质粒DNA的提取、酶切及检测.ppt

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1、质粒质粒DNA的提取、酶切及检测的提取、酶切及检测相关知识相关知识n基因工程又称基因工程又称DNADNA重组技术重组技术外源基因通过体外重组后，导入受体细胞内，外源基因通过体外重组后，导入受体细胞内，使这个基因能够在受体细胞内复制、转录、翻使这个基因能够在受体细胞内复制、转录、翻译、表达的操作译、表达的操作n包包括括基基因因的的分分离离、重重组组、转转移移、基基因因在在受受体体细细胞内的保持、转录、翻译表达等全过程胞内的保持、转录、翻译表达等全过程n基基因因工工程程四四要要素素：目目的的基基因因、工工具具酶酶、载载体体、受体细胞受体细胞 常用到的工具酶常用到的工具酶n限制性内切酶限制性内切酶n

2、连接酶连接酶n聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶nDNADNA酶和酶和RNARNA酶酶结构的三大要素：结构的三大要素：多克隆位点多克隆位点 选择标记（耐药性）选择标记（耐药性）独立的复制单位独立的复制单位种类：种类：质粒质粒 噬菌体噬菌体 酵母人工染色体酵母人工染色体（YACYAC）载载 体体质粒质粒（plasmid）n是染色体外小型（是染色体外小型（1-2001-200kbkb）的的共价、闭合、共价、闭合、环状的双链环状的双链DNADNA分子（分子（cccDNAcccDNA），），能自主复制能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。并能稳定遗传的遗传因子。n常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基常常编

3、码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等酶、修饰酶等 n质粒的复制：严紧型复制（质粒的复制：严紧型复制（1 1 n n个个）松弛型复制（松弛型复制（2020个以上）个以上）实验目的和要求实验目的和要求 学习和掌握质粒提取的原理与操作、学习和掌握质粒提取的原理与操作、限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法，并理解限制性凝胶电泳的操作方法，并理解限制性内切酶是内切酶是DNA重组技术的关键工具，重组技术的关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定DNA片段

4、片段的有效方法。的有效方法。第一部分质粒第一部分质粒DNA的提取的提取碱裂解法碱裂解法一、实验目的一、实验目的n 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的原通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的原理与操作。理与操作。二、实验原理二、实验原理 n在在EDTA存在的条件下，经过存在的条件下，经过NaOH和阴离子去和阴离子去污剂污剂SDS处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体充处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体充分的裂解。分的裂解。n此时，细菌染色体此时，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞膜碎片缠绕附着在细胞膜碎片上，离心时易被沉淀出来。上，离心时易被沉淀出来。n而质粒而质粒DNA则留在上清液内，其中还含有蛋白则

5、留在上清液内，其中还含有蛋白质，实验中加入碱性酚（）和氯仿混合液的抽提质，实验中加入碱性酚（）和氯仿混合液的抽提可以除去蛋白质。可以除去蛋白质。n含有质粒含有质粒DNA的上清液用乙醇沉淀，获得质粒的上清液用乙醇沉淀，获得质粒DNA。三、主要试剂三、主要试剂溶液溶液I，50 mM葡萄糖葡萄糖/25 mM Tris-Cl/10 mM EDTA，；，；Tris-Cl控制溶液的控制溶液的pH，葡萄糖使悬浮后的，葡萄糖使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。EDTA是是Ca2+和和Mg2+等二价金属离子等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学的螯合剂，配在分子生物学试

6、剂试剂中的主要中的主要作用是：抑制作用是：抑制DNase的活性，的活性，溶液II，0.2 N NaOH/1%SDS；nNaOH是最佳的溶解细胞的是最佳的溶解细胞的试剂试剂，这是，这是由于细胞膜发生了从双层膜结构向微囊由于细胞膜发生了从双层膜结构向微囊结构的相变化所导致。结构的相变化所导致。SDS是为下一步是为下一步操作做的铺垫。操作做的铺垫。溶液III，3 M醋酸钾/2 M醋酸。n钾离子置换了钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不中的纳离子形成了不溶性的溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。钾钠离子置换所产生的大量沉更完全。钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部

7、分蛋白质沉淀了，大淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，大肠杆菌的基因组肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀。也一起被共沉淀。因为基因组因为基因组DNA太长了。太长了。n醋酸中和醋酸中和NaOH，因为长时间的碱性条，因为长时间的碱性条件会打断件会打断DNA。平衡酚：氯仿（平衡酚：氯仿（1 1：1 1）作用：作用：酚使蛋白质的变性，但是水饱和酚酚使蛋白质的变性，但是水饱和酚的比重略比水重，不利于含质粒的水相的的比重略比水重，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收氯仿始终在下层，方便水相的回收。乙醇：除去乙醇：除去D

8、NADNA水化层，使水化层，使DNADNA沉淀沉淀TETE缓冲液：溶解缓冲液：溶解DNADNA四、实验步骤四、实验步骤接含接含PUC18(PUC18(或或pET21a)pET21a)质粒的单菌落于质粒的单菌落于3 3ml LB Ampml LB Amp+液体培养基中液体培养基中37370 0C C，190rpm190rpm振荡培养过夜振荡培养过夜取菌液入取菌液入ml的的dorf管中管中 12000rpm12000rpm、离心离心2 2s s，弃上清，收集菌体弃上清，收集菌体100100uLuL溶液溶液I I悬浮菌体（悬浮菌体（充分振荡充分振荡），室温（或冰浴），室温（或冰浴）3min3min加

9、入加入200200uLuL溶液溶液IIII（轻轻混匀轻轻混匀），冰上静置），冰上静置3min3min裂解菌体裂解菌体加入加入150150uLuL溶液溶液IIIIII（轻轻混匀轻轻混匀），冰上静置），冰上静置5 5minmin质粒质粒DNADNA复性复性1200012000rpmrpm，离心离心5 5minmin，取上清记录体积到一新管取上清记录体积到一新管上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀振荡混匀）1200012000rpmrpm，离心离心1515minmin，取上清记录体积到一新管取上清记录体积到一新管（可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（可省略）上清加

10、等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀振荡混匀）1200012000rpmrpm，离心离心2min2min，取上清记录体积到一新管取上清记录体积到一新管上清加上清加2 2倍体积的无水乙醇（倍体积的无水乙醇（充分混匀充分混匀），室温），室温2min2min1200012000rpmrpm，离心离心5 5minmin沉淀用沉淀用7 70%0%乙醇乙醇1 1mLmL洗涤两次（洗涤两次（振荡混匀、离心振荡混匀、离心）1200012000rpmrpm，离心离心2min2min沉淀风干沉淀风干沉淀用沉淀用2020uL TEuL TE溶解，溶解，-20-200 0C C保存保存第二部分第二部分 质粒酶切质粒酶切实验

11、目的实验目的n理解限制性内切酶是理解限制性内切酶是DNA重组技术的关重组技术的关键工具键工具n掌握酶切的基本操作掌握酶切的基本操作实验原理实验原理n制性内切酶将质粒和外源基因用限制性内切酶制性内切酶将质粒和外源基因用限制性内切酶酶切，再经过酶切，再经过DNA连接酶连接，便可获得携带连接酶连接，便可获得携带外源基因的重组质粒，重组质粒可以转移到另外源基因的重组质粒，重组质粒可以转移到另一个生物细胞中去，进而复制、转录和表达外一个生物细胞中去，进而复制、转录和表达外源基因产物。限制性内切酶是能识别双链源基因产物。限制性内切酶是能识别双链 DNA 分子中的特定碱基顺序，并以内切方式分子中的特定碱基顺

12、序，并以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键的核酸水解酶。水解核酸中的磷酸二酯键的核酸水解酶。nEcoR和和Hind的识别序列和切口是：的识别序列和切口是：EcoR:GAATTC;Hind:AAGCTT。G，A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。切口。限制性核酸内切酶的命名法限制性核酸内切酶的命名法v用用属属名名的的头头一一个个字字母母和和种种名名的的头头两两个个字字母母表表示示寄寄主主菌菌的的物物种种名名称称，如如E.coli 用用Eco表表示，所以用斜体字。示，所以用斜体字。v用用一一个个字字母母代代表表菌菌株株或或型型，如如流流感感嗜嗜血血菌菌Rd菌株

13、用菌株用d，即，即Hind。v如如果果一一种种特特殊殊的的寄寄主主菌菌株株，具具有有几几个个不不同同的的限限制制与与修修饰饰体体，则则以以罗罗马马数数字字表表示示，如如Hind,Hind，Hind等。等。IIII型型限限制制性性内内切切酶酶能能识识别别专专一一的的核核苷苷酸酸顺顺序序，并并在在该该顺顺序序内内的的固固定定位位置置上上切切割割双双链链。由由于于这这类类限限制制性性内内切切酶酶的的识识别别和和切切割割的的核核苷苷酸酸都都是是专专一一的的。因因此此，这这种种限限制制性性内内切切酶酶是是DNADNA重重组组技技术术中中最最常常用用的的工工具具酶酶之之一一。这这种种酶酶识识别别的的专专一

14、一核核苷苷酸酸顺顺序序最最常常见见的的是是4 4个个或或6 6个个核核苷苷酸酸，少少数数也也有有识识别别5 5个个核核苷苷酸酸以以及及7 7个个、8 8个个、9 9个个、1010个个和和1111个个核核苷苷酸酸的的。II II 型型限限制制性性内内切切酶酶的的识识别别顺顺序序是是一一个个回回文文对对称称顺顺序序，即即有有一一个个中中心心对对称称轴轴，从从这这个个轴轴朝朝二二个个方方向向“读读”都都完完全全相相同同。这这种种酶酶的的切切割割可可以以有有两两种方式：种方式：粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢

15、键，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。所以称为粘性末端。如如EcoRIEcoRI的识别顺序为：的识别顺序为：5 5 G GAA|TT_C AA|TT_C 3 3 3 3 C_TT|AA C_TT|AAG G 5 5垂垂直直线线表表示示中中心心对对称称轴轴，从从两两侧侧“读读”核核苷苷酸酸顺顺序序都都是是GAATTCGAATTC或或CTTAAGCTTAAG，这这就就是是回回文文顺顺序序（palindromepalindrome）。_ _和和表表示示在在双双链链上上交交错错切切割割的的位位置置，切切割割后后生生成成5 5G G和和AATTCAATTC3 3、3 3CTTA

16、ACTTAA和和G G5 5二二个个DNADNA片片段段，各各有有一一个个单单链链末末端端，二二条条单单链链是是互互补补的的，其其断断裂裂的的磷磷酸酸二二酯酯键以及氢键可通过键以及氢键可通过DNADNA连接酶的作用而连接酶的作用而“粘合粘合”。IIII型酶切割方式的另一种是在同一位置型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV EcoRV 的识别位置是：的识别位置是：5 5 GAT GAT|ATC|ATC 3 33 3 CTA CTA|TAG|TAG 5 5 切割后形成切割后形成5 5 GAT GAT和和ATC ATC 3 3、3 3

17、CTA CTA和和TAG TAG 5 5。这种末端。这种末端同样可以通过同样可以通过DNADNA连接酶连接起来。连接酶连接起来。平头末端：平头末端：影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素(1)DNA的纯度；的纯度；(2)酶切消化反应的温度；酶切消化反应的温度；(3)溶液中离子浓度及种类；溶液中离子浓度及种类；(4)缓冲液的缓冲液的 pH值。值。三、实验操作三、实验操作n加样时，严格操作，做到准确无误。该项操作环节加样时，严格操作，做到准确无误。该项操作环节是整个实验的关键之一。是整个实验的关键之一。n质粒量质粒量（l l）缓冲液缓冲液(l)*(l)*EcoREcoR1 1

18、（ll）Hind（ll）H H2 2O O(l)(l)总体积总体积（ll）I I8 82 20 00 010102020IIII8 82 21 10 09 92020IIIIII8 82 20 01 19 92020置于置于37水浴酶解水浴酶解1小时。小时。第三部分琼脂糖凝胶电泳第三部分琼脂糖凝胶电泳相关知识相关知识琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，透明无紫外吸收性物质，不带电荷，透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。行平板电泳。核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系核酸分

19、子大小与琼脂糖浓度的关系琼脂糖浓度琼脂糖浓度 0.3 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0线状线状DNA大小大小/kb5-600.8-100.5-70.4-60.2-40.1-3核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 n不同构型不同构型DNADNA的移动速度次序为：共价闭环超的移动速度次序为：共价闭环超螺旋螺旋DNADNA（cccDNAcccDNA）直线直线DNADNA（LDNALDNA，2 2条链条链发生断裂）开环的双链环状发生断裂）开环的双链环状DNADNA（ocDNAocDNA，1 1条链发生断裂）条链发生断裂）。影响迁移率的因素影响迁移率的因素nDNAD

20、NA分分子子的的大大小小、琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶的的浓浓度度、DNADNA的的构构象象、所所加加电电压压 一一般般5 5V/cmV/cm、电电场场方方向向、嵌嵌入入染染料料的的存存在在、电电泳泳缓缓冲冲液液的组成。的组成。常用染料常用染料nEB:EB:溴溴化化乙乙锭锭，能能插插入入DNADNA分分子子碱碱基基对对之之间间。DNADNA吸吸收收的的260260nmnm的的紫紫外外光光传传递递给给EBEB，或或者者结结合合的的EBEB本身在本身在300300和和360360吸收的射线，呈橙红色。吸收的射线，呈橙红色。nEBEB染染料料优优点点：染染色色操操作作简简便便，快快速速；灵灵敏敏度度高高；可

21、以加到样品中或胶中。可以加到样品中或胶中。nEBEB是是诱诱变变剂剂，使使用用时时一一定定要要戴戴手手套套。EBEB废废液液要要经过处理才能丢弃。经过处理才能丢弃。nGoldView GoldView I I是是一一种种可可代代替替溴溴化化乙乙锭锭（EBEB）的的新新型型核核酸酸染染料料，与与核核酸酸结结合合后后能能产产生生很很强强的的荧荧光光信信号号，在紫外透射光下双链在紫外透射光下双链DNADNA呈现绿色荧光。呈现绿色荧光。一、实验目的一、实验目的n通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNADNA的方法和技术。的方法和技术。二、实验原理二、实验原理 n核酸核酸p

22、H8pH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。带负电。相同碱基数量的双链相同碱基数量的双链DNADNA几乎具有等几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。不同分子量的动。不同分子量的DNADNA片段泳动速度不一样，片段泳动速度不一样，可进行分离。可以近似用于估算分子的大小。可进行分离。可以近似用于估算分子的大小。n可以分离相对分子质量相同，但构型不同的可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNADNA分子。分子。共价闭环超螺旋共价闭环超螺旋DNADNA（cccDNAcccDNA）直线直线DNADNA（LDN

23、ALDNA，2 2条链发生断裂）开环的双链环条链发生断裂）开环的双链环状状DNADNA（ocDNAocDNA，1 1条链发生断裂）。条链发生断裂）。三、实验操作步骤三、实验操作步骤 n琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备n凝胶板的制备凝胶板的制备 n加样加样n电电泳泳 n结结果果观观察察 n将琼脂糖溶解在将琼脂糖溶解在100 ml的的1TBE电泳液中电泳液中,配配制成制成0.8%琼脂糖凝胶溶液琼脂糖凝胶溶液n当琼脂糖溶液的温度降至当琼脂糖溶液的温度降至6080时，加入时，加入GoldView I使其终浓度约为使其终浓度约为0.1l/ml,混匀后，混匀后，迅速倾入预先安装好的凝胶板中。迅速倾入预先安装好的凝胶板中。n待其凝固后，小心取下梳齿，备用。待其凝固后，小心取下梳齿，备用。n加样至样品孔中电泳加样至样品孔中电泳,调至恒压调至恒压80v，使，使DNA向向阳性方向移动。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿阳性方向移动。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约约12cm处，停止电泳。处，停止电泳。n紫外灯下观察电泳结果并进行拍照。紫外灯下观察电泳结果并进行拍照。Relaxed circleLinearized formSuper-coiled form四、实验结果与讨论四、实验结果与讨论n根据观察结果，绘图。根据观察结果，绘图。n分析自提质粒的情况以及酶切情况。分析自提质粒的情况以及酶切情况。