植物组织培养之具体植物.ppt

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1、植物组织与器官培养植物组织与器官培养植物组织培养：在无菌条件下，将离体植物组织培养：在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞、胚胎、原生的植物器官、组织、细胞、胚胎、原生质体等培养在人工配置的培养基上，给质体等培养在人工配置的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽，或者长成新的完整植株的一种潜伏芽，或者长成新的完整植株的一种实验技术。实验技术。植物器官培养：将植株上的各种器官从植物器官培养：将植株上的各种器官从母体上分离出来，放在无菌的人工环境母体上分离出来，放在无菌的人工环境中让其进一步发育，最终长成幼苗的过中让其进一步发育，最终长成幼苗

2、的过程。程。植物离体无性繁殖植物离体无性繁殖简称离体繁殖简称离体繁殖（in vitroin vitro propagation propagation)、微微型繁殖型繁殖（micropropagationmicropropagation)，是指利用离体是指利用离体培养技术将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶培养技术将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，并在短期内获得大量遗传性一致的个体的方并在短期内获得大量遗传性一致的个体的方法（技术）。法（技术）。用这种方法得到的植株群体来自一个单株用这种方法得到的植株群体来自一个单株（或一个

3、单芽），它们遗传组成相同，这些（或一个单芽），它们遗传组成相同，这些株群可称株群可称单株无性系单株无性系。近近400种植物离体繁殖已获成功。兰花、无种植物离体繁殖已获成功。兰花、无子西瓜、马铃薯、杨树等已在种苗生产上广子西瓜、马铃薯、杨树等已在种苗生产上广泛应用。泛应用。植物离体无性繁殖的意义（优越性）植物离体无性繁殖的意义（优越性）繁殖速度快，经济效益高繁殖速度快，经济效益高占用空间小，不受季节限制，占用空间小，不受季节限制，便于工厂化育苗便于工厂化育苗繁殖各种珍稀、涉危苗木和繁殖各种珍稀、涉危苗木和突变体，为育种服务突变体，为育种服务离体繁殖周期：离体繁殖周期：13个月个月繁殖系数：几十繁

4、殖系数：几十几百倍几百倍又称快繁又称快繁离体繁殖是建立在离体繁殖是建立在体细胞系的基础上，体细胞系的基础上，是在人工控制的环是在人工控制的环境条件下，不会造境条件下，不会造成性状分离，也不成性状分离，也不会退化，同时还可会退化，同时还可避免病虫害的侵染。避免病虫害的侵染。手指玫瑰手指玫瑰 植物离体无性繁殖的方式植物离体无性繁殖的方式器官发生型器官发生型(organogenesis type)(organogenesis type)胚状体发生型胚状体发生型(embryogenesis type)(embryogenesis type)不定芽型（不定芽型（adventitious bud type

5、)adventitious bud type)器官型器官型(organ type)(organ type)原球茎型原球茎型(protocorm type)(protocorm type)球茎芽型球茎芽型 块茎型块茎型鳞茎型鳞茎型孢子型孢子型根茎型根茎型 微枝扦插型微枝扦插型 器官发生型器官发生型(organogenesis type)(organogenesis type)：诱导器官外植体产生诱导器官外植体产生愈伤组织愈伤组织，经分化培，经分化培养形成芽、根再生成植株的方式。养形成芽、根再生成植株的方式。技术关键：外植体诱导产生的愈伤组织要早技术关键：外植体诱导产生的愈伤组织要早期挑选，使其来

6、源尽量一致。期挑选，使其来源尽量一致。特点：繁殖速度快；培养经愈伤组织阶段再特点：繁殖速度快；培养经愈伤组织阶段再生成植株，遗传性不稳定，易产生变异。生成植株，遗传性不稳定，易产生变异。芦荟、烟草、油菜等芦荟、烟草、油菜等 无菌母株制备无菌母株制备增殖、分化增殖、分化植株再生及鉴定植株再生及鉴定炼苗和移植炼苗和移植基基本本程程序序与与技技术术培养基中激素配比培养基中激素配比激素种类及浓度激素种类及浓度基本培养基组成基本培养基组成渗透压渗透压逐步过渡逐步过渡培养基筛选培养基筛选材料灭菌材料灭菌芦荟组织培养快速繁殖材料和培养基材料和培养基101015cm15cm高的芦荟幼苗高的芦荟幼苗愈伤组织诱导

7、培养基愈伤组织诱导培养基 MSMS(1-6mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA(1-6mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA分化培养基分化培养基MSMS(2-4mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA(2-4mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA生根培养基生根培养基MSMS(0.1-0.5mg/L)IBA+(2-5mg/L)(0.1-0.5mg/L)IBA+(2-5mg/L)多效唑多效唑繁殖方法繁殖方法愈伤组织培养愈伤组织培养 外植体：茎尖外植体：茎尖外植体消毒：酒精升汞外植体消毒：酒精升汞培养基：愈伤组织诱导培养基培养基：愈伤组织诱导培养基培养条件：温

8、度培养条件：温度 252252 光照光照 100010002000lx 102000lx 1012h/d12h/d培养时间培养时间 151525d 25d（形成愈伤）（形成愈伤）繁殖方法繁殖方法继代培养继代培养种子种子 愈伤切块愈伤切块培养基及条件培养基及条件 同愈伤组织培养同愈伤组织培养培养时间培养时间 1030分化培养分化培养种子种子 愈伤切块愈伤切块培养基培养基 分化培养基分化培养基培养条件培养条件 同愈伤组织培养同愈伤组织培养培养时间培养时间 3050d（出芽，叶）（出芽，叶）生根培养生根培养材料材料 3cm高的幼苗高的幼苗培养基培养基 生根培养基生根培养基培养条件培养条件 同愈伤培养

9、同愈伤培养培养时间培养时间 15d炼苗炼苗 选材选材 苗高苗高510cm，健壮，健壮清洗培养基，喷水清洗培养基，喷水 条件条件 15 15 2525，60608080湿度，湿度，121224h24h移栽移栽移入驯化苗圃（蛭石组成）移入驯化苗圃（蛭石组成）151520d 20d 移入苗圃移入苗圃胚状体发生型胚状体发生型(embryogenesis type)(embryogenesis type)：指植物器官、组织和细胞外植体经培养脱指植物器官、组织和细胞外植体经培养脱分化形成胚状体再成苗的方式。分化形成胚状体再成苗的方式。技术关键：提高不同外植体胚状体发生及技术关键：提高不同外植体胚状体发生及

10、萌发率和提高胚状体同步化率。萌发率和提高胚状体同步化率。特点：胚状体发生数量多、速度快、结构特点：胚状体发生数量多、速度快、结构完整，繁殖系数高；遗传性稳定。完整，繁殖系数高；遗传性稳定。甘蔗、胡萝卜、石刁柏等甘蔗、胡萝卜、石刁柏等 不定芽型（不定芽型（adventitious bud type)adventitious bud type)：选取具有顶芽和腋芽的短枝选取具有顶芽和腋芽的短枝无菌培养，诱导芽萌发成苗无菌培养，诱导芽萌发成苗或增殖产生许多不定芽发育或增殖产生许多不定芽发育成苗，将新萌生的枝条再转成苗，将新萌生的枝条再转接继代，重复芽到苗的增殖接继代，重复芽到苗的增殖过程，最后使其生

11、根形成植过程，最后使其生根形成植株的方式。株的方式。技术关键：打破顶端优势，技术关键：打破顶端优势，促使腋芽增殖并促其生根。促使腋芽增殖并促其生根。特点：繁殖率高、保持物种特点：繁殖率高、保持物种的遗传稳定性，多用于林木的遗传稳定性，多用于林木的繁殖。的繁殖。FLash器官型器官型(organ type)(organ type)指直接从茎、叶、鳞片等外植体上诱导不指直接从茎、叶、鳞片等外植体上诱导不定芽或带芽的休眠器官（如小鳞茎、小球定芽或带芽的休眠器官（如小鳞茎、小球茎、小块茎）产生再生成植株的方式。茎、小块茎）产生再生成植株的方式。技术关键：对培养基要求高，控制好激素技术关键：对培养基要求

12、高，控制好激素浓度，避免愈伤组织发生。浓度，避免愈伤组织发生。优点：繁殖率高，速度较快；遗传性稳定。优点：繁殖率高，速度较快；遗传性稳定。三倍体无籽西瓜、甘蔗、香蕉、香石竹、三倍体无籽西瓜、甘蔗、香蕉、香石竹、丝石竹等丝石竹等 原球茎型原球茎型(protocorm type)(protocorm type)兰属特有的方式，兰属特有的方式，即外植体经培养即外植体经培养产生原球茎，再产生原球茎，再直接长成植株。直接长成植株。球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎

13、芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽，一端出芽一端出根遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植观叶海棠球茎芽型球茎芽型 叶柄表面产生圆球形小突起叶柄表面产生圆球形小

14、突起球茎芽，球茎芽，一端出芽一端出根一端出芽一端出根 遗传性较稳定，球茎芽可直接放入遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植土中种植 唐唐菖菖蒲蒲观观叶叶海海棠棠块茎型块茎型 叶片或叶柄上形成粒状芋块，进一步分叶片或叶柄上形成粒状芋块，进一步分化出芽和根化出芽和根块茎芽可为繁殖系母体，不断切割繁殖块茎芽可为繁殖系母体，不断切割繁殖移栽，成活率高移栽，成活率高 。花叶芋花叶芋 鳞茎型鳞茎型 鳞片近轴面或边缘直接形成带根的小鳞茎鳞片近轴面或边缘直接形成带根的小鳞茎 在试管内形成小鳞茎需较长时间在试管内形成小鳞茎需较长时间 百合百合 郁金香郁金香孢子型孢子型 用成熟或未成熟的孢子进行培养用成熟或未成熟

15、的孢子进行培养 孢子繁殖最困难的是表面消毒，萌发时孢子繁殖最困难的是表面消毒，萌发时间较长间较长 地钱地钱狼尾蕨狼尾蕨根茎型根茎型 蕨类具有横向的茎及直立的短根茎，为蕨类具有横向的茎及直立的短根茎，为组织培养的最佳外植体组织培养的最佳外植体 根状茎上产生蕨叶及根，繁殖速度较孢根状茎上产生蕨叶及根，繁殖速度较孢子型快子型快肾蕨等肾蕨等 微枝扦插型微枝扦插型 带芽的小插条在试管内进行无菌扦插带芽的小插条在试管内进行无菌扦插 为木本植物进行快速繁殖的主要方式为木本植物进行快速繁殖的主要方式 葡萄、杨树葡萄、杨树 植物离体培养脱毒技术植物离体培养脱毒技术病毒在植物体内的分布及危害病毒在植物体内的分布及

16、危害植物脱病毒方法植物脱病毒方法脱毒植物检测及保存脱毒植物检测及保存病毒的特性及其对植物的危害病毒的特性及其对植物的危害大多数植物病毒不经种子传播；大多数植物病毒不经种子传播；无性繁殖的植物，都易受到一种或多种病无性繁殖的植物，都易受到一种或多种病毒的侵染。毒的侵染。植物种类植物种类染病毒种类染病毒种类植物种类植物种类染病毒种类染病毒种类菊花菊花康乃馨康乃馨水仙水仙月季月季葡萄葡萄无花果无花果1911410265矮牵牛矮牵牛马铃薯马铃薯大蒜大蒜苹果苹果草莓草莓桃桃51724362423苹果锈果病苹果锈果病薄荷病毒病病薄荷病毒病病郁金香杂色花郁金香杂色花郁金香正常花郁金香正常花病毒在植物体内的分

17、布病毒在植物体内的分布病毒在植物体内的分布具有不均匀性，随病毒在植物体内的分布具有不均匀性，随植株不同部位和年龄而异。植株不同部位和年龄而异。老叶和成熟组织及器官中病毒含量较高老叶和成熟组织及器官中病毒含量较高根尖、茎尖生长点约根尖、茎尖生长点约1mm1mm区域内，几乎区域内，几乎不含病毒。不含病毒。（原因？）（原因？）（原因：分生组织细胞分裂和生长速度（原因：分生组织细胞分裂和生长速度快，而病毒在植物体细胞内繁殖速度相快，而病毒在植物体细胞内繁殖速度相对较慢；另外，病毒是通过筛管组织或对较慢；另外，病毒是通过筛管组织或胞间联丝传播至其他组织细胞的，而茎胞间联丝传播至其他组织细胞的，而茎尖分生

18、组织无分化，没有维管组织。）尖分生组织无分化，没有维管组织。）病毒在植物体内的分布具有不均匀性的理论病毒在植物体内的分布具有不均匀性的理论假说假说(1)(1)能量竞争能量竞争 病毒核酸和植物细胞分裂时病毒核酸和植物细胞分裂时DNADNA合合成均需要消耗大量的能量，而分生组织细胞本成均需要消耗大量的能量，而分生组织细胞本身很活跃，其身很活跃，其DNADNA合成是自我提供能量自我复制，合成是自我提供能量自我复制，而病毒核酸的合成要靠植物提供能量来自我复而病毒核酸的合成要靠植物提供能量来自我复制，因而就得不到足够的能量，从而就抑制了制，因而就得不到足够的能量，从而就抑制了病毒核酸的复制。病毒核酸的复

19、制。(2)(2)传导抑制传导抑制 病毒在植物体内的传播主要是通过病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的，但在分生组织中，维管组织还维管束实现的，但在分生组织中，维管组织还不健全，从而抑制了病毒向分生组织的传导。不健全，从而抑制了病毒向分生组织的传导。(3)(3)激素抑制激素抑制 在分生组织中，生长素和在分生组织中，生长素和细胞分裂素水平均很高，因而阻滞了病细胞分裂素水平均很高，因而阻滞了病毒的侵入或者抑制病毒的合成。毒的侵入或者抑制病毒的合成。(4)(4)酶缺乏酶缺乏 19691969年，年，Stace-SmithStace-Smith提出，提出，可能病毒的合成需要的酶系统在分生组可能病毒

20、的合成需要的酶系统在分生组织中缺乏或还没建立，因而病毒无法在织中缺乏或还没建立，因而病毒无法在分生组织中复制。分生组织中复制。(5)(5)抑制因子抑制因子 19761976年，年，Martin-TanguyMartin-Tanguy等等提出了抑制因子假说，认为在分生组织提出了抑制因子假说，认为在分生组织中存在有某种抑制因子。中存在有某种抑制因子。植物脱病毒方法植物脱病毒方法物理方法物理方法化学方法化学方法生物方法生物方法高温处理高温处理茎尖培养茎尖培养微体嫁接微体嫁接珠心培养珠心培养愈伤脱毒愈伤脱毒热处理脱毒热处理脱毒热处理脱毒法热处理脱毒法原理原理热处理不能杀死病毒，只能钝化病毒的活热处理不

21、能杀死病毒，只能钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或停止，性，使病毒在植物体内增殖减缓或停止，而失去侵染能力；而失去侵染能力；作为一种物理效应可以加速植物细胞的分作为一种物理效应可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。胜。热处理脱毒法热处理脱毒法愈伤组织热处理法愈伤组织热处理法从患病植株上取叶片（茎片、鳞片、花从患病植株上取叶片（茎片、鳞片、花器等）进行离体培养，诱导形成愈伤组器等）进行离体培养，诱导形成愈伤组织，然后将愈伤组织反复继代培养同时织，然后将愈伤组织反复继代培养同时兼用热处理。兼用热处理。常用的温度及处理时间常用的温度及

22、处理时间v 37 38（2、4或或8周）周）v 50（315min)热空气处理脱毒法热空气处理脱毒法将试验母株在高温生长室中生长一将试验母株在高温生长室中生长一个阶段，使其顶端分生组织和次生个阶段，使其顶端分生组织和次生分生组织迅速生长，然后切取其茎分生组织迅速生长，然后切取其茎尖分生组织进行离体培养。尖分生组织进行离体培养。生长室温度（生长室温度（35 40）光照强度（光照强度（300010000Lx)愈伤组织继代兼热处理钝化愈伤组织继代兼热处理钝化TMVTMV和和CMVCMV获获得烟草无病毒植株的效果得烟草无病毒植株的效果继代继代 无烟草花叶病毒无烟草花叶病毒(TMV)无黄瓜花叶病毒无黄瓜

23、花叶病毒(CMV)次数次数 25 30 37 25 30 37 0 0/20 8/21 -1 0/20 0/20 0/20 5/18 4/19 10/21 2 0/20 0/20 0/20 8/20 10/20 11/20 3 0/20 0/20 8/20 10/20 8/20 11/20 4 0/20 0/20 5/20 5 4/20 1/20 5/20结论结论:病毒种类不同病毒种类不同,愈伤组织反复继代兼热处理的效果愈伤组织反复继代兼热处理的效果不同；不同；TMV、CMV均经均经37热处理，脱毒效果最好。热处理，脱毒效果最好。其它效果其它效果香石竹（康乃馨）在香石竹（康乃馨）在3840下经

24、两个下经两个月处理可除去全部病毒。月处理可除去全部病毒。马铃薯在马铃薯在37下处理下处理1020天能除去卷叶天能除去卷叶病毒。病毒。热处理脱毒法热处理脱毒法优点优点方法简单，效果明显。方法简单，效果明显。缺点缺点具有局限性，不能去除所有病毒。只具有局限性，不能去除所有病毒。只对圆形病毒（苹果花叶病毒），或对线对圆形病毒（苹果花叶病毒），或对线状病毒（马铃薯卷叶病毒）有效；而对状病毒（马铃薯卷叶病毒）有效；而对杆状病毒（千日红病毒）无效。杆状病毒（千日红病毒）无效。极易使植物材料受热枯死，造成损失极易使植物材料受热枯死，造成损失茎尖培养脱毒法茎尖培养脱毒法依据依据原理原理康乃馨不同大小茎尖与康乃

25、馨斑驳病康乃馨不同大小茎尖与康乃馨斑驳病毒的脱毒效果毒的脱毒效果茎尖茎尖大小大小(mm)培培养养数数荆芥鉴定之病斑荆芥鉴定之病斑总病斑总病斑 接种叶数接种叶数 平均病斑数平均病斑数/叶叶无病毒茎尖无病毒茎尖 数目数目%0.1 0.25 0.5 0.75 1.01.0 3 20 30 9 4 5 3 13 0.2 137 61 2.2 1198 70 17.1 429 12 35.3 432 11 39.2 1972 20 98.6 2 66 8 40 4 13 1 11 0 0 0 0影响茎尖培养法脱除植物病毒的因素影响茎尖培养法脱除植物病毒的因素母体材料病毒侵染的程度母体材料病毒侵染的程度外

26、植体的生理状态外植体的生理状态起始培养的茎尖大小起始培养的茎尖大小茎尖培养法脱除植物病毒的技术关键茎尖培养法脱除植物病毒的技术关键 茎尖越小对培茎尖越小对培养基的要求越养基的要求越高，成功率越高，成功率越低。低。微体嫁接法微体嫁接法(micrografting)(micrografting)应用微体嫁接的原因：应用微体嫁接的原因：木本植物茎尖培养难以生根形成植株。木本植物茎尖培养难以生根形成植株。具体做法：具体做法：将极小的茎尖（）作为接穗嫁接到不带病将极小的茎尖（）作为接穗嫁接到不带病毒的种子实生苗砧木上，然后将砧木、接毒的种子实生苗砧木上，然后将砧木、接穗一起在培养基上培养。穗一起在培养基

27、上培养。优点：优点：接穗在砧木上易成活，故可用很小的茎尖接穗在砧木上易成活，故可用很小的茎尖来培养，去除病毒几率大，获得无病毒苗来培养，去除病毒几率大，获得无病毒苗的可能性大。的可能性大。苹果茎陷病毒的茎尖培养脱毒苹果茎陷病毒的茎尖培养脱毒接穗：接穗：茎尖茎尖砧木：无菌实生苗的胚轴（带两片子砧木：无菌实生苗的胚轴（带两片子叶）叶）方法：劈接法将接穗插入两片子叶之方法：劈接法将接穗插入两片子叶之间的组织中间的组织中微体嫁接法微体嫁接法(micrografting)(micrografting)脱除病毒的关键：脱除病毒的关键：要求剥离技术很高要求剥离技术很高 需要考虑砧木和接需要考虑砧木和接穗对营

28、养组成的不穗对营养组成的不同要求；同要求；与接穗的取材季节与接穗的取材季节有密切关系（苹果有密切关系（苹果46月取材嫁接成月取材嫁接成活率较高。）活率较高。）珠心组织培养脱毒法珠心组织培养脱毒法依据：依据：病毒通过维管组织传播，而珠心组织（孢病毒通过维管组织传播，而珠心组织（孢子体部分）与维管组织没有直接联系，故子体部分）与维管组织没有直接联系，故可以通过珠心组织培养获得无病毒植株。可以通过珠心组织培养获得无病毒植株。目前已用该方法去除了柑橘银屑病、叶脉目前已用该方法去除了柑橘银屑病、叶脉突出病、柑橘裂皮病、速衰病等病毒。突出病、柑橘裂皮病、速衰病等病毒。该方法的缺点：该方法的缺点：存在存在2

29、0%30%左右的变异率，无病毒苗左右的变异率，无病毒苗苗期较长。苗期较长。柑橘柑橘要要68年才能结果。年才能结果。胚珠胚珠愈伤组织培养脱毒法愈伤组织培养脱毒法通过植物器官或组织诱导产生愈伤组织，然后通过植物器官或组织诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再诱导分化芽，长成植株，可以获从愈伤组织再诱导分化芽，长成植株，可以获得脱毒苗，这在得脱毒苗，这在天竺葵、马铃薯、大蒜、草莓、天竺葵、马铃薯、大蒜、草莓、枸杞枸杞等植物上已先后获得成功。利用诱导各器等植物上已先后获得成功。利用诱导各器官愈伤组织培育无病毒苗的机制，可能有如下官愈伤组织培育无病毒苗的机制，可能有如下几种：几种：（a a）病毒在植株体内不

30、同器官或组织分布不均）病毒在植株体内不同器官或组织分布不均 （b b）病毒复制能力衰退或丢失；）病毒复制能力衰退或丢失；（c c）继代培养的愈伤组织抗性变异。）继代培养的愈伤组织抗性变异。检测方法检测方法血清鉴定法血清鉴定法生物鉴定法生物鉴定法分子检测法分子检测法电镜鉴定法电镜鉴定法直接观察直接观察几种马铃薯病毒病的症状几种马铃薯病毒病的症状血清鉴定法血清鉴定法(serologic test)(serologic test)实验依据：沉淀反应实验依据：沉淀反应植物病毒植物病毒“抗血清抗血清”在植物病毒诊断中优点：在植物病毒诊断中优点：病毒抗血清具有高度专化性：病毒抗血清具有高度专化性：专一性；

31、专一性；“预见性预见性”；定量性。定量性。病毒抗血清在诊断上的局限性：病毒抗血清在诊断上的局限性：不是所有病毒都能制成抗血清不是所有病毒都能制成抗血清能够提纯的病毒量太少，或在提纯过程中丧失能够提纯的病毒量太少，或在提纯过程中丧失了必备的抗原结构；了必备的抗原结构；植物体内的单宁物质使病毒丧失了抗原性质。植物体内的单宁物质使病毒丧失了抗原性质。血清鉴定法血清鉴定法基本方法：基本方法：玻璃片凝集法玻璃片凝集法 （平皿）微量凝集试验（平皿）微量凝集试验 试试管沉淀反应管沉淀反应 免疫双扩散免疫双扩散ELISA病毒感染病毒感染人工注射人工注射异体蛋白异体蛋白动物动物动物动物植物植物带该种病毒带该种病

32、毒血清反应血清反应+免疫球蛋白免疫球蛋白（抗原）（抗原）（抗体）（抗体）（抗原）（抗原）生物鉴定法（指示植物鉴定）生物鉴定法（指示植物鉴定）依据：依据：指示植物对病毒极为敏感，一旦感染病毒就会在指示植物对病毒极为敏感，一旦感染病毒就会在叶片或全株上表现出特有的病斑。叶片或全株上表现出特有的病斑。指示植物：指示植物：对环境中的一个因素或各因素的综合条件具有指对环境中的一个因素或各因素的综合条件具有指示作用的植物种示作用的植物种 指示植物分类：指示植物分类：接种后产生的症状可扩散到非接种部位。接种后产生的症状可扩散到非接种部位。只在接种部位产生明显病斑。只在接种部位产生明显病斑。优点：优点：操作方

33、便，条件简单，经济有效；还可以根据病操作方便，条件简单，经济有效；还可以根据病毒的寄生范围，确定几种指示植物，准确性强。毒的寄生范围，确定几种指示植物，准确性强。生物鉴定法生物鉴定法接种方法接种方法 摩擦接种法摩擦接种法 取待检查植株叶片，经处理后用其汁液和金刚取待检查植株叶片，经处理后用其汁液和金刚砂混合，轻轻摩擦指示植物叶片，使汁液能侵砂混合，轻轻摩擦指示植物叶片，使汁液能侵入叶片表皮细胞但又后，观察指示植物有无病入叶片表皮细胞但又后，观察指示植物有无病毒感染症状。毒感染症状。马铃薯马铃薯X病毒侵染千日红病毒侵染千日红（叶片呈枯斑）（叶片呈枯斑）马铃薯马铃薯M病毒侵染千日红病毒侵染千日红（

34、叶片呈突起枯斑）（叶片呈突起枯斑）嫁接法嫁接法 一些木本多年生果树或草莓等无性一些木本多年生果树或草莓等无性繁殖草本植物，其病毒不是通过汁液繁殖草本植物，其病毒不是通过汁液而是其他介体传播而是其他介体传播 如草莓黄化病毒是如草莓黄化病毒是由蚜虫（由蚜虫（Mtzus fragaefolii）传播的）传播的，这，这种病毒鉴定可采用嫁接法，即用鉴定种病毒鉴定可采用嫁接法，即用鉴定植株芽作接穗，指示植物作砧木。根植株芽作接穗，指示植物作砧木。根据指示植物的表现判断是否脱除了病据指示植物的表现判断是否脱除了病毒。毒。电镜检查法电镜检查法直接观察，检查是否有病毒颗粒。直接观察，检查是否有病毒颗粒。优点：准

35、确，有效优点：准确，有效不足：需要一定的设备和技术（超薄切片不足：需要一定的设备和技术（超薄切片技术、背景染色法、扫描电镜使用）。技术、背景染色法、扫描电镜使用）。分子检测法分子检测法优点：快速、简便、灵敏度高和特异性强。优点：快速、简便、灵敏度高和特异性强。常用的方法常用的方法聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCR）双链双链RNA分析技术分析技术核酸分子杂交和序列分析技术核酸分子杂交和序列分析技术RFLP、RAPD等分子标记技术等分子标记技术无病毒原种的保存与繁殖无病毒原种的保存与繁殖无病毒原种的保存无病毒原种的保存可利用隔离法进行保存。可利用隔离法进行保存。无病毒原种的繁殖无病毒原种的繁殖建

36、立一套严格的良种繁育制度，生产场建立一套严格的良种繁育制度，生产场所做好土壤消毒和防昆虫工作，保持无所做好土壤消毒和防昆虫工作，保持无病毒原种材料质量。病毒原种材料质量。脱毒苗保存花药及花粉培养花药及花粉培养概念及意义概念及意义花药培养属于花药培养属于器官培养范畴器官培养范畴花粉培养属于花粉培养属于细胞培养范畴细胞培养范畴也称小孢子培养也称小孢子培养花药培养花药培养：把发育到一定阶段的花药接种在把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上，使其发育和分化成植株的过程人工培养基上，使其发育和分化成植株的过程花粉培养：花粉培养：从花药中分离出花粉粒使之成为从花药中分离出花粉粒使之成为分散或游离的状态，

37、通过培养使其脱分化并发分散或游离的状态，通过培养使其脱分化并发育成植株的过程育成植株的过程目的是获得单倍体植株目的是获得单倍体植株迅速获得纯合型材料，缩短育种年限迅速获得纯合型材料，缩短育种年限获得育种中间材料获得育种中间材料与诱变育种相结合可以提高诱变频率与诱变育种相结合可以提高诱变频率与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义应用意义作为遗传工程受体更为有效作为遗传工程受体更为有效用作基础遗传研究的各个领域用作基础遗传研究的各个领域花药培养的基本程序是花药培养的基本程序是 Flash花药培养技术特点：选处于生殖生长高峰期的花花药培养技术特点

38、：选处于生殖生长高峰期的花药，需低温预处理（药，需低温预处理（310，210天），光照天），光照先弱后强。先弱后强。低温处理的作用：低温处理的作用：可以激发花粉母细胞产生两个相等核，二不是可以激发花粉母细胞产生两个相等核，二不是一个营养核一个生殖核。一个营养核一个生殖核。保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞组织的衰老。组织的衰老。激发花粉产生原胚。激发花粉产生原胚。促使细胞同步分裂。促使细胞同步分裂。在烟草中，只有原来贴靠着花药壁的花粉粒才能在烟草中，只有原来贴靠着花药壁的花粉粒才能顺利发育成花粉胚。在天仙子中，也只有处在药顺利发育成花粉胚。在天仙子

39、中，也只有处在药室外围紧靠绒毡层的花粉才能够发育成花粉胚。室外围紧靠绒毡层的花粉才能够发育成花粉胚。药壁因子作用药壁因子作用Sunderland(1978)花粉或小孢子的分离花粉或小孢子的分离花粉或小孢子培养花粉或小孢子培养培养方法培养方法 花药看护培养花药看护培养花粉悬浮培养花粉悬浮培养固液双层培养固液双层培养植物胚胎培养Flash小结小结植物脱毒快繁是无性植物种苗生产最有植物脱毒快繁是无性植物种苗生产最有效的技术。效的技术。外植体选择是植物组织培养的基本环节，外植体选择是植物组织培养的基本环节，应根据不同培养目的确定取材原则。应根据不同培养目的确定取材原则。思考题思考题1利用茎尖分生组织培养脱除去植物病毒的利用茎尖分生组织培养脱除去植物病毒的原理。原理。2哪些因素会影响茎尖培养的脱毒效果？哪些因素会影响茎尖培养的脱毒效果？3.如何检测脱毒效果？如何检测脱毒效果？4微繁殖中芽的增殖方式有哪些？微繁殖中芽的增殖方式有哪些？5为什么用于繁殖的组培技术要尽量避免使为什么用于繁殖的组培技术要尽量避免使用外源激素？用外源激素？6通过离体培养获得单倍体的途径有哪些？通过离体培养获得单倍体的途径有哪些？7.基本概念基本概念