实验五细菌的革兰氏染色.ppt

《实验五细菌的革兰氏染色.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验五细菌的革兰氏染色.ppt（14页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、实验五实验五 细菌的革兰氏染色法细菌的革兰氏染色法一一、实验目的、实验目的了解革兰氏染色法的原理，学了解革兰氏染色法的原理，学习并掌握革兰氏染色方法习并掌握革兰氏染色方法。二、实验原理：二、实验原理：细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必

2、须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。其形态和结构。其形态和结构。其形态和结构。常用碱性染料进行简单染色，这是因为细菌的等电点较常用碱性染料进行简单染色，这是因为细菌的等电点较常用碱性染料进行简单染色，这是因

3、为细菌的等电点较常用碱性染料进行简单染色，这是因为细菌的等电点较低，约在低，约在低，约在低，约在pH 2pH 2pH 2pH 25 5 5 5之间，故在中性、碱性或弱碱性溶液中，之间，故在中性、碱性或弱碱性溶液中，之间，故在中性、碱性或弱碱性溶液中，之间，故在中性、碱性或弱碱性溶液中，菌菌菌菌体蛋白质电离后带负电荷，易与带正电荷的碱性染料如结晶体蛋白质电离后带负电荷，易与带正电荷的碱性染料如结晶体蛋白质电离后带负电荷，易与带正电荷的碱性染料如结晶体蛋白质电离后带负电荷，易与带正电荷的碱性染料如结晶紫、碱性复红、沙黄（番红）等结合，紫、碱性复红、沙黄（番红）等结合，紫、碱性复红、沙黄（番红）等结

4、合，紫、碱性复红、沙黄（番红）等结合，使细菌被染成紫色或使细菌被染成紫色或使细菌被染成紫色或使细菌被染成紫色或红色。红色。红色。红色。革兰氏染色法是革兰氏染色法是18841884年由丹麦病理学家所创年由丹麦病理学家所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（氏阳性菌（G G+）和革兰氏阴性菌（）和革兰氏阴性菌（G G）两大类，）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为能将细菌分为G G+菌和菌和G G菌，是由这两类菌的细胞菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。壁结构

5、和成分的不同所决定的。G-G-菌菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫-碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成色，再经番红复染后就成红色红色。G+G+菌菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，肽聚糖

6、层的孔径缩小，通透性降低，保保留结晶紫留结晶紫-碘复合物在细胞膜上，碘复合物在细胞膜上，因此细因此细菌仍保留初染时的颜色菌仍保留初染时的颜色紫色紫色。三、实验仪器及材料三、实验仪器及材料1.1.仪器：显微镜、酒精灯等仪器：显微镜、酒精灯等 2.2.实验材料：实验材料：菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌 染色剂：草酸铵结晶紫染液、碘液、染色剂：草酸铵结晶紫染液、碘液、番红、番红、95%95%乙醇乙醇 四、实验内容与步骤四、实验内容与步骤革兰氏染色流程图革兰氏染色流程图涂片涂片涂片涂片 干燥干燥干燥干燥 结晶紫染色结晶紫染色结晶紫染色结晶紫染色碘液媒染碘液媒染碘液媒染碘液

7、媒染 水洗水洗水洗水洗 95%95%95%95%酒精脱色酒精脱色酒精脱色酒精脱色 水洗水洗水洗水洗 番红染色番红染色番红染色番红染色 水洗水洗水洗水洗 晾干晾干晾干晾干 镜检镜检镜检镜检固定固定固定固定水洗水洗水洗水洗 1 1 1 1涂片涂片涂片涂片 取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少

8、菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的量菌种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的量菌种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的量菌种与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，薄层，薄层，薄层，涂布面不宜过大涂布面不宜过大涂布面不宜过大涂布面不宜过大。2 2 2 2干燥干燥干燥干燥 涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一

9、端的两侧，小心地在快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加切勿紧靠火焰或加切勿紧靠火焰或加切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。热时间过长，以防标本烤枯而变形。热时间过长，以防标本烤枯而变形。热时间过长，以防标本烤枯而变形。3 3固定固定 固固定定常常常常利利用用高高温温，手手持持载载玻玻片片的的一一端端，标标本

10、本向向上上，在在酒酒精精灯灯火火焰焰外外层层尽尽快快的的来来回回通通过过23次次，共共约约23秒秒钟钟，并并不不时时以以载载玻玻片片背背面面加加热热触触及及皮皮肤肤，不不觉觉过过烫烫为为宜宜（不不超超过过60）,放放置置待冷后，待冷后，进行染色。进行染色。4 4初染初染 用用草酸铵结晶紫草酸铵结晶紫染色染色1-2min1-2min后倾去染液，水洗至流出水无色。后倾去染液，水洗至流出水无色。5 5、媒染、媒染 先用碘液冲去残留水迹，再加先用碘液冲去残留水迹，再加碘液覆盖碘液覆盖媒染媒染1min1min后水洗。后水洗。6 6脱色脱色 斜斜置置载载玻玻片片，滴滴加加95乙乙醇醇脱脱色色，至至流流出出

11、的的乙乙醇醇不不现现紫紫色色为为止，大约需时止，大约需时2030s，随即水洗，随即水洗。7 7复染复染 将将玻玻片片上上残残留留水水用用吸吸水水纸纸吸吸去去，用用番番红红染染液液复复染染1min，水洗，吸去残水晾干。，水洗，吸去残水晾干。8 8、镜检、镜检 待标本片置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物待标本片置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。绘出细菌的形态后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。绘出细菌的形态图并说明图并说明革兰氏染色的结果革兰氏染色的结果。9.9.混合涂片染色混合涂片染色 注意事项：注意事项：1.1.1.1.革兰氏染色成败的关键是革兰氏染色成败的

12、关键是革兰氏染色成败的关键是革兰氏染色成败的关键是酒精脱色酒精脱色酒精脱色酒精脱色。如脱色。如脱色。如脱色。如脱色 过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性 菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被 染成革兰氏阳性菌。染成革兰氏阳性菌。染成革兰氏阳性菌。染成革兰氏阳性菌。2.2.2.2.菌龄也有影响。若菌龄太老，由于菌体死亡菌龄也有影响。若菌龄太老，由于菌体死亡菌龄也有影响

13、。若菌龄太老，由于菌体死亡菌龄也有影响。若菌龄太老，由于菌体死亡 或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。3.3.3.3.不要涂片太厚，会造成假阴性或假阳性。不要涂片太厚，会造成假阴性或假阳性。不要涂片太厚，会造成假阴性或假阳性。不要涂片太厚，会造成假阴性或假阳性。五、实验结果：五、实验结果：紫色菌：紫色菌：革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌 红色菌：色菌：革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌六、思考题六、思考题1、造成革兰氏染色结果不正确（假阴、造成革兰氏染色结果不正确（假阴性或假阳性）的主要原因有哪些？性或假阳性）的主要原因有哪些？2、你认为革兰氏染色法中那个步骤可、你认为革兰氏染色法中那个步骤可以省略？在什么情况下？以省略？在什么情况下？