实验六网织红血小板计数.ppt

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1、实验六实验六v网织红细胞计数网织红细胞计数v血小板计数血小板计数要求要求v熟悉网织红细胞染色的原理及形态学特点，掌握计熟悉网织红细胞染色的原理及形态学特点，掌握计数方法，了解注意事项和临床应用。数方法，了解注意事项和临床应用。v学会镜下辨认血小板的形态，掌握血小板计数的方学会镜下辨认血小板的形态，掌握血小板计数的方法和参考值，了解注意事项及临床应用。法和参考值，了解注意事项及临床应用。红系祖细胞红系祖细胞红系祖细胞红系祖细胞 原红原红原红原红早幼红早幼红早幼红早幼红中幼红中幼红中幼红中幼红 晚幼红晚幼红晚幼红晚幼红 网织红网织红网织红网织红红细胞红细胞红细胞红细胞 一、网织红细胞计数一、网织红

2、细胞计数骨髓骨髓外周血外周血网织红细胞网织红细胞（reticulocyte,Ret）是有核红细胞转向无核到完全成熟）是有核红细胞转向无核到完全成熟红细胞的过度型细胞，其胞质中尚残留部分嗜碱性物质红细胞的过度型细胞，其胞质中尚残留部分嗜碱性物质(核糖体和核糖核糖体和核糖核酸核酸)，能被煌焦油蓝、灿烂甲酚蓝、中性红等活体染料染色。根据网，能被煌焦油蓝、灿烂甲酚蓝、中性红等活体染料染色。根据网织红细胞的形态特征和成熟程度将其分为四型：织红细胞的形态特征和成熟程度将其分为四型：I型型(丝球型丝球型)，沉淀颗粒呈致密结块的网织红细胞；，沉淀颗粒呈致密结块的网织红细胞；型型(网型网型)，沉淀颗粒呈疏松结构

3、；，沉淀颗粒呈疏松结构；型型(破网型破网型)，沉淀颗粒呈散在结构；，沉淀颗粒呈散在结构；在外周血中仅占在外周血中仅占0.15%型型(点粒型点粒型)，沉淀颗粒呈少数散在分布。多见于外周血，沉淀颗粒呈少数散在分布。多见于外周血，60%以上以上(一一)染色原理染色原理 网织红细胞内网织红细胞内RNA的磷酸基（带负电荷）能与溴甲的磷酸基（带负电荷）能与溴甲酚蓝、新亚甲蓝等碱性染料的有色反应基（带正点荷）酚蓝、新亚甲蓝等碱性染料的有色反应基（带正点荷）结合，形成核酸与碱性染料复合物的蓝黑色多聚颗粒，结合，形成核酸与碱性染料复合物的蓝黑色多聚颗粒，其颗粒又联缀成线状甚至网状。凡含有两个以上深染其颗粒又联缀

4、成线状甚至网状。凡含有两个以上深染颗粒（或具有线网状结构）的无核红细胞，即为网织颗粒（或具有线网状结构）的无核红细胞，即为网织红细胞。红细胞。(二二)试剂试剂煌焦油蓝染液（煌焦油蓝染液（1%）v煌焦油蓝煌焦油蓝 1gv枸橼酸钠枸橼酸钠 v氯化钠氯化钠 v蒸馏水加到蒸馏水加到100ml，充分溶解过滤备用。，充分溶解过滤备用。（三）操作（三）操作 显微镜计数法显微镜计数法 2d染料染料+2d全血（全血（1：1）混匀后染）混匀后染15min，倾少许玻片上，制备，倾少许玻片上，制备薄膜片，晃动玻片使迅速干燥，低倍镜浏览全片，选细胞分布均匀无薄膜片，晃动玻片使迅速干燥，低倍镜浏览全片，选细胞分布均匀无重

5、叠染色良好部位，油镜下观察重叠染色良好部位，油镜下观察1000个红细胞中网织红细胞数目。个红细胞中网织红细胞数目。v参考范围参考范围 成成 人：人：新生儿：新生儿：其它方法：其它方法：v网织红细胞计数仪网织红细胞计数仪v荧光激活细胞术荧光激活细胞术v流式细胞术流式细胞术（四）注意事项（四）注意事项v1、红细胞必须含两个或两个以上蓝色颗粒，且无需微调显微镜即可、红细胞必须含两个或两个以上蓝色颗粒，且无需微调显微镜即可见。颗粒必须远离细胞边缘，以免与变性珠蛋白小体混淆。见。颗粒必须远离细胞边缘，以免与变性珠蛋白小体混淆。v2、染色时间必须充分，当室温较低时，需适当延长染色时间或置、染色时间必须充分

6、，当室温较低时，需适当延长染色时间或置37水浴箱内水浴箱内。v3、制片应厚薄适宜，否则会造成网织红细胞分布不均。、制片应厚薄适宜，否则会造成网织红细胞分布不均。v4、网织红细胞体积较大，常在血膜尾部和两侧较多，计数应该兼顾。、网织红细胞体积较大，常在血膜尾部和两侧较多，计数应该兼顾。v5、复染会使网织红数值降低，因此不采用瑞氏染料复染，用二甲苯、复染会使网织红数值降低，因此不采用瑞氏染料复染，用二甲苯擦涂片也会使结果降低。擦涂片也会使结果降低。v6、染料配制必须祛除沉渣。、染料配制必须祛除沉渣。方法学评价方法学评价显微镜法显微镜法v可直接观察细胞形态，不需特殊仪器，其中试管法操作简便，重复性较

7、好，被可直接观察细胞形态，不需特殊仪器，其中试管法操作简便，重复性较好，被列为手工网织红细胞计数的参考方法列为手工网织红细胞计数的参考方法v但工作效率不高，实验精密度低。受主观因素影响较多，且耗时费力。但工作效率不高，实验精密度低。受主观因素影响较多，且耗时费力。仪器法仪器法 测定快速，重复性好，避免主观因素，易于标准化，测量细胞多，精确性高。测定快速，重复性好，避免主观因素，易于标准化，测量细胞多，精确性高。根据荧光强度可反映网织红细胞幼稚程度，并计算出网织红细胞成熟指数根据荧光强度可反映网织红细胞幼稚程度，并计算出网织红细胞成熟指数 但幼稚白细胞、晚幼红细胞及巨大血小板等可干扰计数结果，仪

8、器价格贵，试但幼稚白细胞、晚幼红细胞及巨大血小板等可干扰计数结果，仪器价格贵，试剂成本较高。剂成本较高。临床应用临床应用网织红细胞计数是反映骨髓红细胞造血功能的重要指标网织红细胞计数是反映骨髓红细胞造血功能的重要指标 v网织红细胞计数增多网织红细胞计数增多 溶血性贫血溶血性贫血 放疗化疗后，造血恢复放疗化疗后，造血恢复 贫血治疗有效时贫血治疗有效时 脾功能亢进脾功能亢进 红细胞生成素治疗后红细胞生成素治疗后 骨髓移植功能良好的指标骨髓移植功能良好的指标 v网织红细胞计数降低网织红细胞计数降低 再生障碍性贫血再生障碍性贫血 慢性病性贫血，如恶性肿瘤、慢性肾衰、内分泌疾病等慢性病性贫血，如恶性肿瘤

9、、慢性肾衰、内分泌疾病等二、血小板计数二、血小板计数（一）原理（一）原理v将血液用适当的稀释液稀释后，充入计数池中，计数一定将血液用适当的稀释液稀释后，充入计数池中，计数一定体积内血小板的数目，再换算成每升血液中的血小板数。体积内血小板的数目，再换算成每升血液中的血小板数。（二）试剂与器材（二）试剂与器材分为破坏红细胞稀释液：如草酸铵溶液分为破坏红细胞稀释液：如草酸铵溶液 不破坏红细胞稀释液：如红细胞稀释液不破坏红细胞稀释液：如红细胞稀释液 血细胞计数板血细胞计数板（三）操作步骤（三）操作步骤v1、2ml红细胞稀释液红细胞稀释液v2、采集、采集10ul末梢血，充分混匀末梢血，充分混匀v3、混匀

10、的血小板悬液充池，静置、混匀的血小板悬液充池，静置10min，高倍，高倍镜下计数中央大方格的血小板数。镜下计数中央大方格的血小板数。v4、计算：、计算：N*10*200*106/L参考范围参考范围 （100-300）*109/L（四）注意事项（四）注意事项v1、针刺应稍深，保证采血顺畅，忌挤压，操作要迅速，无需擦掉第一、针刺应稍深，保证采血顺畅，忌挤压，操作要迅速，无需擦掉第一滴血，若同时做其他实验时，先做血小板计数。滴血，若同时做其他实验时，先做血小板计数。v2、所用器材和稀释液必须清洁，无菌无尘。器材应标准化、所用器材和稀释液必须清洁，无菌无尘。器材应标准化v3、血小板易聚集，充池前应充分

11、混匀但不能用力太大，会破坏血小板、血小板易聚集，充池前应充分混匀但不能用力太大，会破坏血小板v4、待血小板下沉后再计数，否则结果偏低、待血小板下沉后再计数，否则结果偏低v5、应在、应在1h内计数完毕，否则结果偏低内计数完毕，否则结果偏低v6、注意血小板与杂质、结晶等区别。、注意血小板与杂质、结晶等区别。v7.检查前，应避免服用影响到血小板功能的药物检查前，应避免服用影响到血小板功能的药物（五）方法学评价（五）方法学评价v目视显微镜法目视显微镜法 不需特殊仪器，操作简便，成本低，但影响因素较多，耗时费力。不需特殊仪器，操作简便，成本低，但影响因素较多，耗时费力。v血细胞分析仪法血细胞分析仪法 重

12、重复复性性好好，测测定定速速度度快快，适适用用于于临临床床应应用用。目目前前血血细细胞胞分分析析仪仪逐逐步步普普及及，一一般般均均以以全全血血作作为为标标本本。但但由由于于血血细细胞胞分分析析仪仪不不能能完完全全将将血血小小板板与与其其他他类类似似大大小小的的物物质质(如如红红细细胞胞或或白白细细胞胞碎碎片片、灰灰尘尘等等杂杂物物)区区别别开开来来，因因此此计计数数结果有时仍需显微镜目视计数法来作校正。结果有时仍需显微镜目视计数法来作校正。（六）临床意义（六）临床意义v1生理性生理性 正常人血小板数正常人血小板数1d内可有内可有6%10%的变化，表现为的变化，表现为 早晨较低，午后较高；早晨较

13、低，午后较高；春季较低，冬季略高；春季较低，冬季略高；平原较低，高原较高；平原较低，高原较高；月经前较低，月经后较高；月经前较低，月经后较高；妊娠中晚期升高，分娩后即降低；妊娠中晚期升高，分娩后即降低；运动后升高，休息后恢复；运动后升高，休息后恢复；静脉血比毛细血管血高静脉血比毛细血管血高10%。v2病理性病理性（1）血小板减少：血小板减少：血小板数量低于血小板数量低于100109/L，原因：原因：血小板生成障碍：血小板生成障碍：如再障、巨幼贫、急白、骨髓纤维化、如再障、巨幼贫、急白、骨髓纤维化、放射线损伤；放射线损伤；血小板破坏增加血小板破坏增加：如：如ITP、脾亢；、脾亢；血小板消耗增多血

14、小板消耗增多：如：如DICDIC、TTPTTP、SLESLE、输血后血小板减少症、输血后血小板减少症 血小板分布异常血小板分布异常：如脾肿大（肝硬化）、血液被稀释（输：如脾肿大（肝硬化）、血液被稀释（输入大量库存血或血浆）入大量库存血或血浆）（2）血小板增多：血小板增多：数量超过数量超过400109/L。原因：。原因：骨骨髓髓增增生生性性疾疾病病：如如原原发发性性血血小小板板增增多多症症、真真性性红红细细胞胞增增多多症症、慢性粒细胞白血病；慢性粒细胞白血病；急性大出血、急性溶血急性大出血、急性溶血；脾切除后脾切除后；感染及炎症性疾病感染及炎症性疾病：如骨髓炎、结核病、：如骨髓炎、结核病、急性急性风湿热、类风关风湿热、类风关肿瘤；肿瘤；不明原因的血小板增高标本中，约不明原因的血小板增高标本中，约5050来自恶性疾病患者来自恶性疾病患者其他其他：外科手术或创伤后、肾上腺皮质醇：外科手术或创伤后、肾上腺皮质醇增多症、肾病综合征增多症、肾病综合征