：DNA-pol 真核生物：真核生物：DNA-pol催化不连续复制催化不连续复制 DNA-pol催化连续复制催化连续复制（）复制延长的生化过程（）复制延长的生化过程复制起始时，母链即已解开，两股单链复制起始时，母链即已

27、解开，两股单链都是模板，其作用是按碱基配对规律指都是模板，其作用是按碱基配对规律指引核苷酸加入到新链引核苷酸加入到新链。每次加入的单个核苷酸，都是以每次加入的单个核苷酸，都是以dNTP为为原料，复制时子链从原料，复制时子链从5向向3延长。延长。复制延长速度相当快。复制延长速度相当快。E.coli每秒钟能加每秒钟能加入的核苷酸数达入的核苷酸数达2500个。个。（二）复制的半不连续性和冈崎片段（二）复制的半不连续性和冈崎片段在形成双螺旋结构时，在形成双螺旋结构时，DNA双链的走向是双链的走向是相反的。相反的。复制经解链后，两股单链在复制叉上也是复制经解链后，两股单链在复制叉上也是走向相反。走向相反

28、。复制，包括引物合成，只能从复制，包括引物合成，只能从5向向3延伸。延伸。而在同一复制叉上，解链的方向只可能有而在同一复制叉上，解链的方向只可能有一个。一个。复制方向与解链方向不一致复制方向与解链方向不一致 可以理解不连续复制的成因可以理解不连续复制的成因1 1领头链连续复制领头链连续复制顺着解链方向而生成的子链，复制是连顺着解链方向而生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链（续进行的，这股链称为领头链（leading strand)。2随从链不连续复制随从链不连续复制复制的方向与解链方向相反生成的子链称为复制的方向与解链方向相反生成的子链称为随从链随从链（lagging strand）

29、。随从链随从链的复制必须等待模板链解开至足够长的复制必须等待模板链解开至足够长度，才能从度，才能从53方向生成引物然后复制。方向生成引物然后复制。随从链随从链在延长时，又要等到下一段暴露出足在延长时，又要等到下一段暴露出足够长而度的模板，够长而度的模板，再次再次生成引物而延长。这生成引物而延长。这就是不连续复制。就是不连续复制。随从链的合成随从链的合成随从链随从链3冈崎片段冈崎片段随从链不连续复制的片段称为冈崎片段，随从链不连续复制的片段称为冈崎片段，其大小在其大小在10002000个核苷酸。个核苷酸。每一个不连续复制的片段每一个不连续复制的片段5-端都带有一端都带有一个个RNA引物。引物。片

30、段的复制完成后，片段的复制完成后，RNA引物会被除去引物会被除去而代之以而代之以DNA片段，因此复制至最后，片段，因此复制至最后，两股子链都是两股子链都是DNA链。链。冈崎片段冈崎片段3 3 5 5 3 3 5 5 解链方向解链方向3 35 53 33 35 5冈崎片段冈崎片段在同一个复制叉上，领头链在同一个复制叉上，领头链的复制先于后随链，但两链的复制先于后随链，但两链是在是在同一同一DNApol 催化下催化下进行。即随从链的模板可折进行。即随从链的模板可折叠或环绕成环状，与前导链叠或环绕成环状，与前导链正在延长的区域对齐，使领正在延长的区域对齐，使领头链和随从链的生长点都处头链和随从链的生

31、长点都处在在DNApol 催化位点上。催化位点上。解链方向就是酶的前进方向，解链方向就是酶的前进方向，也是复制叉延伸方向。也是复制叉延伸方向。复复制制延延长长简简图图（三）复制的终止（三）复制的终止原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制的，双向复制的复制片段在复制的终止点复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。处汇合。复制的起始点和终止点刚好把环状复制的起始点和终止点刚好把环状DNA分为两个半圆，两个方向各进行分为两个半圆，两个方向各进行180，同，同时在终止点汇合。时在终止点汇合。为了定位方便，习惯把为了定位方便，习惯把E.coli的的DNA分为分为100等分。等分。E.col

32、i复制起始点复制起始点oriC在在82位位点，复制终点点，复制终点ter（termination）在）在32位位点。点。Ecoli 基因图基因图oriter E.coli8232teroriC5 5 DNA-pol 5 OHP5 DNA-pol dNTP5 5 P5 5 ATP ADP+PiDNA连接酶连接酶 随从链上不连续性片段的连接随从链上不连续性片段的连接逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways第四节第四节逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase)逆转录逆转录 逆转

33、录酶逆转录酶一、逆转录病毒和逆转录酶一、逆转录病毒和逆转录酶 （一）逆转录（一）逆转录在逆转录酶的作用下以在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成为模板合成DNA的过程。此过程中，核酸合成与转的过程。此过程中，核酸合成与转录（录（DNARNA）过程遗传信息的流动）过程遗传信息的流动方向相反（方向相反（RNADNA），故称为），故称为逆转逆转录（录（reverse transcription)。（二）逆转录病毒（二）逆转录病毒RNA病毒的基因组是病毒的基因组是RNA而不是而不是DNA，其复制，其复制方式是逆转录，故称为方式是逆转录，故称为逆转录病毒逆转录病毒（retrovirus）。）。RNA病毒感

34、染活细胞后，要先经逆转录成为双病毒感染活细胞后，要先经逆转录成为双链链DNA，通过基因重组方式，参加入宿主细胞，通过基因重组方式，参加入宿主细胞基因组，并随宿主细胞复制和表达。这种重组方基因组，并随宿主细胞复制和表达。这种重组方式称为整合（式称为整合（integration）。）。病毒基因的整合可能是病毒致癌的重要方式。病毒基因的整合可能是病毒致癌的重要方式。（三）逆转录酶（三）逆转录酶能催化以单链能催化以单链RNA为模板合成双链为模板合成双链DNA的反应的反应的酶称为的酶称为逆转录酶（逆转录酶（reverse transcriptase)。它兼有三种酶的活性：它兼有三种酶的活性：RNA指导的

35、指导的DNA聚合酶，聚合酶，DNA指导的指导的DNA聚合酶和聚合酶和RNase H活性。活性。所谓所谓RNase H活性是指除去杂合分子中的活性是指除去杂合分子中的RNA。它可以从它可以从53和和35两个方向水解两个方向水解DNARNA。逆转录酶和其他逆转录酶和其他DNA聚合酶一样，合成聚合酶一样，合成DNA的的方向为方向为53，并且不能从头合成，并且不能从头合成DNA，也需，也需要引物，是病毒本身的一种要引物，是病毒本身的一种tRNA。二、逆转录过程二、逆转录过程1以单链以单链RNA的基因组为模板，在逆转录酶的基因组为模板，在逆转录酶(RNA指导的指导的DNA聚合酶聚合酶)的催化下，合成一条

36、单的催化下，合成一条单链链DNA；2产产物物与与模模板板生生成成RNA DNA杂杂化化双双链链，杂杂化化双双链中的链中的RNA被逆转录酶被逆转录酶(RNase H)水解；水解；3以新合成的单链以新合成的单链DNA为模板，为模板，逆转录酶逆转录酶(DNA指导的指导的DNA聚合酶聚合酶)催化合成第二链的催化合成第二链的DNA。逆转录病毒细胞内的逆转录现象逆转录病毒细胞内的逆转录现象RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA 杂化双链杂化双链RNA酶酶单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNA逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱

37、水解 T T T T分子生物学研究可应分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方因工程目的基因的重要方法之一，此法称为法之一，此法称为cDNA法。法。以以mRNA为模板，经逆转为模板，经逆转录合成的与录合成的与mRNA碱基序列互碱基序列互补的补的DNA链。链。试管内合成试管内合成cDNA三、逆转录酶和逆转录现象的生物学意义三、逆转录酶和逆转录现象的生物学意义（一）逆转录酶和逆转录现象是分子生物（一）逆转录酶和逆转录现象是分子生物学研究中的重大发现学研究中的重大发现 RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。同样兼有遗传信息传代与表达功能。（二二）对对逆逆转

38、转录录病病毒毒的的研研究究，拓拓宽宽了了病病毒毒致癌理论。致癌理论。（三）分子生物学研究应用逆转录酶（三）分子生物学研究应用逆转录酶（cDNAcDNA法法)，作为获取基因工程目的基因，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一。的重要方法之一。第五节第五节DNA损伤（突变）与修复损伤（突变）与修复DNA Damage(Mutation)and Repair一、突变的定义一、突变的定义二、突变的意义二、突变的意义三、引发突变的因素三、引发突变的因素四、突变的分子改变类型四、突变的分子改变类型五、五、DNA损伤的修复损伤的修复一、突变的定义：一、突变的定义：个个别别脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷酸酸残残基基

39、甚甚至至片片段段DNA在在构构成成、复复制制或或表表型型功功能能上上的的异异常常变变化化，称称为为突突变变（Mutation），也也称称为为DNA损损伤伤（DNA damage）。）。遗传物质结构改变引起遗传信息的改变。遗传物质结构改变引起遗传信息的改变。二、突变的意义二、突变的意义（）突变是进化、分化的分子基础）突变是进化、分化的分子基础自发突变或自然突变自发突变或自然突变（二）突变导致基因型改变（二）突变导致基因型改变多态性：个体之间的基因型差别。多态性：个体之间的基因型差别。（三）突变导致死亡（三）突变导致死亡突变发生在对生命过程至关重要的基因上，可突变发生在对生命过程至关重要的基因上，

40、可导致个体、细胞的死亡。导致个体、细胞的死亡。（四）突变是某些疾病的发病基础（四）突变是某些疾病的发病基础 有害的突变有害的突变三、引发突变的因素三、引发突变的因素（一）自发突变（一）自发突变（二）诱发突变（二）诱发突变1物物理理因因素素：主主要要指指紫紫外外线线和和各各种种辐辐射射，如如紫紫外外线线可可引引起起DNA链链上上相相邻邻的的两两个个嘧嘧啶啶碱基碱基发生共价结合，生成嘧啶二聚体。发生共价结合，生成嘧啶二聚体。2化化学学因因素素：化化工工原原料料、化化工工产产品品和和副副产产品品，各各种种工工业业的的排排放放物物、农农药药、食食品品防防腐腐剂或添加剂，以至汽车排放的废气。剂或添加剂，

41、以至汽车排放的废气。嘧啶二聚体的形成与解聚嘧啶二聚体的形成与解聚四、突变分子改变的类型四、突变分子改变的类型 错配错配(mismatch)缺失缺失(deletion)插入插入(insertion)重排重排(rearrangement)框移框移(frame-shift)（一）错配（一）错配（mismatch）DNA分分 子子 上上 的的 碱碱 基基 错错 配配 称称 点点 突突 变变(point mutation)。点点突突变变发发生生在在基基因因的的编编码码区区域域，可导致氨基酸的改变。可导致氨基酸的改变。1.转转换换：发发生生在在同同型型碱碱基基之之间间，即即嘌嘌呤呤代代替替另一嘌呤，或嘧啶

42、代替另一嘧啶。另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。2.颠颠换换：发发生生在在异异型型碱碱基基之之间间，即即嘌嘌呤呤变变嘧嘧啶或嘧啶变嘌呤。啶或嘧啶变嘌呤。镰形红细胞贫血病人镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)亚基亚基N-val his leu thr pro val glu C 肽链肽链CAC GTG基因基因正常成人正常成人Hb(HbA)亚基亚基N-val his leu thr pro glu glu C 肽链肽链CTC GAG基因基因膀胱癌细胞膀胱癌细胞c-rasH基因点突变基因点突变（二）缺失、插入和框移突变（二）缺失、插入和框移突变缺失：缺失：一个碱基或一段核苷酸链从一个碱基或一段核苷酸链从DN

43、A大分子上消失。大分子上消失。插入：插入：原来没有的一个碱基或一段核苷原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到酸链插入到DNA大分子中间。大分子中间。框移突变：三联体密码的阅读方式改变，框移突变：三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变，其后果是翻译出的蛋白质可能完全不同其后果是翻译出的蛋白质可能完全不同。谷谷 酪酪 蛋蛋 丝丝5 G C A G U A C A U G U C 丙丙 缬缬 组组 缬缬正常正常5 G A G U A C A U G U C 缺失缺失C缺失引起框移突变缺失引起框移突变（三）重排（三）重排（rearrangement

44、）DNA分子内发生较大片段的交换，称为重组分子内发生较大片段的交换，称为重组或重排。或重排。移位的移位的DNA可以在新位点上颠倒方向反置可以在新位点上颠倒方向反置（倒位），也可以在染色体之间发生交换重（倒位），也可以在染色体之间发生交换重组。组。由基因重排引起的两种地中海贫血基因型由基因重排引起的两种地中海贫血基因型四、四、DNA损伤的修复（损伤的修复（DNA repairing）修复是指针对已发生了的缺陷而施行的补修复是指针对已发生了的缺陷而施行的补救机制。救机制。修复的主要类型：修复的主要类型：（一）光修复（一）光修复(light repairing)（二）切除修复（二）切除修复(exci

45、sion repairing)（三）重组修复（三）重组修复(recombination repairing)（四）（四）SOS修复修复 （一）光修复（一）光修复光修复过程是通过光修复酶（光修复过程是通过光修复酶（photolyase）催化而完成的，仅需催化而完成的，仅需300600nm波长照射波长照射即可活化，普遍存在于各种生物，人体细胞即可活化，普遍存在于各种生物，人体细胞中也有发现。中也有发现。通过此酶作用，可使嘧啶二聚体分解为原来通过此酶作用，可使嘧啶二聚体分解为原来的非聚合状态，的非聚合状态，DNA完全恢复正常。完全恢复正常。光修复光修复光修复酶光修复酶(photolyase)UV（二

46、）切除修复（二）切除修复（excision repairing）细胞内最重要的修复机制，包括去除损伤细胞内最重要的修复机制，包括去除损伤DNA，填补空隙和连接。，填补空隙和连接。1、原核生物、原核生物DNA损伤修复：损伤修复：UvrA，UvrB辨认及结合辨认及结合DNA损伤部位；损伤部位；UvrC在解螺旋酶的协助下切除损伤部位。在解螺旋酶的协助下切除损伤部位。DNA-pol和连接酶和连接酶填补空隙和连接。填补空隙和连接。2、真核生物、真核生物DNA损伤修复：损伤修复：XP类蛋白辨认和切除损伤类蛋白辨认和切除损伤DNA部位，切除后部位，切除后留下的空隙，则由留下的空隙，则由DNA-pol 及及加

47、以修复。加以修复。E.coli的的切除修复方式切除修复方式UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶聚合酶OHPDNA连接酶连接酶ATP（三）重组修复（三）重组修复（recombination repairing）当当DNA分子的损伤面较大，还来不及修复完善分子的损伤面较大，还来不及修复完善就进行复制时，损伤部位因无模板指引，复制就进行复制时，损伤部位因无模板指引，复制出来的新子链会出现缺口，这时，就靠重组蛋出来的新子链会出现缺口，这时，就靠重组蛋白白RecA的核酸酶活性将另一股健康的母链与的核酸酶活性将另一股健康的母链与缺口部分进行交换，以填补缺口。缺口部分进行交换，以填补缺口。损伤链移到己

48、完成复制的链上，如果损伤又只损伤链移到己完成复制的链上，如果损伤又只发生在双链发生在双链DNA中的一股单链，则下一轮的复中的一股单链，则下一轮的复制损伤链就只占制损伤链就只占DNA的的14，不断复制后，其，不断复制后，其比例就越来越低，称为把损伤链比例就越来越低，称为把损伤链“稀释稀释”掉。掉。重组修复重组修复（四）（四）SOS修复修复是一类应急性的修复方式。由于是一类应急性的修复方式。由于DNA损伤广泛损伤广泛至难以继续复制，由此而诱发出一系列复杂的至难以继续复制，由此而诱发出一系列复杂的反应。反应。在在E.coli，各各种种与与修修复复有有关关的的基基因因，组组成成一一个个称为称为调节子调节子(regulon)的网络式调控系统。的网络式调控系统。特点：反应特异性低，对碱基的识别、选择能特点：反应特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而，可存活的。然而，DNA保留的错误会较多，引保留的错误会较多，引起较广泛、长期的突变。起较广泛、长期的突变。