生物化学第10章酶的作用机制和酶的调节.ppt

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1、第10章 酶的作用机制和酶的调节一、酶的活性部位一、酶的活性部位二、二、酶催化反应的独特性质酶催化反应的独特性质三、影响酶催化效率的有关因素三、影响酶催化效率的有关因素四、酶催化反应机制的实例四、酶催化反应机制的实例五、酶活性的调节控制五、酶活性的调节控制六、同工酶六、同工酶(mechanisms of enzyme action and regulation of enzyme activity)一、酶的活性部位酶活性部位的特点 在在酶酶分分子子中中，只只有有少少数数几几个个氨氨基基酸酸残残基基直直接接参参与与结结合合底底物物和和催催化化反反应应，这这些些氨氨基基酸酸残残基基在在一一级级结结

2、构构上上可可以以相相距距很很远远，但但通通过过肽肽链链的的折折叠叠、盘盘绕绕，使使它它们们在在空空间间上上相相互互接接近近。这这些些残残基基在在空空间间上上所所在在的的部部位位称称为为活活性性部部位位（active site）或或活活性性中中心心（active center），酶酶的的活活性性部部位位往往往往有有一一个个裂缝或口袋状的区域，其形状与底物相似。裂缝或口袋状的区域，其形状与底物相似。胰凝乳蛋白酶活性部位的结构57102195酶活性部位的特点 当当底底物物与与酶酶通通过过次次级级键键结结合合时时，底底物物和和酶酶都都可可能能发发生生形形变变，诱诱导导契契合合，使使得得底底物物与与酶酶

3、的的活活性性部部位位的的形形状状恰恰好好吻吻合合，而而且且负负责责催催化化反反应应的的残残基基也也正正好好接接近近将将发发生生反反应应的的基基团团或或键键。当当酶酶蛋蛋白白变变性性时时，构构象象发发生生变变化化，失失去去上上述述结结构构特特点点，同同时时也也失失去去了了活活性性。虽虽然然酶酶蛋蛋白白中中其其它它残残基基不不直直接接参参与与活活性性部部位位的的组组成成，但但这这些些残残基基中中的的大大多多数数为为整整个酶蛋白的构象作出了不可缺少的贡献。个酶蛋白的构象作出了不可缺少的贡献。研究酶活性部位的方法1.酶分子侧链基团的化学修饰法酶分子侧链基团的化学修饰法 （1）非特异性共价修饰）非特异性

4、共价修饰 （2）特异性共价修饰）特异性共价修饰 （3 3）亲和标记法）亲和标记法2.动力学参数测定法动力学参数测定法3.X射线晶体结构分析法射线晶体结构分析法4.定点突变法定点突变法酶分子侧链基团的化学修饰法 用用一一种种小小分分子子化化合合物物与与酶酶反反应应，这这种种化化合合物物与与酶酶的的某某个个或或某某种种残残基基侧侧链链反反应应，形形成成共共价价结结合合，这这叫叫化化学学修修饰饰（chemical modification）或或共共价价修修饰饰（covalent modification），这这种种化化合合物物称称为为修修饰饰剂剂。酶酶分分子子中中可可以以被被化化学学修修饰饰的的基基

5、团团有有：巯巯基基、羟羟基基、咪咪唑唑基基、氨氨基基、羧羧基基和和胍胍基基等等。当当酶酶活活性性部部位位的的残残基基侧侧链链被被修修饰饰后后，会会使使酶酶失失去去活活力力。将将经经修修饰饰后后失失去去活活力力的的酶酶水水解解，鉴鉴定定出出被被修修饰饰的的氨氨基基酸酸，可可以以得得到哪些残基参与组成活性部位的信息。到哪些残基参与组成活性部位的信息。非特异性共价修饰 此此类类修修饰饰剂剂可可以以修修饰饰活活性性部部位位内内或或外外的的残残基基侧侧链链基基团团。若若修修饰饰程程度度与与酶酶活活力力丧丧失失成成正正比比，则则说说明明被被修修饰饰的的基基团团位位于于活活性性部部位位。当当发发现现修修饰饰

6、程程度度与与酶酶活活力力丧丧失失成成正正比比时时，可可在在加加入入底底物物或或竞竞争争性性抑抑制制剂剂的的条条件件下下进进行行修修饰饰，若若加加入入底底物物或或竞竞争争性性抑抑制制剂剂可可阻阻遏遏修修饰饰剂剂对对酶酶活活力力的的破破坏坏作作用用，则则进一步证明被修饰的基团位于活性部位。进一步证明被修饰的基团位于活性部位。特异性共价修饰 此此类类修修饰饰剂剂特特异异性性地地修修饰饰酶酶活活性性部部位位的的残残基基，同同时时使使酶酶失失活活。此此类类修修饰饰剂剂与与酶酶的的活活性性部部位位特特异异性性结结合合，同同时时修修饰饰酶酶活活性性部部位位的的基基团团。例例如如二二异异丙丙基基氟氟磷磷酸酸（

7、DFP）能能特特异异性性地地与与许许多多酶酶的的活活性性部部位位的的Ser残残基基共共价价结结合合，使使酶酶活活力力丧丧失失，而而不不修修饰饰非非活活性性部部位位的的Ser残残基基。当当用用DFP修修饰饰酶酶后后，部部分分水水解解酶酶蛋蛋白白，得得到到含含有有二二异异丙丙基基磷磷酰酰基基的的肽肽段段，分分析析此此肽肽段段的的氨氨基基酸酸序序列列，可可得得到到活活性性部部位位Ser附附近近的肽链序列。的肽链序列。DFP修饰酶的Ser残基的反应 几种丝氨酸蛋白酶活性部位的氨基酸序列酶酶氨基酸序列氨基酸序列牛胰蛋白酶牛胰蛋白酶 Ser-Cys-Gly-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-

8、Val牛胰凝乳蛋白酶牛胰凝乳蛋白酶 Ser-Cys-Met-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu猪弹性蛋白酶猪弹性蛋白酶 Gly-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu猪凝血酶猪凝血酶Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro亲和标记法 能能特特异异性性地地修修饰饰酶酶的的活活性性部部位位的的修修饰饰剂剂很很少少，并并且且专专一一性性差差，经经常常出出现现也也修修饰饰活活性性部部位位之之外外的的残残基基的的情情况况。为为了了解解决决此此问问题题，人人们们合合成成了了一一些些底底物物类类似似物物，其其上上带带有

9、有高高反反应应性性基基团团，它它们们特特异异地地与与相相应应的的酶酶的的活活性性部部位位结结合合，然然后后与与活活性性部部位位的的残残基基反反应应，这这样样就就大大大大提提高高了了修修饰饰的的专专一一性性，这种方法叫亲和标记法。这种方法叫亲和标记法。TPCK对胰凝乳蛋白酶的亲和标记 最最典典型型的的例例子子就就是是用用来来修修饰饰胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶的的亲亲和和 标标 记记 物物 对对 甲甲 苯苯 磺磺 酰酰-L-苯苯 丙丙 氨氨 酰酰 氯氯 甲甲 基基 酮酮（TPCK），胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶的的人人工工底底物物是是对对甲甲苯苯磺磺酰酰-L-苯苯丙丙氨氨酸酸乙乙酯酯（TPE）。当当将将

10、TPDK与与胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶一一起起保保温温后后，酶酶失失去去活活性性，氨氨基基酸酸分分析析表表明明，TPDK修修饰饰了了His57。TPCK不不与与胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶原原、变变性性的的胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶、DIP-胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶反反应应。这这些证据说明些证据说明His57是组成酶活性部位的残基之一。是组成酶活性部位的残基之一。TPE和TPCK的结构亲和标记物亲和标记物人工底物人工底物动力学参数测定法 在不同在不同pH下测定酶活力，可以得到与酶下测定酶活力，可以得到与酶活力直接相关的可解离基团的活力直接相关的可解离基团的pKa值，从而推值，从而推测出是些什么残基。测

11、出是些什么残基。X射线晶体结构分析法 使使底底物物与与酶酶结结合合，制制成成晶晶体体，再再进进行行X光光晶体衍射分析，可得到底物附近有哪些残基。晶体衍射分析，可得到底物附近有哪些残基。定点突变法 从从基基因因的的水水平平上上对对蛋蛋白白质质编编码码序序列列中中特特定定位位点点的的核核苷苷酸酸进进行行突突变变，使使得得蛋蛋白白质质特特定定的的氨氨基基酸酸残残基基转转变变成成另另一一种种氨氨基基酸酸残残基基，观观察察突突变变对对酶酶活活力力的的影影响响。例例如如，1987年年Claik将将胰胰蛋蛋白白酶酶Asp102突突变变成成Asn102，突突变变的的胰胰蛋蛋白白酶酶的的kcat只只有有野野生生

12、型型酶酶的的五五千千分分之之一一，突突变变酶酶水水解解酯酯底底物物的的活活力力仅仅是是野野生生型型酶酶的的万分之一，可见万分之一，可见Asp102对胰蛋白酶的活力是必需的。对胰蛋白酶的活力是必需的。三、影响酶催化效率的有关因素 底物和酶的邻近效应与定向效应（proximity and orientation）对对于于双双底底物物反反应应或或三三底底物物反反应应来来说说，由由于于酶酶活活性性部部位位对对底底物物有有高高亲亲和和力力，增增加加了了参参与与反反应应的的底底物物碰碰撞撞的的几几率率，这这就就是是邻邻近近效效应应。在在酶酶活活性性部部位位，底底物物之之间间参参与与反反应应的的基基团团或或

13、键键靠靠近近，使使反反应应易于进行，这就是定向效应。易于进行，这就是定向效应。底物的形变和诱导契合 底底物物与与酶酶结结合合后后，发发生生构构象象变变化化，相相应应的的键变得对反应更敏感，降低了反应的活化能。键变得对反应更敏感，降低了反应的活化能。（distortion and induced-fit）酸碱催化 酶酶活活性性部部位位的的催催化化基基团团可可以以通通过过向向底底物物提提供供质质子子或或从从底底物物上上夺夺取取质质子子，而而催催化化反反应应。若若提提供供质质子子和和夺夺取取质质子子的的是是反反应应液液中中的的H+和和OH，称称为为专专一一酸酸碱碱催催化化或或狭狭义义酸酸碱碱催催化化

14、；若若提提供供质质子子和和夺夺取取质质子子的的是是酶酶活活性性部部位位的的残残基基，称称为为总总酸碱催化或广义酸碱催化。酸碱催化或广义酸碱催化。（acid-base catalysis）一些氨基酸残基的广义酸碱形式共价催化 共共价价催催化化分分为为亲亲电电催催化化和和亲亲核核催催化化两两种种类类型型。亲亲电电催催化化指指的的是是酶酶活活性性部部位位的的催催化化基基团团在在催催化化反反应应过过程程中中汲汲取取底底物物的的电电子子，产产生生底底物物与与酶酶共共价价结结合合的的过过渡渡态态中中间间物物；亲亲核核催催化化是是酶酶活活性性部部位位的的催催化化基基团团在在反反应应过过程程中中向向底底物物供

15、供给给电电子子，产产生生底底物物与与酶酶共共价价结合的过渡态中间物。结合的过渡态中间物。（covalent catalysis）金属离子催化 金金属属离离子子带带正正电电荷荷，它它可可以以稳稳定定底底物物过过渡渡态态中中间间物物中中的的负负电电荷荷，还还可可以以通通过过吸吸引引电电子子，造造成成电子畸变，使得反应容易进行。电子畸变，使得反应容易进行。（metal ion catalysis）活性部位微环境的影响在实际催化中，上述多种因素可以协调起作用。在实际催化中，上述多种因素可以协调起作用。多元催化和协同效应 活性部位是一个疏水环境，介电常数较低，活性部位是一个疏水环境，介电常数较低，带电基

16、团之间的作用力较强，有助于催化基团与带电基团之间的作用力较强，有助于催化基团与底物的作用。底物的作用。四、酶催化反应机制的实例 溶菌酶 溶溶菌菌酶酶能能够够水水解解细细菌菌细细胞胞壁壁的的多多糖糖，从从而而溶溶解解这这些些细细菌菌的的细细胞胞壁壁。细细胞胞壁壁多多糖糖是是N-乙乙酰酰氨氨基基葡葡糖糖（NAG）-N-乙乙酰酰氨氨基基葡葡糖糖乳乳酸酸（NAM）的的共共聚聚物物，其其中中的的NAG和和NAM通通过过1,4-糖苷键交替排列。糖苷键交替排列。（lysozyme）细菌细胞壁多糖溶菌酶的一级结构红箭头所红箭头所指为活性指为活性部位残基部位残基分子量为分子量为14.6103溶菌酶催化反应的特异

17、性 溶溶菌菌酶酶能能够够水水解解NAM的的C1与与NAG的的C4之之间间的的糖糖苷苷键键，但但不不能能水水解解NAG的的C1与与NAM的的C4之之间间的的糖糖苷苷键键。几几丁丁质质是是甲甲壳壳类类动动物物甲甲壳壳中中所所含含的的多多糖糖，仅仅由由NAG残残基基通通过过1,4-糖糖苷苷键键相相连连，溶溶菌酶也可以水解几丁质。菌酶也可以水解几丁质。溶菌酶催化水解的糖苷键溶菌酶的有效底物 酶酶的的活活性性部部位位有有一一条条沟沟，正正好好能能容容纳纳6个个多多糖糖残残基基形形成成的的链链。当当用用含含不不同同残残基基数数的的寡寡聚聚NAG作作实实验验，发发现现当当残残基基数数达达到到6个个时时就就可

18、可以以作作为为有有效的底物。效的底物。底物（浓度为底物（浓度为10 4 mol/L）相对水解速率相对水解速率(NAG)20(NAG)31(NAG)48(NAG)54000(NAG)630000(NAG)830000溶菌酶活性部位的催化位点 通通过过研研究究发发现现，若若将将6残残基基寡寡聚聚糖糖作作为为溶溶菌菌酶酶的的底底物物，将将这这6个个残残基基分分别别称称为为A，B，C，D，E和和F，则则水水解解发发生生在在D和和E之之间间的的糖糖苷苷键键上上。其其中中D糖糖的的吡吡喃喃环环因因空空间间构构象象的的原原因因，必必须须由由正正常常的的椅椅式式构构象象转转变变成成能能量量较较高高的的半半椅椅

19、式式构构象象，其其C1参参与与的的糖糖苷苷键键稳稳定定性性降降低低，易易于于断断裂。裂。吡喃糖环的椅式和船式构象溶菌酶底物的半椅式构象半椅式构象半椅式构象椅式构象椅式构象溶菌酶活性部位的催化位点糖苷键的断裂位点 在在H 218O中中反反应应，可可以以发发现现D糖糖的的C1上上含含有有18O，而而E糖糖的的C4羟羟基基只只含含普普通通O。由由此此可可知知这这个键断裂在个键断裂在D糖的糖的C1和糖苷键的和糖苷键的O之间。之间。溶菌酶的催化基团 分分析析D-E键键周周围围的的微微环环境境，最最活活泼泼的的基基团团是是Asp52和和Glu35，它它们们分分别别位位于于被被断断裂裂的的糖糖苷苷键键的的两

20、两侧侧。Asp52在在一一个个极极性性环环境境中中，而而Glu35位位于于非非极极性性区区。在在溶溶菌菌酶酶水水解解几几丁丁质质的的最最适适pH下下（pH5），Asp52的的侧侧链链羧羧基基为为解解离离状状态态COO，而而Glu的侧链羧基为质子化的的侧链羧基为质子化的COOH形式形式。溶菌酶的催化机制Glu35酸催化酸催化Asp52的的负负电电荷荷稳稳定定正正碳碳离离子子丝氨酸蛋白酶 丝丝氨氨酸酸蛋蛋白白酶酶是是一一个个蛋蛋白白酶酶家家族族，这这个个家家族族包包 括括 胰胰 蛋蛋 白白 酶酶（trypsin）、胰胰 凝凝 乳乳 蛋蛋 白白 酶酶（chymotrypsin）、弹弹性性蛋蛋白白酶酶

21、（elastase）、凝凝血血 酶酶（thrombin）、枯枯 草草 杆杆 菌菌 蛋蛋 白白 酶酶（subtilisin）、纤纤溶溶酶酶（plasmin）、组组织织纤纤溶溶酶酶原原激激活活剂剂（tissue plasminogen activator，tPA）等等。它它们们的的共共同同特特征征是是活活性性部部位位有有一一个个必必需需的的丝丝氨酸残基。氨酸残基。消化作用的丝氨酸蛋白酶 胰胰蛋蛋白白酶酶、胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶和和弹弹性性蛋蛋白白酶酶虽虽然然都都是是裂裂解解肽肽键键的的，但但它它们们的的专专一一性性明明显显不不同同。胰胰蛋蛋白白酶酶裂裂解解碱碱性性氨氨基基酸酸的的羧羧基基形形成成

22、的的肽肽键键，胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶裂裂解解芳芳香香氨氨基基酸酸的的羧羧基基形形成成的的肽肽键键，弹弹性性蛋蛋白白酶酶专专一一性性较较弱弱，它它主主要要裂裂解解小小的的中中性性氨氨基基酸酸的的羧羧基基侧侧肽肽键键。这这3种种蛋蛋白白酶酶有有相相似似的的一一级级结结构和三级结构。构和三级结构。三种消化蛋白酶的一级结构比较胰凝乳蛋白酶的三维结构 胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶分分子子是是一一个个紧紧密密的的椭椭球球体体，大大小小为为。多多数数芳芳香香和和疏疏水水残残基基包包埋埋在在蛋蛋白白质质内内部部，而而多多数数带带电电的的或或亲亲水水的的残残基基分分布布在在分分子子表表面面。3个个极极性性残残基基

23、His57、Asp102和和Ser195在在活活性性部部位位形形成成催催化化三三联联体体（catalytic triad）。这这三三个个残残基基在在胰胰蛋蛋白白酶酶和和弹弹性性蛋蛋白白酶酶中中也也存存在在，但但这这三三种种蛋蛋白白酶酶的的底底物物结结合合部部位位形形状状不不同同，导导致致它它们们裂裂解解不不同同氨氨基酸羧基侧的肽键。基酸羧基侧的肽键。胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶的底物结合口袋 Trypsin Chymotrypsin Elastase胰凝乳蛋白酶与eglin C的结合 蓝蓝色色带带状状物物为为eglin C (水水 蛭蛭 蛋蛋 白白酶抑制剂酶抑制剂)蓝色蓝色His57Hi

24、s57红色红色Asp102Asp102黄色黄色Ser195Ser195人工底物 对对一一些些底底物物是是大大分分子子聚聚合合物物的的酶酶，在在研研究究其其动动力力学学时时，一一般般使使用用小小分分子子的的人人工工底底物物。乙乙酸酸-p-硝硝基基苯苯酯酯是是一一种种特特别别有有用用的的模模式式底底物物，因因为为其其水水解解产产物物对对硝硝基基苯苯酚酚在在400nm有有强强的的光光吸吸收收，便于监测其变化。，便于监测其变化。研究胰凝乳蛋白酶的人工底物乙酰苯丙氨酸甲酯乙酰苯丙氨酸甲酯苯甲酰丙氨酸甲酯苯甲酰丙氨酸甲酯甲酰苯丙氨酸甲酯甲酰苯丙氨酸甲酯乙酸乙酸-p-硝基苯酯硝基苯酯胰凝乳蛋白酶催化机制的动

25、力学研究 当当大大量量胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶用用乙乙酸酸-p-硝硝基基苯苯酯酯为为底底物物进进行行动动力力学学研研究究时时，反反应应分分两两个个不不同同的的阶阶段段，反反应应开开始始时时以以突突发发的的速速率率生生成成p-硝硝基基苯苯酚酚，随随后后出出现现一一个个较较慢慢的的稳稳态态速速率率。这这是是因因为为反反应应的的第第一一步步是是底底物物与与酶酶结结合合后后，反反应应释释放放出出p-硝硝基基苯苯酚酚，另另一一个个产产物物乙乙酸酸以以乙乙酰酰基基的的形形式式结结合合在在酶酶活活性性部部位位的的Ser195上上。第第二二步步是是水水分分子子攻攻击击乙乙酰酰酶酶复复合合物物，释释放放出出乙乙

26、酸酸根根离离子子。第第二步较缓慢，是限速步骤。二步较缓慢，是限速步骤。胰凝乳蛋白酶同底物反应的动力学曲线 酰基酶中间物的迅速形成后缓慢释放产物胰凝乳蛋白酶的催化三联体 胰凝乳蛋白酶中催化三联体的作用 在在没没有有底底物物时时，His57是是未未质质子子化化的的，当当Ser195羟羟基基氧氧原原子子对对底底物物进进行行亲亲核核攻攻击击时时，His57从从Ser195接接受受一一个个质质子子。Asp102的的COO的的作作用用是是稳稳定定过过渡渡态态中中His57的的正正电电荷荷形形式式。此此外外，Asp定定向向His57，保保证证从从Ser195接接受受一一个个质质子子后后的的His57处处于于

27、适适当当的的互互变变异构形式异构形式。His57的互变异构胰凝乳蛋白酶的催化机制胰凝乳蛋白酶的催化机制五、酶活性的调节控制别构调控（allosteric regulation）酶酶分分子子的的非非催催化化部部位位与与某某些些化化合合物物可可逆逆地地非非共共价价结结合合后后,酶酶发发生生构构象象改改变变，进进而而改改变变酶酶活活性性状状态态，称称为为酶酶的的别别构构调调节节。具具有有这这种种调调节节作作用用的的酶酶称称为为别别构构酶酶（allosteric enzyme）。凡凡能能使使酶酶分分子子发发生生别别构构作作用用的的物物质质称称为为效效应应剂剂或或别别构构剂剂，能能增增加加酶酶活活性性的

28、的别别构构剂剂为别构激活剂，能抑制酶活性的别构剂为别构抑制剂。为别构激活剂，能抑制酶活性的别构剂为别构抑制剂。天冬氨酸转氨甲酰酶（aspartate transcarbamylase，ATCase）ATCase是是嘧嘧啶啶生生物物合合成成途途径径的的第第一一个个酶酶，底底物物对对酶酶的的结结合合有有正正协协同同性性。该该反反应应途途径径的的终终产产物物CTP是是ATCase的的反反馈馈抑抑制制剂剂，抑抑制制程程度度可可达达90%，这这种种抑抑制制是是降降低低酶酶对对底底物物的的亲亲和和力力，但但不不影影响响最最大大反反应应速速度度。而而ATP是是ATCase的的激激活活剂剂，可可增增加酶对底物

29、的亲和力，也不影响最大反应速度。加酶对底物的亲和力，也不影响最大反应速度。ATCase催化的反应式ATP和和CTP对ATCase活性的影响曲线ATP可可 阻阻遏遏CTP的的抑抑制制作作用用，它它们们竞竞争争同同一一结结合合位点。位点。脱敏反应 ATCase由由催催化化亚亚基基（catalytic subunit）和和调调节节亚亚基基（regulatory subunit）组组成成。当当用用汞汞化化物物处处理理该该酶酶时时，则则ATCase失失去去调调节节活活性性。用用汞汞化化物物处处理理过过的的ATCase，ATP和和CTP不不再再影影响响其其催催化化活活性性，而而且且底底物物结结合合变变为为

30、无无协协同同性性。但但并不影响酶的最大反应速率。并不影响酶的最大反应速率。p-羟汞苯甲酸对巯基的修饰ATCase的亚基分离 当当用用汞汞化化物物p-羟羟汞汞苯苯甲甲酸酸处处理理ATCase时时，p-羟羟汞汞苯苯甲甲酸酸与与巯巯基基反反应应，使使酶酶失失去去了了受受ATP或或CTP调调节节的的能能力力。利利用用超超离离心心分分析析，天天然然酶酶的的沉沉降降系系数数为为，分分子子量量为为310103，而而受受p-羟羟汞汞苯苯甲甲酸酸处处理理后后的的酶酶出出现现两两条条带带，一一个个是是，分分子子量量34103，另另一一个个是是，分分子子量量100103。这这是是两两种种不不同同的的亚亚基基，这这两

31、两种种亚亚基基也也可可以以利利用用离离子子交交换换层层析析或或蔗蔗糖糖密度梯度离心分开。密度梯度离心分开。ATCase的沉降速率模式天然天然 ATCase通过汞化物解离成调节通过汞化物解离成调节亚基和催化亚基的酶亚基和催化亚基的酶ATCase的亚基组成 大大的的亚亚基基叫叫催催化化亚亚基基，单单独独的的大大亚亚基基有有催催化化反反应应的的能能力力，但但不不与与ATP或或CTP结结合合。小小亚亚基基叫叫调调节节亚亚基基，单单独独的的小小亚亚基基可可以以与与ATP或或CTP结结合合，但但无无催催化化能能力力。催催化化亚亚基基（c3）含含3条条c链链，每每条条链链的的分分子子量量为为34103，所所

32、以以催催化化亚亚基基的的分分子子量量是是102103；调调节节亚亚基基（r2）含含2条条r链链，每每条条链链的的分分子子量量为为17103，所所以以调调节节亚亚基基的的分分子子量量是是34103。全全酶酶含含有有2个个催催化化亚亚基基和和3个个调调节节亚亚基基，记记为为c6r6，即即2c33 r2 c6 r6。ATCase是别构酶的模式对象 用用过过量量的的巯巯基基乙乙醇醇可可除除去去汞汞苯苯甲甲酸酸基基。将将除除去去汞汞苯苯甲甲酸酸基基的的催催化化亚亚基基和和调调节节亚亚基基混混合合，可可重重组组得得到到天天然然酶酶。因因ATCase的的催催化化亚亚基基和和调调节节亚亚基基容容易易分分开开，

33、又又容容易易重重组组，所所以以它它成成为为研研究究别别构构酶酶的模式对象。的模式对象。ATCase的三维结构 利利用用X光光衍衍射射，得得出出了了ATCase的的三三维维结结构构。通通过过使使酶酶与与竞竞争争性性抑抑制制剂剂N-（膦膦乙乙酰酰基基）-L-天天冬冬氨氨酸酸（PALA）结结合合，找找到到了了底底物物的的结结合合位位点点，它它位位于于两两条条催催化化链链的的界界面面处处，由由两两条条c链链的的残残基基共共同同组组成成。每每条条r链链分分两两个个结结构构域域，外外侧侧的的结结构构域域是是CTP的的结结合合位位点点，里里侧侧的的结结构构域域与与催催化化亚亚基基相相互互作作用用。每每条条c

34、链链也也分分为为两两个个结结构构域域，N端端为为氨氨甲甲酰酰磷磷酸酸结结合合结构域，结构域，C端为天冬氨酸结合结构域。端为天冬氨酸结合结构域。ATCase的亚基结合方式rrccATCase的亚基结合方式ATCase半分子的三维结构ATCase的过渡态底物及竞争性抑制剂PALA结合在ATCase催化部位上的方式由邻近由邻近C链提供链提供酶与底物结合后的构象变化 底底物物与与酶酶结结合合后后，导导致致酶酶的的沉沉降降系系数数降降低低3%，说说明明酶酶与与底底物物结结合合后后膨膨胀胀了了。伴伴随随着着酶酶与与PALA的的结结合合，酶酶的的四四级级结结构构发发生生了了大大的的变变化化，两两个个催催化化

35、三三聚聚体体分分开开了了，并并转转动动了了10。此此外外，每每一一调调节节亚亚基基也也绕绕其其对对称称轴轴旋旋转转了了15。c链链上上的的两两个个底底物物结结合合结结构构域域靠靠近近了了，酶酶由由T型型变变成成了了R型。型。酶与底物结合后的构象变化硝基甲烷修饰ATCase 酶酶与与硝硝基基甲甲烷烷反反应应，在在酶酶的的每每个个催催化化链链中中生生成成一一种种有有颜颜色色的的硝硝基基酪酪氨氨酸酸残残基基（max=430nm），在在每每个个催催化化链链上上一一个个必必需需的的Lys也也被被修修饰饰，这这样样就就人人工工引引进进了了报报告告基基团团。这这种种被被修修饰饰的催化亚基不能与底物结合。的催

36、化亚基不能与底物结合。底物结合到ATCase上引起高度协同的别构转变 用用被被修修饰饰的的催催化化亚亚基基与与正正常常的的催催化化亚亚基基及及正正常常的的调调节节亚亚基基重重组组成成全全酶酶（杂杂交交酶酶），当当加加入入天天冬冬氨氨酸酸的的类类似似物物琥琥珀珀酸酸时时，琥琥珀珀酸酸结结合合到到正正常常的的催催化化亚亚基基上上，改改变变了了被被修修饰饰催催化化亚亚基基上上硝硝基基酪酪氨氨酸酸的的吸吸收收光光谱谱。说说明明一一个个催催化化亚亚基基与与底底物物结结合合能能引起另一个催化亚基构象发生变化。引起另一个催化亚基构象发生变化。琥珀酸与杂交酶结合后硝基Tyr吸收光谱的变化标记三聚体标记三聚体天

37、然三聚体天然三聚体NT：硝基酪氨酸：硝基酪氨酸 S：底物：底物别构剂对酶构象的影响 给给杂杂交交酶酶加加ATP，硝硝基基酪酪氨氨酸酸430nm的的光光吸吸收收增增加加，与与加加琥琥珀珀酸酸情情况况相相同同；而而给给杂杂交交酶酶加加CTP，430nm的的光光吸吸收收减减少少。此此实实验验说说明明别别构构激激活活剂剂和和别别构构抑抑制制剂剂都都能能引引起起构构象象变变化化，但但变变化化的的结结果果不不同同。ATP的的结结合合使使酶酶的的构构象象平平衡衡向向R型型转转变，而变，而CTP的结合使酶的构象平衡向的结合使酶的构象平衡向T型转变。型转变。ATP和CTP与酶结合后酶的构象及硝基Tyr吸收光谱的

38、变化标记三聚体标记三聚体标记三聚体标记三聚体酶原的激活 有有些些酶酶在在刚刚合合成成出出来来时时没没有有活活性性，称称为为酶酶原原（zymogen或或proenzyme）。酶酶原原经经蛋蛋白白水水解解酶酶在在特特定定位位点点切切割割后后，产产生生有有活活性性的的酶酶，这这种种方方式式称称为为酶酶原原的的激激活活。有有一一些些不不是是酶酶的的蛋蛋白白质质，也也需需要要经经特特定定的的蛋蛋白白酶酶水水解解才才有有功功能能，这这些些蛋蛋白白质质在在没有活化之前称为前体（没有活化之前称为前体（precursor）。）。酶原或蛋白质前体激活举例使使蛋蛋白白质质水水解解的的消消化化酶酶，在在胃胃和和胰胰脏

39、脏中中刚刚合合成成时时是是以以酶酶原原的的形形式式存存在在，分分泌泌到到肠肠胃胃中中被被切切割割后后才才成成为为有有活性的酶。活性的酶。血血液液凝凝固固系系统统中中许许多多酶酶都都是是以以酶酶原原的的形形式式存存在在，到到需要血液凝固时才被激活。需要血液凝固时才被激活。胰胰岛岛素素刚刚合合成成出出来来是是前前胰胰岛岛素素原原（preproinsulin），经蛋白酶切割后成为有活性的胰岛素。经蛋白酶切割后成为有活性的胰岛素。不溶性的胶原，是由可溶性的前胶原激活而成的。不溶性的胶原，是由可溶性的前胶原激活而成的。在在需需要要时时，前前胶胶原原酶酶转转变变成成活活性性的的胶胶原原酶酶，降降解解胶胶原

40、。如蝌蚪尾巴的消失。原。如蝌蚪尾巴的消失。胰凝乳蛋白酶原的激活 胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶原原是是胰胰腺腺分分泌泌的的、由由245个个氨氨基基酸酸残残基基组组成成的的单单链链肽肽，有有5对对二二硫硫键键。经经胰胰蛋蛋白白酶酶作作用用，Arg15与与Ile16之之间间的的肽肽键键断断裂裂，才才具具有有酶酶活活性性，这这种种酶酶称称为为胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶。型型酶酶活活性性最最高高，但但不不稳稳定定，它它再再作作用用于于其其它它型型酶酶分分子子上上，使使之之失失去去两两个个二二肽肽（Ser14-Arg15和和Thr147-Asn148）后后成成为为稳稳定定形形式式胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶。型型酶

41、酶有有3条条肽肽链链，A链链和和B链链之之间间以及以及B链和链和C链之间各有一对二硫键连接。链之间各有一对二硫键连接。胰凝乳蛋白酶原的激活胃蛋白酶原的激活 胃胃蛋蛋白白酶酶原原是是由由胃胃壁壁细细胞胞分分泌泌的的，分分子子量量为为38.9103，由由392个个氨氨基基酸酸残残基基组组成成。在在胃胃酸酸H+的的作作用用下下，低低于于pH5时时，酶酶原原自自动动激激活活，从从氨氨基基端端失失去去44个个氨氨基基酸酸残残基基的的碱碱性性片片段段，成成为为有有活活性性的的胃胃蛋蛋白白酶酶。胃胃蛋蛋白白酶酶的的最最适适反反应应pH为为2，其其活活性性部部位位含含有有2个个天天冬冬氨氨酸酸残残基基，一一个

42、个处处于于解解离离状状态态，一一个个处处于于质质子子化化状状态态。酶酶原原碱碱性性片片段段中中的的Lys与与活活性性部部位位的的天天冬冬氨氨酸酸残残基基有有静静电电相相互互作作用用，使使酶酶不不能能表表现现出出活活性性。去去除除碱碱性性片片段段后后，暴暴露露出出催催化化基基团团，酶酶才才表表现现出出活活性性。胃胃蛋蛋白白酶酶还还可可以以催催化化其其它它胃胃蛋蛋白酶原分子活化。白酶原分子活化。胰蛋白酶原的激活 胰胰蛋蛋白白酶酶原原由由胰胰脏脏分分泌泌，进进入入小小肠肠后后，在在有有Ca2+的的环环境境中中受受到到肠肠激激酶酶的的激激活活，Lys6Ile7之之间间的的肽肽键键被被裂裂解解，从从氨氨

43、基基端端去去除除一一个个6肽肽，成成为为有有活活性性的的胰胰蛋蛋白白酶酶。活活性性的的胰胰蛋蛋白白酶酶还还可可以以激激活活其其它它胰胰蛋蛋白白酶酶原原、胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶原原、弹弹性性蛋蛋白白酶酶原原及及羧肽酶原等。羧肽酶原等。胰蛋白酶原的激活 胰蛋白酶对各种胰脏蛋白酶原的激活作用生理止血过程 生生理理止止血血过过程程包包括括三三部部分分功功能能活活动动。首首先先是是小小血血管管受受伤伤后后立立即即收收缩缩，若若破破损损不不大大即即可可使使血血管管封封闭闭。其其次次，更更重重要要的的是是血血管管内内膜膜损损伤伤，内内膜膜下下组组织织暴暴露露，可可以以激激活活血血小小板板和和血血浆浆中中的

44、的凝凝血血系系统统；由由于于血血管管收收缩缩使使血血流流暂暂停停或或减减缓缓，有有利利于于激激活活的的血血小小板板粘粘附附于于内内膜膜下下组组织织并并聚聚集集成团，成为一个松软的止血栓以堵塞伤口。成团，成为一个松软的止血栓以堵塞伤口。生理止血过程 接接着着，在在局局部部又又迅迅速速出出现现血血凝凝块块，即即血血浆浆中中可可溶溶的的纤纤维维蛋蛋白白原原转转变变成成不不溶溶的的纤纤维维蛋蛋白白分分子子多多聚聚体体，并并形形成成了了由由血血纤纤维维与与血血小小板板一一道道构构成成的的牢牢固固的的止止血血栓栓，有有效效地地制制止止了了出出血血。与与此此同同时时，血血浆浆中中也也出出现现了了生生理理的的

45、抗抗凝凝血血活活动动与与纤纤维维蛋蛋白白溶溶解解活活性性，以以防防止止血血凝凝块块不不断断增增大大和和凝凝血血过过程程漫漫延延到到这这一一局局部部以以外外。显显然然，生生理理止止血血主主要要由由血血小小板板和和某某些些血血浆浆成成分分共共同同完成。完成。凝血机制凝血因子（blood clotting factors）编号同义名因子因子纤维蛋白原（纤维蛋白原（fibrinogen）因子因子 凝血酶原凝血酶原(prothrombin)因子因子 组织凝血激素组织凝血激素(tissue thromboplastin)因子因子 Ca2+因子因子前加速素前加速素(proaccelerin)因子因子 前转变

46、素前转变素(proconvertin)因子因子 抗血友病因子抗血友病因子(antihemophilic factor,AHF)因子因子 血浆凝血激酶血浆凝血激酶(plasma thromboplastin component,PTC)因子因子 Stuart-Prower因子因子 因子因子 血浆凝血激酶前质血浆凝血激酶前质(plasma thromboplastin antecedent,PTA)因子因子接触因子接触因子(contact factor)因子因子 纤维蛋白稳定因子纤维蛋白稳定因子(fibrin-stabilizing factor)因子X激活的两种途径 因因子子（Stuart-Pr

47、ower因因子子）的的激激活活可可以以通通过过两两种种途途径径。如如果果只只是是损损伤伤血血管管内内膜膜或或抽抽出出血血液液置置于于玻玻璃璃管管内内，完完全全依依靠靠血血浆浆内内的的凝凝血血因因子子逐逐步步使使因因子子激激活活从从而而发发生生凝凝血血的的，称称为为内内源源性性激激活活途途径径（intrinsic route）；如如果果是是依依靠靠血血管管外外组组织织释释放放的的因因子子（组组织织凝凝血血激激素素）来来参参与与因因子子的的激激活活的的，称称为为外外源源性性激激活活途途径径（extrinxic route），如创伤出血后发生凝血的情况。如创伤出血后发生凝血的情况。内源性途径 从从因

48、因子子（接接触触因因子子）的的激激活活开开始始。血血管管内内膜膜下下组组织织，特特别别是是胶胶原原纤纤维维，与与因因子子接接触触，可可使使因因子子激激活活成成a。a可可激激活活激激肽肽释释放放酶酶原原使使之之成成为为激激肽肽释释放放酶酶；后后者者反反过过来来又又能能激激活活因因子子，这这是是一一种种正正反反馈馈，可可使使因因子子a大大量量生生成。成。a又激活因子又激活因子成为成为a。外源性途径 由由因因子子与与因因子子组组成成复复合合物物，在在有有Ca2+存存在在的的情情况况下下，激激活活因因子子生生成成a。因因子子，原原名名组组织织凝凝血血激激酶酶，广广泛泛存存在在于于血血管管外外组组织织中

49、中，但但在在脑脑、肺肺和和胎胎盘盘组组织织中中特特别别丰丰富富。因因子子为为磷磷脂脂蛋蛋白白质质。Ca2+的的作作用用就就是是将将因因子子与与因因子子都都结结合合于于因因子子所所提提供供的的磷磷脂脂上上，以以便便因因子子催催化化因因子子的有限水解，形成的有限水解，形成a。可逆的共价修饰 有有一一些些酶酶属属于于共共价价调调节节酶酶（covalently modulated enzyme），通通过过其其它它酶酶对对它它进进行行可可逆逆的的共共价价修修饰饰而而在在活活性性与与非非活活性性之之间间互互变变。这这种种酶酶常常是是一一些些对对代代谢谢流流量量起起调调节节作作用用的的关关键键酶酶，或或是是

50、需需要要迅迅速速产产生生酶酶活活性性的的酶酶，并且可以级联放大，对输入的信息产生迅速的反应。并且可以级联放大，对输入的信息产生迅速的反应。有有些些酶酶以以修修饰饰状状态态为为活活性性形形式式，有有些些酶酶以以脱脱修修饰饰状态为活性形式。状态为活性形式。酶修饰反应的例子Tyr、Ser、Thr、HisTyrTyr酶修饰反应的例子GluArg、Gln、Cys、白白喉喉酰酰胺胺（一一种种修修饰的饰的His）蛋白质的磷酸化 蛋蛋白白质质磷磷酸酸化化是是最最主主要要的的共共价价修修饰饰方方式式。通通过过蛋蛋白白激激酶酶的的催催化化作作用用消消耗耗NTP使使共共价价调调节节酶酶磷磷酸酸化化，磷磷酸酸化化的的