细胞因子的检测与应用CBA.ppt

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1、细胞因子的检测与应用CBA Still waters run deep.流静水深,人静心深 Where there is life,there is hope。有生命必有希望流式的基本原理流式检测细胞因子CBA技术的应用流式细胞术（Flow Cytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测直线流动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术。流式细胞仪（Flow Cytometer）集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。流式细胞术定义BD Accuri C6流式细胞术原理Mu

2、lticolor Research A 各种细胞（如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等流式细胞仪的检测范围 细胞结构细胞大小细胞颗粒度细胞表面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量 细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内/外的细胞因子激素结合位点、细胞受体蛋白磷酸化pH值钙离子浓度细胞膜电位、线粒体膜电位 流式的基本原理流式检测细胞因子CBA技术的应用一个细胞的全面研究Cell Vol.132,January 25,2008什么是CBA?多重分析节约样本灵敏度高 CBA是利用一系列荧光强度不同的微球，同时分析样本中

3、多种可溶性成分的流式检测方法。每个CBA微球有特定的荧光强度，大小一致，包被有特异性抗体，提供了捕获表面，有效捕获待测蛋白，再加入荧光标记（PE）的检测抗体，形成“三明治”夹心复合物进行检测。+Analyze of InterestFluorescent Detector Ab-PECapture BeadCapture Ab一系列荧光强度不同的微球包被有特异性捕获抗体，与待测样本孵育后，形成“三明治”复合物。CBA原理CBA原理+IL-8 IL-6100100101101102102103103104104Bead IntensityFL3(670LP)Detector Ab Intensi

4、tyFL2(585/42BP)BDTM CBA Kits操作步骤l 检测物与捕获微球共孵育l 标记荧光探测试剂（FITC或PE标记）l 洗涤l 流式细胞仪检测l CBA分析软件批量数据分析Human Th1/Th2 Cytokine CBA 标准曲线5000 pg/ml2500 pg/ml1250 pg/ml 625 pg/ml312 pg/ml80 pg/ml20 pg/mlIL-2IL-4IL-5IL-10TNF-IFN-IL-2IL-4IL-5IL-10TNF-IFN-CBA 分析软件Home ScreenToolbarCalibration entry screen基本原理与CBA k

5、it相似检测原理不同：Flex Set微球带有近红外和红色两种荧光，分别在流式细胞仪的FL3（近红外荧光）和FL4（红色荧光）通道检测，通过这个二维矩阵（对应于微球上的特定序号）识别捕获微球，从而定性目的蛋白，PE标记的检测抗体在FL2通道来对目的蛋白定量。BD CBA Flex SetBD CBA Flex SetCBA Flex Set的分析软件 FCAP Array SoftwareCBA Kit与CBA Flex SetCBA Kit同时检测5或者6个全部试剂CBA Analysis Software检测指标组合固定CBA Flex Set同时检测30个需另购Buffer kitFCA

6、P Array Software检测指标可自由组合CBA特点液相中反应，同时检测多种蛋白操作简单(标本制备和上机检测），省时省力微量样本(5-50ul)灵敏度2.8pg/ml所有分析只需一组标准曲线避免酶联反应信号放大带来的假阳性更好的线性度和更宽的检测范围(5000pg/ml)流式细胞仪和CBA软件自动分析传统的ELISA与CBA相比ELISACBA样本量体积大多元和同步单一Elisa样本体积的1/6灵敏度低，稳定性差灵敏度高，稳定性好芯片式集成测定，所需样本浓度低缩短时间，提高效率每个蛋白分别检测，样本浓度高，时间长，效率低酶联放大效应，结果易失真流式荧光定量检测，避免假阳性现有CBA K

7、it产品Human Anaphylatoxin KitC4a,C3a,C5aHuman Chemokine KitIL-8,RANTES,MIG,MCP-1,IP-10Human Inflammation KitIL-8,IL-1b,IL-6,IL-10,TNF,IL-12p70Human Th1/Th2/Th17 KitIL-2,IL-4,IL-6,IL-10,TNF,IFN-g,IL-17AHuman Th1/Th2 Cytokine KitIL-2,IL-4,IL-5,IL-10,TNF,IFN-gHuman Th1/Th2 Cytokine II Kit IL-2,IL-4,IL-6,

8、IL-10,TNF,IFN-gMouse Inflammation KitIL-6,IL-10,MCP-1,IFN-g,TNF,IL-12p70Mouse Th1/Th2 Cytokine KitIL-2,IL-4,IL-5,IFN-g,TNFMouse Immunoglobulin Isotyping KitHeavy and light chain isotypes ofIgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3,IgA,IgM,IgEMouse Th1/Th2/Th17 KitIL-2,IL-4,IL-6,IL-10,TNF,IFN-g,IL-17ANon-human Primate T

9、h1/Th2 Cytokine KitIL-2,IL-4,IL-5,IL-6,TNF,IFN-gHuman Inflammation Lyophilized StandardsIL-8,IL-1b,IL-6,IL-10,TNF,IL-12p70Human Th1/Th2 Cytokine Lyophilized StandardsIL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,TNF,IFN-gMouse Inflammation Lyophilized StandardsIL-6,IL-10,MCP-1,TNF,IFN-g,IL-12p70Mouse Th1/Th2 Cytokine L

10、yophilized StandardsIL-2,IL-4,IL-5,IFN-g,TNF现有CBA Flex Set产品 人小鼠大鼠IFN-,INF-IL-1 ,IL-1,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8,IL-9,IL-10,IL-11,IL-12,IL-12p70,IL-13,IL-17A,IL-21,IL-23p40TNF,TNFR,TNFRIP-10I-TACMIGMCP-1MIP-1,MIP-1 EotaxinRANTESCD54(ICAM-1)CD62E,CD62P,CD62LCD106(VCAM-1)sCD40sCD154(CD40 Ligan

11、d)sCD121a,sCD121bSoluble CD14Basic FGFVEGFAngiogeninG-CSF,GM-CSFLIFLT-OSMGranzyme A,Granzyme BFas Ligand(FasL)FractalkineIgA,IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgM,Total IgG,IFN-IL-1 ,IL-1,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-9,IL-10,IL-12,IL-12p70,IL-13,IL-17A,IL-21,IL-23p40,TNFMIGMCP-1MIP-1,MIP-1 RANTESKCCD62E(E-Selectin

12、),CD62L(L-Selectin)G-CSF,GM-CSFIFN-IL-1,IL-4,IL-6,IL-10TNF 流式的基本原理流式检测细胞因子CBA技术的应用CBA 应用检测对象血清、血浆、眼泪、房水、唾液、体腔灌洗液、细胞培养液上清、细胞裂解物等应用领域肿瘤研究及肿瘤疾病的辅助诊断、疗效和预后监测干细胞研究和干细胞治疗监测免疫学研究和免疫疾病的辅助诊断和监控感染疾病的研究及辅助诊断和疗效评价免疫功能监测药效评价，药物研发、疫苗研究细胞信号传导中磷酸化蛋白、凋亡相关蛋白定量分析一、CBA的免疫学应用-Th1/Th2IFN、IL-2IL-4、5、6、10IL-4、10IFN细胞免疫体液免疫

13、Th1介导细胞免疫、细胞毒性T细胞(CTL)生长和活化、巨噬细胞(M)活化迟发型过敏反应。Th2B细胞生长、活化和分化。Th1/2的平衡关系着免疫平衡现有CBA Flex Set产品-信号蛋白Phospho Akt1(S473)Phospho Akt2(S474)Phospho BLNK(Y84)Phospho p120 Catenin(Y228)Phospho Btk(Y551)Phospho MEK1/2(S222)Phospho eNOS(S1177)Phospho Paxillin(Y118)Phospho ERK1/2(T202/Y204)Phospho Pyk2(Y402)Phos

14、pho Itk(Y511)Phospho SLP-76(Y145)Phospho JNK1/2(T183/Y185)Phospho c-jun(S63)Phospho p38(T180/Y182)Phospho stat3Phospho PLCg(Y783)Phospho Rsk(T573)Phospho Stat1(Y701)Phospho Syk(Y352)Phospho ZAP70(Y319)Total Stat1Human Rex-1 Flex SetTotal SykHuman Oct-4 Flex SetTotal ZAP70Human Nanog Flex Set二、CBA在肿瘤

15、中的应用诊断：恶性肿瘤时Th2亢进，良性肿瘤相反全面快速的免疫功能评价治疗前治疗中：如CIK治疗后4天细胞因子会发生变化治疗：随时调整治疗方案 临床上主要采用经验治疗和采用国内外抗感染治疗指南的方法治疗感染，具有一定的盲目性，且容易受临床医师各自的临床经验和诊断水平的影响。一旦发生发热感染，常立即加用广谱抗细菌+抗真菌+抗病毒等多重覆盖治疗法，不仅造成抗生素的滥用，招致耐药菌株的出现，而且加重了患儿身体和经济负担。三、CBA在感染中的应用四、CBA在药物疫苗研发中的应用流感模型动物的炎性因子表达谱，用于疫苗评价，共检测18个指标（BD CBA Flex Set）CBA应用相关中文文献CBA特点液相中反应，同时检测多种蛋白操作简单(标本制备和上机检测），省时省力微量样本(5-50ul)灵敏度2.8pg/ml所有分析只需一组标准曲线避免酶联反应信号放大带来的假阳性更好的线性度和更宽的检测范围(5000pg/ml)流式细胞仪和CBA软件自动分析Thanks!