蛋白质与生物大分子的相互作用研究.ppt

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1、蛋白质与生物大分子的相互作用研究张雪梅检验医学院 基因的功能研究成为热点，研究的对象即为基因编码的产物蛋白质，生物功能的主要体现者和执行者。在所有生命活动中，细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性，这其中必须涉及蛋白与蛋白、核酸的相互作用。掌握或发明研究相互 作用的方法非常重要。nucleus cytoplasm 主要内容n免疫共沉淀(Co-IP)：蛋白蛋白，蛋白DNAnPulldown（亲和层析）：蛋白蛋白，蛋白DNA/RNAn电泳迁移实验(EMSA)：蛋白DNA/RNAn酵母双杂交系统：蛋白（X）蛋白用途：1.鉴定两种目标蛋白质是否在体内结合

2、，结合位点分析；2.筛选一种特定蛋白质的新的作用搭档。3.原理：4.当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。一、免疫共沉淀（in vivo）Co-Immunoprecipitation，Co-IPCo-IP工作原理示意图Co-immunoprecipitationbindingwashelutionYYYYYWestern blot 鉴定PAGE质谱细菌蛋白质的“protein A”可特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段Co-IP鉴定蛋白相互作用实验注意事项n 细胞裂解采用温

3、和的裂解条件（NP40、Triton-X100等）；每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验摸索确定。n 确保共沉淀的蛋白是由所加入的特异性抗体沉淀得到的，而并非其他非特异蛋白：1、使用单克隆抗体：多抗？2、使用对照样本或抗体（同型抗体）Structural basis of G proteincoupled receptorG protein interactions。Nature Chem Biol,2010,6:541-548（分析蛋白相互作用的位点）大鼠G蛋白耦联受体M3R G蛋白（绿色）（蓝色）（紫色）亚基G蛋白藕联受体信号转导示意图 将不同变异体的表达质粒共转染入cos-7细胞中，单

4、独转染的为对照；左图为IP前的IB,右图为IP后的IB，二者复合物为80kD（阳性结果）。图为两次独立实验的其中一次。TAK-242(Resatorvid),a Small Molecule Inhibitor of Toll-Like Receptor(TLR)4 Signaling,Binds Selectively to TLR4 and Interferes with Interactions between TLR4 and Its Adaptor Molecules.Mol Pharmacol,2011,79:34-41（鉴定）分析靶蛋白与小分子化合物的作用：The immunop

5、recipitates were separated using SDS-PAGE limmunoblotting with anti-FLAG M2 mAb or anti-HA tag mAb.lanalyzed using autoradiography.TRAM分析小分子化合物对蛋白相互作用的干扰Screening of ClpE interaction proteinsnConstruct recombinant plasmid pAE03-ClpE and transform into S.pneumoniae D39 nWestern blot for identificatio

6、nnCo-Immunoprecipitation(Co-IP)transfer 1ml（）cleared lysate of D39 and D39-ClpE-GFP to a 10ml beaker separately.Add 500l protein G-agarose beads(GE),incubate for 3h at 4 on a rotating apparatus with magnetic stirrer to remove non-specifically bound proteins.Add 800l protein G-agarose beads and 2025g

7、 GFP antibody(Clontech)to the supernatant.Incubate overnight at 4 on a rotating apparatus.Wash beads five times with 1 ml PBS for 2 min each wash.Resuspend pellet in 50-80l 2 SDS sample buffer.Load 1015 l of supernatant on an SDS/polyacrylamide gel.FtsW与与ClpE的相互作用鉴定的相互作用鉴定A：IP前前GFP多抗检测多抗检测，（，（FtsW:G

8、FP)B：IP后后ClpE多抗检测多抗检测，3.D39(FtsW:GFP)C：IP前前ClpE多抗检测多抗检测 1.rClpP，3.D39(FtsW:GFP)优点：相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响。难点：需要高质量的抗体进行IP；两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；检测不到弱或瞬时的相互作用。应用：分析与蛋白质相互作用的DNADNA序列序列信息染色质免疫共沉淀（Chromatin Immuno-precipitation,ChIP）Chip-seq技术技术 可获得数百万条序列标签，并能把所关注

9、的蛋白的DNA结合位点结合位点精确定位到基因组上。华大基因、上海生物芯片有限、上海康成生物有限公司等 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013Genome-Wide Mapping of in Vivo Protein-DNA Interactions.Science,2007,316(5830):1497-1502 Johnson等利用 ChIP-seq 对转录因子NRSF(神经元限制性沉默因子)在DNA上的结合位点进行了全基因组的筛查:结果：获得了1946个结合位点；结合位点的最小能分辨为50bp。获得的经典与非经典的神经限制性沉默元件(NRSE)序列。高质量的

10、ChIP-seq结果提供了研究新的DNA-蛋白相互作用的内容，发现其为胰岛发育调控网络中的重要转录因子。Ago1 Interacts with RNA Polymerase II and Binds to the Promoters of Actively Transcribed Genes in Human Cancer Cells.PloS Genet.2013 Sep;9(9):e1003821 Argonaute(Ago)家族蛋白:与小非编码RNAs(siRNAs,miRNAs,piRNAs)生成和功能发挥密切相关,调控蛋白质的合成或影响mRNA的稳定性;在人类肿瘤细胞中可直接或间接地

11、参与细胞周期进程的调控。二、Pull-down实验（in vitro）用途：1.鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用 2.筛选与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质原理：利用GST、HIS等标签蛋白将一种蛋白质（诱饵蛋白）固定于某种基质上(如Sepharose)，当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，通过改变洗脱液或洗脱条件即可回收所吸附的蛋白。洗脱洗脱（2）结合结合（3）检测检测（6）收集收集（5）洗脱洗脱（4）固定诱固定诱饵蛋白饵蛋白（1）The Polymeric Immunoglobulin ReceptorTranslocates Pneumococci a

12、cross Human Nasopharyngeal Epithelial Cells.Cell,2000,102:827837（筛选、鉴定）npolymeric immunoglobulin receptor(pIgR)nCbpA nThe hpIgR-mediated bacterial adherence and invasion were abolished by either insertional knockout of cbpA or antibodies against either hpIgR or CbpA.methodsn蛋白表达：Expression of CbpA P

13、olypeptides(6His）nPull-down：Affinity Purification of the CbpA Binding Proteinsn蛋白鉴定：Proteins in the fractions were analyzed by SDS-PAGE and IB，and N-Terminal Sequencing of the CbpA Binding ProteinsnrCbpA Covalently conjugated to 1 ml of Affi-Gel 15(BioRad)in 0.1 M MOPS(pH 7.5)at 4；nThe column was se

14、quentially washed with washing buffer；nDetroit cells surface proteins were labeled with Sulfo-NHS-LC-biotin；nCell lysates were prepared in a buffer containing protease inhibitors；nCellular debris was removed by centrifugation at 4，The supernatant was recycled through the CbpA1-affinity column for 4

15、h at 4；nwash the column with washing buffer；nthe bound proteins were eluted in 300 ml fractions with 100mM glycine-HCl(pH 2.5)。进一步鉴定hplgR与CbpA结合的区段及是否需要糖基化n rCbpA were immobilized on carboxylated latex beads.n Latex beads coated with CbpA polypeptides were resuspended in 100l of PBS/Mg2+/Ca2+and 0.1

16、%Triton X-100,and mixed with 100l of hSC（plgR胞胞外部分）外部分）.n Unbound proteins were removed by extensive washing buffer.n The beads were then resuspended in SDS-PAGE loading buffer to solubilize bound proteins.n Proteins were separated in SDS-PAGE gels and detected by IB.CbpA与hplgR结合区段的鉴定 Vncs为的另一种膜蛋白，h

17、SC为表达hplgR的MDCK细胞，Neo为不表达hplgR的MDCK细胞。Pull-down的优缺点n优点：灵敏、周期短抗体质量要求不高可鉴定直接相互作用n缺点：需要纯化的蛋白体外相互作用（假阳性、假阴性）DNA/RNA Pull-down 实验n应用：主要用于筛选、筛选、鉴定鉴定与目的DNA或RNA片段相互作用的蛋白质（转录因子、翻译调控因子类）n方法：与蛋白相互作用的Pull-down类似，只是固定于色谱柱或磁珠上的为标记的DNA或RNA片段，其他步骤一样。n优缺点：相较于酵母单/三杂交，其无需构建基因文库、操作较简便、周期短。缺点与蛋白Pull-down一样。Sreening tran

18、scription regulator by DNA pull-down M：蛋白分子量；C1C4：CPS探针洗脱液14；K1K4：空载M-280免疫磁珠空白对照14。A subset of replication proteins enhances origin recognition and lytic replication by the EB virus ZEBRA protein.PLoS Pathog.2010,6(8)DNA pull downn共孵育：BZKO cells were transfected with expression vectors for the indi

19、cated forms of ZEBRA together with Biotinylated oligomers containing one of 3 regulatory regions.nPull down：The Biotinylated probes were purified from cell lysates using avidin beads.nIB：The amount of ZEBRA bound to each probe and the total amount of ZEBRA present in each lysate were assessed by wes

20、tern blot analysis.检测DNA结合的蛋白量A:upstream region of oriLyt BURB:a short region of Rp BRpS C:full length Rp BRpL Chip检测（蛋白结合的DNA量）又叫凝胶阻滞实验（Gel retardation assay）或DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay）。是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，是当前被选作鉴定特定DNA或RNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。原理：DNA/RNA分子与蛋白的

21、结合导致了电泳时迁移率的降低。三、电泳迁移实验Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)凝胶阻滞实验的基本原理图 标记的DNA片段由于与蛋白质B结合，在凝胶电泳中移动速度变慢，因而呈现滞后的条带。ACB显影或显色*凝胶电泳标记的DNA片段细胞蛋白质提取物蛋白质与DNA结合*BDNA-蛋白质结合物电泳迁移缓慢滞后带表明DNA与蛋白质结合(a)(b)(c)在凝胶阻滞实验中竞争DNA与探针DNA之间的竞争作用（a）没有加入竞争DNA的正常的凝胶阻滞实验，探针DNA与特异蛋白质结合，出现阻滞条带；（b）加入的超量竞争DNA与探针DNA竞争结合同一种蛋白质，阻滞

22、条带消失；（c）竞争DNA为其它序列，与探针DNA分别结合不同的蛋白质，则出现同（a）一样的阻滞条带。*蛋白质与未标记的竞争DNA结合凝胶电泳显影或显色蛋白质不与非标记DNA结合*Role of Adaptor TRIF in the MyD88-Independent Toll-Like Receptor Signaling Pathway.Masahiro Yamamoto,et al.Science 301,640(2003);C：50 g/mlpoly(I:C）for the indicated periods.Nuclear extracts were prepared,and NF

23、-kB DNA binding activity was determined by electrophoretic mobility shift assay(EMSA)using an NF-Bspecific probe.poly(I:C),建立的基础：真核细胞的转录因子：l DNA结合域：DNA binding domain,BDl 转录激活域：Activation domain,AD四、酵母双杂交系统yeast two-hybrid system酵母双杂交技术的原理 酵母双杂交原理图UASLacZ/His报告基因表达X外源基因 BDGAL4 BD外源基因GAL4 ADADBD 质粒AD

24、质粒表达表达融合蛋白融合蛋白Y BDXYADYADRNA多聚酶 BDX酵母双杂交系统的组成n与BD融合的蛋白表达载体，表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)n与AD融合的蛋白表达载体，表达的蛋白称靶蛋白(prey或target)n带报告基因(report gene)的宿主细胞baittargettargetbait酵母双杂交技术的应用n筛选、鉴定蛋白质间的相互作用：验证预测的蛋白间相互作用、鉴定突变对蛋白与蛋白结合的影响、筛选蛋白的级联底物。n筛选、鉴定小分子与蛋白质之间的相互作用：鉴定干扰相互作用的分子、筛选药物作用位点及药物对蛋白相互作用影响。n筛选、鉴定核酸与蛋白质之间的相互作用：寻找靶序列的

25、结合蛋白（转录因子）。酵母双杂交技术的特点优点：n不需要抗体；n可直接得到相互作用蛋白的核酸序列；n胞内实验。缺点：n筛选工作需要构建基因文库。n假阳性结果比例较高。双报告基因三报告基因例：用酵母双杂交系统筛选与NifA（巴西固氮螺菌）相互作用的蛋白质。科学通报，2005，50（6）：540-545采用的酵母双杂交系统：n酵母细胞：S.cerevisiae PJ69-4A（clontech公司）n含有3个报告基因:ade2、his3和lacZ，其中ade2基因表达最为严谨，his3和lacZ的表达相对松弛。n两个载体pGBD（诱饵）和pGAD（靶蛋白）分别含报告基因trp和leu。实验步骤：n

26、含nifA的诱饵质粒的构建及鉴定 将重组质粒pGBD-nifA转入酿酒酵母PJ69-4A中,铺于SD/-Trp,SD/-Trp/-Ade,SD/-Trp/-His+3-AT及SD/-Trp+X-Gal+BU平板上,30培养25 d.pGBD-nifA转化子在SD/-Trp和SD/-Trp+X-Gal+BU平板上有正常的菌落长出,但在X-Gal存在下不呈现蓝色,而在SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His+3-AT平板上没有菌落长出,延长培养时间,仍然呈阴性结果.这说明诱饵质粒pGBD-nifA不不能能自自动动激激活活报报告告基基因因的表达,对宿主菌也没没有有毒毒性性作作用用,因此pG

27、BD-nifA可以用作诱饵质粒.n巴西固氮螺菌Sp7基因文库的构建 提取巴西固氮螺菌Sp7的染色体DNA,用Sau3A酶切后回收0.53 kb的DNA片段；然后与经BamH酶切的3个酵母双杂合系统的质粒载体pGAD1-C1,pGAD-C2及pGAD-C3分别进行连接(以确保外源片段的正确阅读),则构建成3个质粒文库,分别命名为YSPC1,YSCP2和YSCP3。n巴西固氮螺菌Sp7基因文库的筛选和阳性克隆的鉴定共转化：将基因组文库YSPC1,YSPC2和YSPC3分别与诱饵质粒pGBD-nifA共转化酵母感受态细胞,从YSPC1,YSPC2和YSPC3三个基因组文库中共分别得到1.4106,3

28、105和3.5105个共转化子.筛选阳性克隆：首先将转化产物铺于SD/-Leu/-Trp/-Ade选择培养基上进行筛选,3个文库转化物中共有168个菌落表现为Ade+；再将Ade+菌落挑出点种于SD/-Trp/-Leu+X-Gal+BU,SD/-Trp/-Leu/-His和SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His这3种不同的平板上进行筛选.最后,从3个文库中筛选到对3个报告基因ade2,his3和lacZ均能激活的阳性克隆109个。单倍体酵母的接合酵母的有性繁殖：a接合型和接合型,二者接合能形成二倍体。再转化：将这109个纯化后的质粒分别与诱饵质粒pGBD-nifA再次共转化酿酒酵母,在选

29、择性平板上进行鉴定,结果表明,只有11个组合可以同时激活3个报告基因的表达。n阳性克隆的序列鉴定及相互作用鉴定测序：结果表明这11个克隆属于4个蛋白基因：其中2个含有与转录因子调控有关的PAS结构域，另外1个基因片段含有与铁吸收有关的fhuE基因，另一个是未知蛋白。相互作用鉴定：载体互换实验和移码质粒构建实验。n已知NifA与P蛋白(glnB基因产物)有直接相互作用，但本次筛选的阳性克隆中并没有该基因。（原因：可能是由于我们在用Sau3A酶切而构建基因文库时,由于glnB基因(编码区只有336 bp)周围没有合适的Sau3A酶切位点而没有被包括进去）其它酵母杂交技术n三杂交技术(three-h

30、ybrid technology)n单杂交技术(one-hybrid technology)n反向双杂交技术(reverse two-hybrid technology)n核外双杂交技术(extranuclear two-hybrid technology)n细菌双杂交技术(bacterial two-hybrid technology)三杂交系统蛋白质（1）蛋白质三杂交系统、激酶三杂交系统。（2）三杂交系统小配体（筛寻小分子药物的作用蛋白）12（3）三杂交系统RNA（筛寻与已知RNA片段结合的蛋白）单杂交系统（筛寻与已知DNA结合的蛋白）1.AD融合基因文库2.已知DNA序列及下游报告基因的诱饵质粒插入酵母染色体基因组中（即诱饵序列与报告基因融合在一起）。反向双杂交系统用途：1、鉴定抑制蛋白质相互作用的小分子。2、筛选阻断蛋白质相互作用的小肽类药物。核外双杂交系统细菌双杂交系统周期短、文库容量大思考题：1.试比较pulldown、CoIP、EMSA和酵母双杂交系统的优势和劣势，分别适合用于哪些类型相互作用的检测？这些方法还可以有改良吗？还有哪些方法可以用于大分子间的相互作用？2.若想寻找某个基因的转录调控因子，可用到本节课所讲的哪些方法，试设计一条可行性较高的技术路线，筛选出转录调节子，并鉴定其与该基因的相互作用。