生物样品超薄切片技术.ppt

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1、 生物样品生物样品常规制样技术常规制样技术超薄切片技术超薄切片技术负染色技术负染色技术扫描样品制作技术扫描样品制作技术透射电镜透射电镜特殊制样技术特殊制样技术冷冻蚀刻技术冷冻蚀刻技术电镜细胞化学技术电镜细胞化学技术免疫电镜技术免疫电镜技术 X射线微区分析技术射线微区分析技术第四章第四章 透射电镜生物样品透射电镜生物样品 制备技术制备技术第一节第一节 载网和支持膜载网和支持膜第二节第二节 超薄切片的制作超薄切片的制作第三节第三节 负染色技术负染色技术第一节 载网和支持膜一、载网：用于承载样品的一、载网：用于承载样品的(直径为直径为3mm)网状材料。网状材料。1.载网的类型及选择：载网的类型及选择

2、：非金属网非金属网：载网载网金属网金属网铜网铜网：惰性网：惰性网：70的透过率2.载网的清洗：酸碱法或有机溶剂、蒸馏水等洗净干燥。载网的清洗：酸碱法或有机溶剂、蒸馏水等洗净干燥。X射线元素分析射线元素分析常规超薄切片常规超薄切片(200目以上目以上)细胞化学细胞化学二、样品支持膜二、样品支持膜为了增强样品的强度，在载网表面先覆一层薄膜。为了增强样品的强度，在载网表面先覆一层薄膜。1.对膜的要求：对膜的要求：v本身没有结构，薄而透明，电子束易通过；本身没有结构，薄而透明，电子束易通过；v有足够的机械强度，经得住电子束的轰击；有足够的机械强度，经得住电子束的轰击；v不与样品发生化学反应。不与样品发

3、生化学反应。v厚度在厚度在1015nm2.常用支持膜及其制备常用支持膜及其制备福尔莫瓦膜（福尔莫瓦膜（Formvar):化学名称：聚乙烯醇缩甲醛化学名称：聚乙烯醇缩甲醛.特点：机械强度高，制作简便特点：机械强度高，制作简便.制作：的氯仿溶液，玻璃片汆出制作：的氯仿溶液，玻璃片汆出,水面剥离法。水面剥离法。火棉胶膜：火棉胶膜：12%醋酸戊脂溶液，平皿沉淀法醋酸戊脂溶液，平皿沉淀法。碳膜：稳定性好，高分辨制样。碳膜：稳定性好，高分辨制样。操作方法0.20.5%的的氯仿溶液氯仿溶液蒸馏蒸馏水水膜膜1.福尔莫瓦福尔莫瓦支持膜的制作方法支持膜的制作方法2.火棉胶膜用平皿水面展开法：火棉胶膜用平皿水面展开

4、法：平皿中盛有双蒸馏水，滴两滴平皿中盛有双蒸馏水，滴两滴13%的火棉胶膜液，的火棉胶膜液，待片刻溶剂挥发后，在膜上摆放洁净的铜网，滤纸捞起。待片刻溶剂挥发后，在膜上摆放洁净的铜网，滤纸捞起。3.碳膜制作：用真空喷镀法制膜。碳膜制作：用真空喷镀法制膜。第二节 超薄切片的制作超薄切片超薄切片：是指厚度小于是指厚度小于100(5070)纳纳米米的切片。的切片。要求要求：厚薄均匀、厚度符合标准；：厚薄均匀、厚度符合标准；无皱褶刀痕、震颤和沉淀；无皱褶刀痕、震颤和沉淀；细胞结构保存良好，具有良好的电子反差；细胞结构保存良好，具有良好的电子反差；具有一定程度的机械强度。具有一定程度的机械强度。制作流程制作

5、流程：包括六大步，：包括六大步，40多次操作多次操作取材取材固定固定脱水脱水包埋包埋切片切片染色染色 镜检镜检超薄切片制作流程图超薄切片制作流程图04室温室温2323760染色染色观察聚合聚合修块修块切片切片捞片捞片取材取材固定固定漂洗漂洗50%70%80%包埋包埋90%95%100%过渡过渡浸透浸透一、取材一、取材 从动、植物机体上或细胞及微生物培养物中从动、植物机体上或细胞及微生物培养物中获取所需要的研究材料的操作过程。获取所需要的研究材料的操作过程。1.取材的原则要求：取材的原则要求：准、快、小、冷、轻准、快、小、冷、轻五字原则。五字原则。准确：根据研究目的确定取材部位，取到准确：根据研

6、究目的确定取材部位，取到典型典型部位。部位。快速：材料离体后应在快速：材料离体后应在1分钟分钟内投入固定液。内投入固定液。体积小：固定液渗透力所限，样品体积为体积小：固定液渗透力所限，样品体积为1mm 或或13mm长条长条。低温：固定液及器材需预冷低温：固定液及器材需预冷(04)，以降低自溶酶的活性。以降低自溶酶的活性。防损伤：器械要锋利，切割轻巧，防挤压、牵拉损伤防损伤：器械要锋利，切割轻巧，防挤压、牵拉损伤 组织细胞的内部结构。组织细胞的内部结构。取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检2.取材方法取材方法：动物材料的获取动物材料的获取：急性处死或麻醉后，在急性处死或麻醉后，在12分钟解剖

7、出所需材料，切成分钟解剖出所需材料，切成标准块立即投入固定液，低温标准块立即投入固定液，低温(04)保存；特殊难保存；特殊难取的材料必须原位固定或灌流固定，再取材投入固定液。取的材料必须原位固定或灌流固定，再取材投入固定液。植物材料的获取植物材料的获取：注意部位和方向性。注意部位和方向性。叶片叶片切取切取13长条；长条；根、茎根、茎切取标准块；切取标准块；表面有毛刺表面有毛刺的的材料先用酶处理使之软化，材料先用酶处理使之软化，表面有蜡质表面有蜡质的叶片先脱蜡，的叶片先脱蜡，蒸馏水洗净后再取材固定。蒸馏水洗净后再取材固定。悬浮样品的获取悬浮样品的获取：加入适量固定液加入适量固定液悬浮固定悬浮固定

8、后，低速离心收集成团块再固定后，低速离心收集成团块再固定。需抽气使样品沉底需抽气使样品沉底保低温保低温 野外取材：野外取材：携带冰壶保存固定液和材料，确保携带冰壶保存固定液和材料，确保动物材料的现场固定动物材料的现场固定；植物材料植物材料可可保湿保湿带回实验室再取材固定。带回实验室再取材固定。取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检二、固定二、固定用化学或物理的方法迅速杀死细胞的过程用化学或物理的方法迅速杀死细胞的过程1.固定的目的：固定的目的：在分子水平上真实地保存组织细胞生活在分子水平上真实地保存组织细胞生活状态的细节，尽量减少细胞的死后变化状态的细节，尽量减少细胞的死后变化。2.固定的类

9、型：固定的类型：固定固定物理固定法物理固定法：化学固定法化学固定法：3.固定液的作用：固定液的作用：迅速均匀渗透到细胞内部，稳定各种细胞成分；迅速均匀渗透到细胞内部，稳定各种细胞成分；破坏细胞的酶系统，阻止细胞的自溶；破坏细胞的酶系统，阻止细胞的自溶；通过化学作用建立分子交联，形成细胞骨架；通过化学作用建立分子交联，形成细胞骨架；提供一定的电子反差。提供一定的电子反差。超低温快速冷冻固定法超低温快速冷冻固定法使用化学试剂快速杀死细胞使用化学试剂快速杀死细胞取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检12.0%4.常用固定剂及其特点常用固定剂及其特点u 醛类醛类：甲醛、甲醛、戊二醛戊二醛、多聚甲醛和

10、丙烯醛、多聚甲醛和丙烯醛戊二醛戊二醛：穿透力强，能很好固定蛋白质和糖元、保存核穿透力强，能很好固定蛋白质和糖元、保存核酸、核蛋白，对微管、内质网等细胞膜系统保酸、核蛋白，对微管、内质网等细胞膜系统保存较好；不能保存脂类物质，无电子染色作用。存较好；不能保存脂类物质，无电子染色作用。配制方法：常用的磷酸盐缓冲液配制方法：常用的磷酸盐缓冲液(pH6.87.2)配成配成。选用选用：单细胞单细胞 微生物微生物 动物组织动物组织 植物组织植物组织 厚壁组织厚壁组织浓度高高5.0%u 锇酸锇酸(OsO4)是唯一能保存脂肪的固定剂，具有电子染是唯一能保存脂肪的固定剂，具有电子染色作用。能固定脂蛋白、核蛋白，

11、不能保色作用。能固定脂蛋白、核蛋白，不能保存核酸和糖类。存核酸和糖类。取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检5.固定方法：固定方法：(1)单固定法：单固定法：用于易于渗透的材料和酶的细胞化学用于易于渗透的材料和酶的细胞化学(2)双固定法：双固定法：戊二醛戊二醛锇酸双重固定锇酸双重固定(3)原位固定法原位固定法：用于难解剖的、对缺氧敏感的组织器官，用于难解剖的、对缺氧敏感的组织器官，在保持血液供应的状态，边解剖边滴加固定液，在保持血液供应的状态，边解剖边滴加固定液，待组织适度硬化后再取材作常规固定。待组织适度硬化后再取材作常规固定。(4)灌流固定灌流固定：常用常用醛类醛类固定：用于脑组织、植物

12、叶片的气孔状态等固定：用于脑组织、植物叶片的气孔状态等通过血液循环的途径，将固定液灌注到相应部位，通过血液循环的途径，将固定液灌注到相应部位，待组织适度硬化后再解剖取材，作常规固定待组织适度硬化后再解剖取材，作常规固定。用于解剖关系复杂的组织（神经组织、脑垂体）用于解剖关系复杂的组织（神经组织、脑垂体）戊二醛戊二醛取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检直接影响被固定细胞的原有特定形态直接影响被固定细胞的原有特定形态6.影响固定效果的因素影响固定效果的因素(1)固定液的酸碱度固定液的酸碱度：固定液的酸碱度必须与被固定材料的酸碱度基本一致固定液的酸碱度必须与被固定材料的酸碱度基本一致。例如例如多

13、数动物的多数动物的pH值平均为，所以常用；值平均为，所以常用；植物体的植物体的pH值为，所以常用；值为，所以常用；原生动物及胚胎适于原生动物及胚胎适于pH为，胃黏膜为，胃黏膜pH为为 效果最佳；效果最佳；(2)固定液的渗透压固定液的渗透压：固定液与被固定组织之间必须固定液与被固定组织之间必须保持渗透平衡保持渗透平衡。电解质：钾钠钙电解质：钾钠钙(0.5%CaCl)可防止膨胀可防止膨胀非电解质：蔗糖、葡萄糖膜系统稳定剂非电解质：蔗糖、葡萄糖膜系统稳定剂取材固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检（3）缓冲液类型）缓冲液类型磷酸盐缓冲液：磷酸盐缓冲液：仿效细胞外液成分配制，无毒且富有生仿效细胞外液成分配

14、制，无毒且富有生理功能。适于配各种固定液和材料漂洗液。理功能。适于配各种固定液和材料漂洗液。二钾胂酸盐二钾胂酸盐 缓冲液缓冲液有毒，稳定性好。适用于细胞化学和有毒，稳定性好。适用于细胞化学和保存脂肪的样品处理、钙离子定位研究保存脂肪的样品处理、钙离子定位研究不宜长期保不宜长期保存存可长期保存可长期保存取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检(4)固定时间、温度及样品块大小固定时间、温度及样品块大小时间时间：因材料而异，单细胞和动物材料较短，植物材料因材料而异，单细胞和动物材料较短，植物材料 及厚壁组织较长。及厚壁组织较长。112小时小时。温度：温度：低温以抑制酶的活性，通常在低温以抑制酶的活性

15、，通常在04条件固定条件固定。样品块大小：样品块大小：受固定液渗透能力影响，小块材料易得到受固定液渗透能力影响，小块材料易得到良好固定良好固定。取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检7.注意事项注意事项（1）控制固定温度）控制固定温度04利于利于抑制酶的活性抑制酶的活性，减少细胞，减少细胞 自溶。自溶。（2）掌握固定时间：根据材料类型和特点而定，后固定）掌握固定时间：根据材料类型和特点而定，后固定 时间不宜太长，否则易造成碎片时间不宜太长，否则易造成碎片。（3）充分漂洗：除去残留固定液）充分漂洗：除去残留固定液。（4）特殊材料的特殊处理：）特殊材料的特殊处理：植物及较疏松的材料：抽气使其沉入

16、固定液中；植物及较疏松的材料：抽气使其沉入固定液中；厚壁组织：采用低压容器或振荡方式促进渗透；厚壁组织：采用低压容器或振荡方式促进渗透；表面有蜡质的材料：应该先脱蜡后固定。表面有蜡质的材料：应该先脱蜡后固定。取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检三、脱水三、脱水脱水指用适当的有机溶剂，取代组织细胞中脱水指用适当的有机溶剂，取代组织细胞中的游离水的过程。的游离水的过程。1.必要性必要性：水分存在会影响非水溶性包埋剂水分存在会影响非水溶性包埋剂的渗透，进而影响切片的完整性的渗透，进而影响切片的完整性2.常用脱水剂常用脱水剂：醇类醇类(乙醇乙醇)和丙和丙酮酮3.脱水方法：梯度系列脱水法。脱水方法：

17、梯度系列脱水法。30%50%70%80%90%95%100%2次次4.注意事项：注意事项：脱水中断只能在脱水中断只能在70%，高浓度脱水剂易使组织变脆，成分抽提；，高浓度脱水剂易使组织变脆，成分抽提；末级脱水剂应先用吸水剂处理，以保证脱水彻底；末级脱水剂应先用吸水剂处理，以保证脱水彻底；高浓度脱水操作要快，以防样品内进入空气或吸水受潮。高浓度脱水操作要快，以防样品内进入空气或吸水受潮。取材取材 固定固定 脱水脱水 包埋包埋 切片切片 染色染色 镜检镜检四、浸透与包埋：四、浸透与包埋：用包埋剂逐步取代样品中的脱水剂，使细胞内外的用包埋剂逐步取代样品中的脱水剂，使细胞内外的所有孔隙都被包埋剂填充，

18、聚合后形成适合机械切所有孔隙都被包埋剂填充，聚合后形成适合机械切割的固体包埋块。割的固体包埋块。1.包埋剂：包埋剂：理想包埋剂的特点理想包埋剂的特点：粘稠度低，容易渗透；聚合均匀，粘稠度低，容易渗透；聚合均匀，不产生体积收缩；耐电子束轰击，高温不变形，不升华；不产生体积收缩；耐电子束轰击，高温不变形，不升华；本身无结构，并具有良好的切割性能，切片易染色本身无结构，并具有良好的切割性能，切片易染色。常用包埋剂：常用包埋剂：非水溶性非水溶性(Epon812)和水溶性包埋剂。和水溶性包埋剂。包埋剂包埋剂 Epon812或或618固化剂固化剂 DDSA（十二烷基琥珀酸酐）（十二烷基琥珀酸酐）MNA（六

19、甲酸酐）（六甲酸酐）增塑剂增塑剂 DBP（邻苯二甲酸二丁脂）（邻苯二甲酸二丁脂）催化剂催化剂 DMP-30调节塑性而调节塑性而改变切割性能改变切割性能用于用于618边脱水边包埋边脱水边包埋取材取材 固定固定 脱水脱水 包埋包埋 切片切片 染色染色 镜检镜检2.浸透浸透四四.浸透与包埋浸透与包埋脱水后经环氧丙烷过渡脱水后经环氧丙烷过渡,再逐渐浸入包埋剂。再逐渐浸入包埋剂。包埋剂包埋剂:过渡剂比例为过渡剂比例为 1:31:13:1纯包埋纯包埋剂剂浸透时间：因材料而异浸透时间：因材料而异 1:3 1:1 3:1单细胞单细胞 0.5 0.51 0.5动物材料动物材料 1 14 12植物材料植物材料 1

20、 112 212比例比例时间时间材料材料3.包埋包埋常规包埋常规包埋：用牙签把材料挑入模具，注入包埋剂，做好标记用牙签把材料挑入模具，注入包埋剂，做好标记；定向包埋定向包埋：样品挑入浅槽，摆好方向、注剂、装标签；样品挑入浅槽，摆好方向、注剂、装标签；注意事项注意事项：样品块附近不能存在气泡。样品块附近不能存在气泡。4.聚合聚合循序渐进提高温度，促进聚合循序渐进提高温度，促进聚合37(12h)45(12h)60(24h)取材 固定 脱水 包埋 切片 染色 镜检五、超薄切片五、超薄切片制刀制刀修块修块切片切片展片展片捞片捞片1.切片刀：切片刀：钻石刀、玻璃刀钻石刀、玻璃刀12mm25/38mm46

21、.5mm制作玻璃刀：制作玻璃刀：2.修块修块：除去样品周边的包埋介质和不感兴趣部位，保留除去样品周边的包埋介质和不感兴趣部位，保留有用信息便于切割，提供尽可能大的有效观察面。有用信息便于切割，提供尽可能大的有效观察面。要点：上、下边必须平行要点：上、下边必须平行形状：顶端面为梯形的锥体（金字塔形）形状：顶端面为梯形的锥体（金字塔形）取材取材 固定固定 脱水脱水 包埋包埋 切片切片 染色染色 镜检镜检3.切片切片=厚度厚度热膨胀推进式切片机示意图热膨胀推进式切片机示意图装刀、加水：特别注意刀高和倾角，液面高度；装刀、加水：特别注意刀高和倾角，液面高度；切片、捞片：切片带用睫毛笔收集，铜网沾取；切

22、片、捞片：切片带用睫毛笔收集，铜网沾取；切片厚度的判断切片厚度的判断：切片表面的反射光和切片下表面反射光切片表面的反射光和切片下表面反射光 产生的干涉颜色为依据，不同厚度切片呈现不同的颜色。产生的干涉颜色为依据，不同厚度切片呈现不同的颜色。干涉颜色干涉颜色 暗灰色暗灰色 灰色灰色 银白色银白色 金黄色金黄色 紫色紫色切片厚度切片厚度 40nm以下以下 4050nm 5070nm 7090nm 90nm以上以上取材取材 固定固定 脱水脱水 包埋包埋 切片切片 染色染色 镜检镜检六、染色六、染色1.染色原理：使用重金属盐类与样品中的某些成分结合或染色原理：使用重金属盐类与样品中的某些成分结合或 被

23、吸附，以增加电子散射量从而达到提高反差的目的被吸附，以增加电子散射量从而达到提高反差的目的。电子染电子染色色2.电子染色剂电子染色剂：具有特异性具有特异性 常用染色剂为铀和铅盐常用染色剂为铀和铅盐醋酸铀醋酸铀：能提高核酸、蛋白质和结缔组织的反差，：能提高核酸、蛋白质和结缔组织的反差，对膜系统染色较差。对膜系统染色较差。配制：配制：13%的的50%或或70%的乙醇溶液，避光保存。的乙醇溶液，避光保存。铅盐铅盐：对膜系统、糖元、核蛋白、脂类有较好的染色作用。常用对膜系统、糖元、核蛋白、脂类有较好的染色作用。常用 硝酸铅和柠檬酸钠水溶液配成柠檬酸铅。易产生沉淀污染样品。硝酸铅和柠檬酸钠水溶液配成柠檬

24、酸铅。易产生沉淀污染样品。配制配制：硝酸铅硝酸铅 柠檬酸钠柠檬酸钠 双蒸馏水双蒸馏水 30mlpH 1112用力振荡用力振荡30min，呈乳状悬，呈乳状悬液，加入液，加入8ml 1N的的NaOH，溶液透明后加水至溶液透明后加水至50ml取材取材 固定固定 脱水脱水 包埋包埋 切片切片 染色染色 镜检镜检3.染色方法染色方法(1)单染色：只用一种染色液（铀）染色的方法。单染色：只用一种染色液（铀）染色的方法。(2)双染色：双染色：铀铀铅铅染色法染色法(3)块染色块染色：铅铅铀铀铅铅染色可提高反差染色可提高反差石蜡层石蜡层铀染铀染2030分分钟钟铅染色铅染色1530分钟分钟水洗水洗303次次材料固

25、定后、脱水前，整块用材料固定后、脱水前，整块用50%乙醇乙醇醋酸铀醋酸铀饱和溶液，饱和溶液，4染色染色212小时，常规切片镜检。小时，常规切片镜检。取材取材 固定固定 脱水脱水 包埋包埋 切片切片 染色染色 镜检镜检4.示踪性染色示踪性染色多用于免疫电镜技术和多用于免疫电镜技术和(酶酶)细胞化学技术细胞化学技术取材取材 固定固定 脱水脱水 包埋包埋 切片切片 染色染色 镜检镜检(1)概念：用各种大小的离子、分子等颗粒作为示踪物，概念：用各种大小的离子、分子等颗粒作为示踪物，显示细胞间的连接部位与方式，研究细胞的通透屏障，测显示细胞间的连接部位与方式，研究细胞的通透屏障，测量通透孔道的大小，追踪

26、组织液的生理通路。量通透孔道的大小，追踪组织液的生理通路。（2）常用示踪剂：硝酸镧（）常用示踪剂：硝酸镧（2nm），辽红（），），辽红（），无机胶体金，草酸钙以及酶类，铁蛋白等。无机胶体金，草酸钙以及酶类，铁蛋白等。(3)染色方法：染色方法：通常将示踪剂加入进所有的处理液中。通常将示踪剂加入进所有的处理液中。1%2%硝酸镧或硝酸镧或0.05%0.8%辽红辽红与戊二醛固定与戊二醛固定含相同浓度含相同浓度示踪剂的示踪剂的1%锇酸锇酸含示踪剂的含示踪剂的缓冲液漂洗缓冲液漂洗常规脱水常规脱水包埋聚合包埋聚合超薄切片超薄切片直接镜检直接镜检硝酸镧标记的葱根尖细胞硝酸镧标记的葱根尖细胞镧颗粒沉积在细胞间隙

27、镧颗粒沉积在细胞间隙免疫电镜技术免疫电镜技术：将免疫学中抗原将免疫学中抗原-抗体反应的特异性与组织化学形态的可见性，抗体反应的特异性与组织化学形态的可见性，利用电镜的高分辨率和放大能力，在超微结构和分子水平上利用电镜的高分辨率和放大能力，在超微结构和分子水平上研究细胞的形态和功能。研究细胞的形态和功能。可以进行细胞内抗体可以进行细胞内抗体-抗原的定性、定位研究。抗原的定性、定位研究。如：免疫铁蛋白、酶（辣根过氧化酶）、胶体金如：免疫铁蛋白、酶（辣根过氧化酶）、胶体金 对铁蛋白抗体、酶标记抗体、胶体金标记抗体的定位对铁蛋白抗体、酶标记抗体、胶体金标记抗体的定位电镜细胞化学技术电镜细胞化学技术：尽

28、可能保存细胞超微结构的同时，在原位将生物化学的尽可能保存细胞超微结构的同时，在原位将生物化学的反应在电镜下显示出来，从而将结构与功能的研究结合起来。反应在电镜下显示出来，从而将结构与功能的研究结合起来。如：酶在细胞内的定位如：酶在细胞内的定位 核酸（核酸（DNA、RNA）脂肪、碳水化合物的定位）脂肪、碳水化合物的定位 各种无机离子（钙离子）定位等各种无机离子（钙离子）定位等胶体金标记的叶绿体胶体金标记的叶绿体超薄切片制作小结超薄切片制作小结一、制作环节应掌握一、制作环节应掌握“六要一防六要一防”取材要准确取材要准确 固定要及时固定要及时 漂洗要充分漂洗要充分 脱水要彻底脱水要彻底浸透要完全浸透

29、要完全 切片要均匀切片要均匀 染色防污染染色防污染二、不同材料制作特点：二、不同材料制作特点：动物组织：取材迅速，固定及时；动物组织：取材迅速，固定及时；植物材料：调节处理时间，确保渗透彻底；植物材料：调节处理时间，确保渗透彻底；游离细胞：注意收集，以防样品丢失；游离细胞：注意收集，以防样品丢失；孢粉、花粉以及藻类：预包埋收集，完全浸透。孢粉、花粉以及藻类：预包埋收集，完全浸透。三三.处理时间处理时间脱水脱水过渡过渡浸透浸透聚合聚合包埋包埋切片切片染色染色取材取材前固定前固定漂洗漂洗后固定后固定漂洗漂洗 准确准确防损伤防损伤24h3次次/15min12h8 级级/15min34h2次次/15m

30、in3级级/48h铀染：铀染：1530min铅染：铅染：1015min500700微黄色微黄色黑色或黑色或深褐色深褐色防止污染防止污染04室温室温第三节第三节 负染色技术负染色技术一负染色及其原理：一负染色及其原理：1.负染色：即阴性染色负染色：即阴性染色利用高电子密度、并且在电镜下不显示结构的重金属利用高电子密度、并且在电镜下不显示结构的重金属盐类在样品四周的堆积而盐类在样品四周的堆积而增强样品外围的电子密度增强样品外围的电子密度，从而从而衬托衬托出样品的形态和大小出样品的形态和大小。载网和膜载网和膜样品样品染色液染色液2.原理：电子束通过原子序数高的物质时，与其电子和原原理：电子束通过原子

31、序数高的物质时，与其电子和原 子核碰撞的几率较高，容易发生散射而形成负反差。子核碰撞的几率较高，容易发生散射而形成负反差。任何物体若被密度比本身大任何物体若被密度比本身大2倍以上的物质所包围或倍以上的物质所包围或 浸没时，电镜下反差得到加强而形成负反差。浸没时，电镜下反差得到加强而形成负反差。二二.负染色样品的制备负染色样品的制备具有一定浓度和纯度具有一定浓度和纯度的悬浮液的悬浮液（一）直接取样法：（一）直接取样法：用于含杂质少而具有一定浓度的样品用于含杂质少而具有一定浓度的样品1.生长在固体培养基上的微生物：用接种环刮下配成生长在固体培养基上的微生物：用接种环刮下配成 双蒸馏水悬浮液即可滴样

32、或沾样。双蒸馏水悬浮液即可滴样或沾样。2.放线菌孢子：双蒸馏水从菌体上洗下成悬液即可滴样放线菌孢子：双蒸馏水从菌体上洗下成悬液即可滴样。3.皮肤疱疹（水痘等）用毛细管穿刺取样，直接滴膜皮肤疱疹（水痘等）用毛细管穿刺取样，直接滴膜。4.植物染病体：切碎后双蒸馏水悬浮片刻即可沾样。植物染病体：切碎后双蒸馏水悬浮片刻即可沾样。需保持活体的植物，刺破表皮处滴加蒸馏水，需保持活体的植物，刺破表皮处滴加蒸馏水，待病毒游离出来即可沾样。待病毒游离出来即可沾样。负染色样品的制备（二）样品提纯法：用于杂质较大的材料二）样品提纯法：用于杂质较大的材料1.离心提纯法离心提纯法：用于血清、粪便、尿样、痰液、用于血清、

33、粪便、尿样、痰液、活组织、植物研磨破碎悬浮液活组织、植物研磨破碎悬浮液低速离心：低速离心：25003000rpm,10min,弃沉淀（细胞碎片）弃沉淀（细胞碎片）高速离心：高速离心：15000rpm,60min,取沉淀适当稀释即可沾样取沉淀适当稀释即可沾样。2.透析提纯法：透析提纯法：除去盐类杂质除去盐类杂质样品滴在漂浮在水面的膜是样品滴在漂浮在水面的膜是甲醛蒸汽固定甲醛蒸汽固定1520分钟分钟静置透析静置透析324小时小时捞网染色捞网染色3.琼脂过滤提纯法琼脂过滤提纯法：琼脂板琼脂板样品样品膜膜琼脂过滤琼脂过滤20分钟分钟蒸馏水漂浮剥离蒸馏水漂浮剥离捞膜染色捞膜染色(三三)病毒样品浓缩方法病

34、毒样品浓缩方法1.红血球吸附法红血球吸附法：用于多数黏液病毒和副黏液病毒浓缩用于多数黏液病毒和副黏液病毒浓缩病毒悬液与等量红血球混合静置病毒悬液与等量红血球混合静置5分钟使病毒粒子吸附于红血球上；分钟使病毒粒子吸附于红血球上；低速离心（低速离心（1000转以下）转以下）15分钟，弃上清；分钟，弃上清；加入少量生理盐水，低温（加入少量生理盐水，低温（4）静置）静置34小时使病毒释放于溶液中；小时使病毒释放于溶液中；取该悬浮液即可滴膜负染。取该悬浮液即可滴膜负染。吸附吸附离心离心分离悬浮分离悬浮滴染滴染2.细胞低渗释放法细胞低渗释放法将培养细胞刮下低速离心，弃上清；将培养细胞刮下低速离心，弃上清；

35、在沉淀中加入在沉淀中加入4倍体积蒸馏水，使细胞因低渗膨胀破倍体积蒸馏水，使细胞因低渗膨胀破 裂而释放出病毒，再快速冻融数次；裂而释放出病毒，再快速冻融数次；再低速离心，取上清液滴膜负染。再低速离心，取上清液滴膜负染。3.抗体抗体病毒凝结法：形成病毒凝结法：形成“病毒病毒抗体抗体”复合物离心浓缩，复合物离心浓缩，取沉淀制成悬浮液样品即可负染色。如：风疹病毒、取沉淀制成悬浮液样品即可负染色。如：风疹病毒、肝炎病毒。肝炎病毒。4.植物染病体：低温保存植物染病体：低温保存研磨破碎研磨破碎离心离心上清液负染色上清液负染色四四.负染色负染色剂剂密度比生物样品大四倍以上的重金属盐类密度比生物样品大四倍以上的

36、重金属盐类(一一)负染色剂的特征负染色剂的特征:具有较高的电子密度和散射能力；具有较高的电子密度和散射能力；较高的熔点；较高的溶解度，不易析出沉淀；分子小易较高的熔点；较高的溶解度，不易析出沉淀；分子小易 渗透；化学稳定而不与样品发生化学反应渗透；化学稳定而不与样品发生化学反应。(二二)常用负染色剂及其特点常用负染色剂及其特点 1.磷钨酸磷钨酸(PTA)、磷钨酸钾、磷钨酸钾(KPT)、磷钨酸钠、磷钨酸钠(NaPT)特点：特点：颗粒细，反差好，图象背景干净颗粒细，反差好，图象背景干净;溶液：溶液：13%的水溶液的水溶液(pH6.07.2),稳定便于长期保存稳定便于长期保存;应用：应用：多数病毒样

37、品，对黄瓜花叶病毒、弹状病毒、苜蓿花叶多数病毒样品，对黄瓜花叶病毒、弹状病毒、苜蓿花叶 病毒等产生破坏作用。病毒等产生破坏作用。2.醋酸铀醋酸铀：特点：特点：图象结构细节好，反差较强，破坏作用小；易污染样品；图象结构细节好，反差较强，破坏作用小；易污染样品；溶液：溶液：0.51%水溶液水溶液(pH4.24.5),见光不稳定，保存期短。见光不稳定，保存期短。（二）常用负染色剂（二）常用负染色剂3.甲酸铀：甲酸铀：适用于具有螺旋对称结构的病毒颗粒，能显示出病毒的适用于具有螺旋对称结构的病毒颗粒，能显示出病毒的蛋白质亚基结构。常用蛋白质亚基结构。常用0.51%的水溶液，极不稳定，的水溶液，极不稳定，

38、不宜保存，须现配现用不宜保存，须现配现用。4.钼铵酸：钼铵酸：适于有界膜的生物样品，反差较弱，性能稳定，破坏性适于有界膜的生物样品，反差较弱，性能稳定，破坏性小，常用小，常用12%的水溶液，用盐酸或氨水调至的水溶液，用盐酸或氨水调至，可长期保存，可长期保存。5.硅钨酸：类似于磷钨酸，常用硅钨酸：类似于磷钨酸，常用12%的水溶液，中性的水溶液，中性 偏碱。偏碱。滤纸滤纸滤纸滤纸五五.负染色操作方法负染色操作方法样品样品2.漂浮法漂浮法染色液染色液染色液染色液3.喷雾法喷雾法：样品与染色液混合，喷洒在载网膜上样品与染色液混合，喷洒在载网膜上。优点：样品分布均匀；优点：样品分布均匀；缺点：样品和染色

39、液消耗量大，易造成病毒扩散缺点：样品和染色液消耗量大，易造成病毒扩散。样品吸附样品吸附23分钟分钟滤纸吸取滤纸吸取多余样品多余样品滴染色液滴染色液吸去染液吸去染液干燥后干燥后镜镜 检检2分钟分钟水膜未干六六.影响负染色效果的因素影响负染色效果的因素1.染色时机染色时机：水膜刚消失水膜刚消失样品样品未完全干燥未完全干燥时染色效果最好时染色效果最好2.样品纯度：样品纯度：3.样品浓度样品浓度：4.酸碱度：染色液的酸碱度应该与样品的酸碱度接近酸碱度：染色液的酸碱度应该与样品的酸碱度接近。5.必须做对照染色：以排除假象必须做对照染色：以排除假象样品中的杂质会影响观察效果样品中的杂质会影响观察效果浓度小找样困难，浓度大则易造成样品堆积浓度小找样困难，浓度大则易造成样品堆积成团，影响观察效果成团，影响观察效果。磷钨酸一般磷钨酸一般pH值；醋酸铀、钾酸铀值；醋酸铀、钾酸铀pH值为值为较好。较好。个别样品个别对待个别样品个别对待。七、负染色技术的应用：七、负染色技术的应用：微粒样品的快速鉴定：类病毒、病毒粒子，生物大分子（蛋白质分子或结晶、核酸分子的展层技术）。SARS呼肠病毒呼肠病毒