生化与分子生物学技术原理.ppt

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1、生化与分子生物学技术原理 曹凯鸣曹凯鸣 复旦大学生命科学学院复旦大学生命科学学院 2006 2006年年11 11月月第一章第一章 核酸的基本结构和性质核酸的基本结构和性质一.基本的化学组成 经不同程度水解可获得核酸各种组成部分 核苷酸核苷酸 nucleotide Nt 核苷核苷 nucleoside Ns 碱基碱基 嘌呤 purine Pu 嘧啶 pyrimidine Py 碱基三字符号 Ade Cyt Gua Thy Ura Ns单字符号 (d)A C G T U Ns,Nt,oligoNts 中均为D-戊糖 碱基可异构化 异构平衡仅 H 原子位置变化UV,NMR分析 生理 pH 条件下,

2、5种碱基 99.99%以氨基与酮式存在。酮式酮式烯醇式烯醇式氨基氨基亚胺亚胺 N-糖苷键 C1 与嘧啶 N1 连接 C1 与嘌呤 N9 连接 oligo 表示法 poly U 均聚物 poly(dA-dT)交替排列 poly(dAdT)随机排列 poly A2poly U 按1:2结合成复合物 (三链)抗生素抗生素抗生素抗生素第二信使第二信使第二信使第二信使嘌呤霉素嘌呤霉素嘌呤霉素嘌呤霉素细胞激动素细胞激动素细胞激动素细胞激动素能源库能源库能源库能源库辅酶辅酶辅酶辅酶二.糖环的折叠形式 构型构型(configuration)(configuration)共价化合物中,各个原子在空间的相对排列关

3、系。构型的改变涉及到共价键破坏 核酸中核糖仅一种构型：-D型 构象构象(conformation)(conformation)化合物内可以自由转动的单键上的原子或基团,绕单键旋转或随单键扭转,产生几种不同的空间排列形式。构象的改变并不伴随共价键的破坏 核酸中的核糖有多种构象 核糖的五员环不处于一个平面，C1，O，和 C4 三个原子在一个平面上，C2 或/和 C3 偏离此平面，使核糖产生不同的构象。内式构象内式构象(endo)偏离平面的方向和 C5同向 外式构象外式构象(exo)偏离平面的方向和 C5反向1.信封式(Envelope,E)糖环的 C 2或 C 3 1个原子偏离平面的折叠 C2-e

4、ndo (2E)C3-endo (3E)C2-exo (E2)C3-exo (E3)内式内式外式外式侧视图侧视图侧视图侧视图2.扭转式(Twist,T )糖环的 C2 和 C3 两个原子都偏离糖平面,而且取方向相反的折叠。两个原子偏离糖平面的程度可以相等或不等 C2-endo-C3-exo C2-exo-C3-endo侧视图侧视图侧视图侧视图 存在 溶液:Nt,Ns C2-endo C3-endo DNA:B-DNA C2-endo A-DNA(RNA)C3-endo Z-DNA 胞苷(C)C2-endo (反式）鸟苷(G)C3-endo（顺式）(B-form double DNA)(A-fo

5、rm double DNA)三.核苷的顺反构象(syn-anti 构象)核糖和碱基以N-糖苷键连接成核苷，核苷中碱基平面绕糖苷键旋转形成核苷的顺反构象。扭转角决定核苷的构象 存在 溶液:顺反式可互换 结晶:顺反式不可互换 C2-endoC3-endo四.核酸的修饰成分及甲基化 1948年 小牛胸腺DNA分离 m5dC 特点:原有成分的衍生物 含量少(百分之几万分之几)主要化学键不变 1.修饰碱基 60余种 Ura Ade Gua Cyt ThyUra Ade Gua Cyt Thy 25 17 12 6 2 碱基上原子被其他基团取代 m p om AA衍生物 Base-CO-NH-AA 糖衍生

6、物 Base-CH2OH-糖(6C)非嘌呤,嘧啶衍生物(tRNA)W异丙烯 GuatRNA anticodon 3邻位Q 7-去N-GuatRNA anticodon 摆动位2.修饰核糖 RNA C2-OH 甲基化 (Nm)抗水解(Rnase ,OH)二聚体 NmpNp3.糖苷键不同 假尿苷 (tRNA rRNA)C5-C1 糖苷键4.修饰符号 m1A m7G Cm m m2G m3 G25.分布 a.RNA 70 mRNA (hnRNA mRNA)5-Cap:m7G Nm 分子内:m6A m5C rRNA 原核 m5C 真核 Nm mN 高度修饰成分(m1ncp3)Hela cell 28S

7、 rRNA 65Nm(70)18S rRNA 40Nm 6mN tRNA 60余种分布在环区 anticodon loop 高度修饰 Q W SnRNA uRNA 5-end Cap m3 G 稀有碱基的形成 酶催化 -CH3 碱基交换 Q tRNA鸟嘌呤鸟嘌呤 糖苷转移酶糖苷转移酶 G34(tRNA)Q34(tRNA)Q Gua N-糖苷键打断、重建 b.DNA 10 种 甲基化 形成 合成时om5dC参入 phage T 2.4.6 合成后甲基化 m5dC m6dA m4dC DNA 甲基化酶 S-腺苷甲硫氨酸（甲基供体）6.甲基化与基因表达 a.原核生物DNA甲基化 限制修饰系统 DNA

8、甲基化与复制 E.coli dam G*ATC dcm C*CA/TGG 完全甲基化 oriC 复制活性 半甲基化 oriC 抑制复制活性 oriC,dna 甲基化速度与复制循环 半甲基化 oriC 与膜结合抑制复制(抑制剂)*dam 半甲基化产物积累半甲基化产物积累 b.真核生物DNA甲基化 甲基化在两条链上,对称分布 真核生物真核生物 5-mCpG-3 植物 5-mCNG-3 dC mdC 影响DNA-蛋白质相互作用 甲基化格式具有组织专一性 pattern of methylation 格式变化:配子发生时期,胚胎发育早 期,病毒感染 格式维持:DNA甲基化酶维持配子和体 细胞甲基化状态

9、甲基化格式的维持甲基化格式的维持C*CGGCCGGCCGG甲基化格式的限制性内切酶分析甲基化格式的限制性内切酶分析甲基化与基因表达 鸡珠蛋白基因的组织特异性分析(Mspl Hpall)CpG 表达(红细胞）mCpG 不表达（肾、脑)肌动蛋白(actin gene)表达 高速率 转录 肌肉细胞 actin gene actin gene (CpG)(mCpG)成纤维细胞 低速率 转录 Promoter -CpG-甲基化与转录 -globin gene 200 +90 有甲基化基团 mCpG 转录受阻 除去部分 mCpG 转录受阻 除去所有 CpG 转录 5-氮胞苷抑制甲基化,瞬时去甲基化 5-N

10、C 成纤维细胞 肌肉细胞 (多核,有条纹,可收缩)甲基化与小鼠胚胎发育 knock out 甲基转移酶 gene C 胚胎发育早期 甲基化格式变换,其后细胞内DNA维持特定的甲基化状态 配子发生期,不同性别配子的甲基化格式是特定的。其区别使父母等位基因在胚胎中表达不同。下一代配子保持相同格式 Igf2 gene IGF-胰岛素-like生长 因子依赖于父本表达 Igf2R gene IGF-R胰岛素-like生长 因子受体依赖于母本表达一条一条X-染色体的失活染色体的失活 甲基化格式的建立、维持和改变 从无到有(de novo)甲基化 双链相对-CpG-mCpG-确立新格式 甲基化的维持 脱甲

11、基 被动 复制后不再甲基化 主动 甲基转移 碱基切除修复 CpG-rich islands 基因组中存在异常非甲基化-CpG-顺序簇 高含量 C+G 高频率 CG dimer (10/100bp)分布不均,长1-2 kb，间隔 100 kb 非甲基化 CpG 存在：housekeeping genes tissues specific genes 5-启动子转录区 腺嘌呤磷酸核糖腺嘌呤磷酸核糖转移酶转移酶CpG密度密度 1/100bpCpG密度密度 10/100bp 100 300 1.1.二氢叶酸还原酶基因二氢叶酸还原酶基因 2.2.次黄嘌呤转磷酸核糖酶基因次黄嘌呤转磷酸核糖酶基因 3.3.

12、核糖体蛋白质基因核糖体蛋白质基因123 CG mCG抑制转录的蛋白质 MeCP-1 *CpG 成簇 MeCP-2 *CpGDNA甲基化有助于基因关闭甲基化有助于基因关闭五.核酸及其化学组分的化学反应 1.水解反应 磷酸二酯键,磷酸单酯键,N-糖苷键 a.酶水解 b.酸碱水解 磷酸二酯键 酸 热强酸 dA,dG 0.1NHCl 30mi（100C)rA,rG 1M HCl 60min rC,rU 12M HClO4 60min 碱 DNA 不作用 RNA 邻接基团参与效应,生成磷酸 基转移中间物,水解。N-糖苷键 碱稳定 酸不稳定 DNA RNA dNs Ns 嘌呤Ns 嘧啶Ns 酸碱作用比较酸

13、碱作用比较 DNA RNA 碱碱 /2 or 3-Nt产物产物 酸酸 Pu,Py,Pu,PyNt,多聚核糖-P碎片 碎片 磷酸二酯键 嘧啶糖苷键稳稳 大大 定定 嘧啶糖苷键 磷酸二酯键 性性 小小 嘌呤糖苷键 嘌呤糖苷键2.-消除反应 连接磷酸基团的-C 原子上有强的吸电子基团存在时,引起-C 原子和 O 原子间的键断裂。OH R P O CH2 CH2 Z (CHO,C=O,HC=N A-N1 C-N3 T-N3 DMS作用于dsDNA A-N3(Me),阻止DNA pol.强(Hard)烷化剂 N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)Me N,O 核酸 50%磷酸酯

14、烷化 烷化剂直接致癌 DMS G-O6:G-N7=0.004:1 MNU G-O6:G-N7=0.08:1 (肝)G-O6:G-N7=0.15:1 (脑)G-N7(Me)不改变G:C配对 G-O6(Me)不影响 DNA pol,但改变碱基对,G T b.卤化反应 嘧啶 5 位 5-FU 抗癌药 卤素分子 嘌呤 8 位 8-BrPu 标记 c.与醛类反应 碱基的环外环外 NH2AMP:N6-NH2GMP:N2-NH2 甲醛是DNA不可逆变性剂 鉴定 ssDNA or dsDNA 破坏RNA高级结构，消除结构对电泳迁移 率的影响 d.核糖上的反应 核糖的氧化反应 核糖的2，3-顺二醇顺二醇被高碘酸

15、(HIO4)氧化成顺二醛顺二醛，胺催化-消除反应消除反应，同时碱基脱落,生成磷酸，碱基和糖碎片。5-Nt 定量测定 RNA 序列测定 核糖的脱水反应 酸性条件下，核糖或脱氧核糖脱水产物与试剂反应生成有色物质。可用定糖法比色测定 DNA or RNA 含量。苔黑酚法测RNA 核糖 糠醛 二苯胺法测 DNA 脱氧核糖 -羟基-酮基戊醛-3H2O-2H2O六.核酸组分的分离鉴定 1.分离 a.电泳分离 Nt and dNt Nt(dNt)的解离及pK值 pH3.5，Nts 间净电荷 差异最大.ADP质子化状态质子化状态 b.层析 离子交换层析 高效液相层析(HPLC)稀有成分纤维素薄板双向层析 灵敏

16、,快速,稳定。20种 3-Nt,22种 5-Nt,40种 Ns,14种抗水 解 NmNp dimer.AmGp GmAp CmUp UmCp2.鉴定 a.标准品对照(电泳,层析)UV吸收检出 吸收 UV蓝紫色斑点,G蓝色荧光,D无吸收。b.紫外光谱鉴定 溶液样品在 220-290nm 波长内扫描,确定 max and min,对照参数(特定pH)。例:pH 6-7 max min A 260 227 G 253 223 C 271 250 U 262 230 T 267 236 不同波长下吸收比值 A250/A260 A280/A260 A290/A260 注意点:一般 max 250-280

17、,min 220-250 吸收曲线特征与pH 相关,pH 1,7,12 下测定。Base 与 Ns 吸收值差异大 NsdNsNm NsNtdNt Gua类在酸性时,UV下兰色荧光,光谱曲线有 肩。稀有成分的吸收光谱特征常不同于常见成分 第二章 核酸的分离纯化一.细胞中的核酸 1.存在状态 与蛋白质结合(除 tRNA)2.分布 DNA:原核 核质区 真核 95%核内 5%核外（mt,ct)RNA:原核 胞质 真核 90%质(15%细胞器）10%核 3.含量 少,细胞干重5-15%,1015-1010g/cell 4.大小 RNA 104-106 Da DNA 106 Da二.制备中注意事项 保持

18、生物学功能,具有生物活性 分子完整,天然状态(未变性)1.简化步骤 2.避免高温 0-4 3.避免过酸或过碱 pH 5-9 4.防止机械剪切作用（shearing)5.防止核酸酶降解作用 5.防止核酸酶降解作用 a.DNase 活性需要 Me2+(Mg 2+,Ca2+,Mn2+)螯合剂 SSC 柠檬酸三钠-NaCl EDTA-Na2 乙二胺四乙酸钠(Me2+)EGTA 乙二醇二氨基乙醚四乙酸 (Ca2+特异性)b.RNase 活性不需Me2+，热稳定，回复能力强.防止外源RNase污染 污染源：器皿、溶液、操作者 措施 180高温处理数小时 0.1%DEPC（二乙基焦碳酸盐)处理 O O蛋白变

19、性剂 C2H5OCOCOC2H5 共价修饰RNase 操作者 抑制内源RNase 尽早、彻底去蛋白 非专一性吸附剂 RNase 碱性蛋白（pI 9.6）,中性pH下 静电吸附皂土、复合硅酸盐（Macaloid）、多聚阴 离子（肝素、聚乙烯硫酸酯）蛋白变性剂异硫氰酸胍、SDS（十二烷基硫酸钠）破细胞同时使 RNase 失活 RNase 抑制剂 RNasin 465aa 酸性蛋白（鼠肝、人胎盘）与RNase结合，保护RNA,不用于提取 核苷酸底物类似物竞争性抑制剂 ApUp RNaseA G2-5G RNaseT1三.核酸的分离提取 总核酸目的核酸 细胞器 目的核酸 1.破细胞 物理法物理法石英沙

20、研磨、超声、匀浆、捣碎器 化学法化学法去污剂、蛋白变性剂破膜 生化法生化法溶菌酶、蛋白酶动、植物材料液N2,机械破碎细菌溶菌酶水解肽聚糖破壁培养细胞去污剂与蛋白酶破膜破膜用去污剂 SDSC12-H25-O-SO3 Na 0.5-2%终浓度Na+1 M SDS影响 CsCl 梯度 Sarkosyl（十二烷基肌氨酸钠）3%终浓度 异硫氰酸胍 非离子型去污剂TritonX-100、Brij58 作用温和、膜部 分破2解聚核蛋白并除蛋白a.去污剂核酸 pI 2-2.5 SDS结合蛋白质浓 KAc+SDS SDS-K b有机溶剂酚、氯仿蛋白质变性剂酚、酚氯仿异戊醇、氯仿异戊醇注意：防剪切力（振荡速度、大

21、口吸管），处理酚（重蒸、缓冲液饱和、0.1%8-羟基喹啉）cProteinase K 处理广谱,水解力强,可在SDS,EDTA存在下作用3核酸的沉淀a乙醇核酸的 Na,K 盐在乙醇中 调节盐浓度：M NaCl,0.3M NaAc,2.5M NH4Ac V 冷乙醇（95%）搅出DNA 或离心 70-75%乙醇洗涤去盐 除尽EtOH,干燥 溶于 TE(10mM TrisHCl pH 8.0,1m MEDTA)核酸浓度g/ml,加助沉淀剂 重复沉淀，补盐!b异丙醇0.3 M NaAc 选择性沉淀 DNA and 大RNA,体积小，不需低温放置沸点高，盐，须 EtOH 洗涤 4.杂质的去除 a.小分子

22、杂质 b.多糖 样品预处理 动物 饥饿 植物 暗化 选择性沉淀 异丙醇 糖与小分子RNA不 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）CH3|CH3(CH3)15N+CH3 +NA /CH3 CH3 CTANA NaNA (EtOH)+CTAAc（溶）（溶）Br-M NaAc70%EtOH1%NaCl多糖溶解多糖溶解 c.RNA与DNA 互为杂质 DNP 溶于 1-2M NaCl RNP 溶于 M NaCl 除RNA RNase(100,15min 处理,除DNase)除DNA RNase-free DNase 5.保存 防止降解、变性 措施：灭菌、低温、盐浓度、pH、EDTA DNA TE buffe

23、r,4-20,70%EtOH RNA 冰冻干燥、低温6.纯度的初步鉴定 a.UV吸收曲线 b.UV吸收比值 DNA A260/A280 RNA A260/A280 核酸的含量测定(260nm,1cm 光径)1 A260 50g/ml dsDNA 40g/ml ssDNA,RNA 36g/ml oligo Nts c.胶电泳 定量,定性四.核酸的纯化 1.超离心 a.类型 沉降速度法 被分离物质在强大的离心力场中因沉降速度沉降速度不同而分离.(速度区带超离心).沉降平衡法 被分离物质在离心时因浮密浮密度度 不同进行分离.(浮密度梯度 or 等密度梯度超离心).浮密度是溶剂化密度,即核酸铯盐水化物

24、(CsCl,H2O,NA)的密度.不同介质下,核酸的不同.CsCl DNA=1.71;Cs2SO4 DNA pH 不同,碱基结合 Cs量不同,值不同.沉降速度超离心沉降速度超离心 沉降平衡超离心沉降平衡超离心原理 沉降速度不同 浮密度不同梯度物质 蔗糖 0-70%CsCl 密度1-1.3470 密度1-1.9052 NA密度 包含DNA离心力场 强 5-6万rpm 稍强 3-5万rpm NA CsCl 成梯度分子运动 向管底 5S 小 or 于等密度处 16S rRNA (ds,ss,cc,oc,l 23S 大 DNA RNA)离心时间 较短 免于管底 长 1-2 天时间过长 失败 不变操作

25、制备梯度铺样离 CsCl+样品混匀 心收集 离心收集应用 RNA,ssDNA,限制性 DNA 酶切片段 b.沉降平衡超离心法的应用 测 测(G+C)%=1.660+0.098(G+C)%天然、线状、ds DNA,修饰少.(G+C)%20 80%RNA,DNA 和蛋白质的分离 中性CsCl RNA 1.9,DNA 1.7,蛋白 :RNA RNADNA DNA 蛋白质 值不同的dsDNA的分离(值差0.01-0.02)影响 值的因素：(G+C)%甲基化,重原子取代 N15 N14 重金属原子结合 Cs2SO4 Ag+GC-rich Hg2+AT-rich 碱性 CsCl 离心分离DNA 两条互补链

26、 dsDNA变性 pH12-12.5 CsCl 离心 两个 峰（两条ssDNA）变性DNA 轻链（L）重链（H）G+T 比例高，大 pH 12 下,G-N1 and T-N3 解离，结合 Cs+多，升高.分离不同构型DNA DNA 结合具插入作用药物(溴乙锭 EB),值降低.cc,oc和 l DNA 结合药物的量不同,变化不同.ccDNA结合少；oc和l DNA结合多.纯化质粒ccDNA,除RNA,oc,l DNA 和染色体 DNA.2.胶电泳 快速、简便、设备简单、样品用量少 a.原理 核酸 pI=2-2.5,pH 8-8.3 时,NA带负电荷.*Pi pK1=1,pK2=6 完全解离 *-

27、+NH=-NH=pK=2.4-4.4 完全解离 *-NH-N-+H+pK=9.4-10 基本未解离 核酸分子大小不同,荷质比相同.荷/质=n+1/n 电泳缓冲液:TAE Tris-NaAc TBE Tris -b.胶类型的选 agarose gel 0.250kb(恒电场)3010,000kb(交变脉冲电场）PAGE 51000 bp,分辨率1bp 192-5-13-29-32-39-49-60温度温度(电压电压)对迁移率的影响对迁移率的影响盐浓度对迁移率的影响盐浓度对迁移率的影响c.核酸高级结构对分离的影响 分子量相同,构型不同,迁移率不同 迁移率:cc l oc ccDNA超螺旋数不同,迁

28、移率不同 ssDNA or RNA分子内折叠影响迁移率 变性胶(脲、甲酰胺），醛处理RNA 线状DNA的形状 弯曲、有泡 迁移慢 与蛋白质结合迁移慢 gel retardationd.提高分辨率的方法 控制电压 胶浓度梯度 5-20%PAGE 分离范围大 缓冲液浓度梯度 TBE buffer 梯度，迁移速度变化.楔型胶 改变迁移速度 双向电泳 影响迁移率因素:胶浓度、变性剂、pH 浓度双向 向：10%PAGE 向：20%PAGE 80-400Nts RNA 的分离 pH 双向 向：pH3.5 分子量，电荷 向：pH8.3 分子量 变性剂双向 向:agarose gel 片段大小 向：变性剂梯度

29、PAGE 交变脉冲电场胶电泳 分离10,000kb(10Mb)DNA 片段 正交变电场：电流方向垂直变化Phage MS2 RNA片段的分离片段的分离tRNAs的分离的分离 鼠肝鼠肝鸡肝鸡肝+正交变电场正交变电场1 2 3 1.yeast染色体 16 条,220-2500kb2.DNA 48.5kb N3.E.coli DNA NotIYeast 16条染色体条染色体 DNA 电泳图谱电泳图谱e.染色剂 溴乙锭(ethidium bromide EB),嵌入bp 254nm,300nm,360nm UV激发,590nm荧光 银染 PAGE,AgNO3 染ss,ds DNA RNA EB-DNA

30、 复合物 光损害光损害 nm nm 灵敏度灵敏度 nick dimer nick dimer 光褪色光褪色 254 较高 1 多 1 多 1 严 重 300 300 最高最高 1.5 1.5 少少 1/15 1/15 少少 1/84 1/84 轻轻 360 低 0.2 少 1/72 无 无 f.回收 电泳 透析袋、DEAE-纤维素膜 浸出法 低熔点agarose gel(LMP agarose)离心法 微孔膜 玻璃粉 回收样品，EtOH 回收率:1 kb 95%20 kb 20%3.柱层析 分离容量大，mg-g 级 a.排阻层析 b.离子交换层析 c.反向层析(RPC)d.硝酸纤维素柱层析4.分子杂交法 a.oligo dT 纤维素 b.Southern blot 分离特定基因片段5.重组DNA法 目的片段的扩增和纯化