白喉疫苗工艺流程菌种上课讲义.ppt

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1、白喉疫苗工艺流程菌种细菌性疫苗种类细菌性疫苗种类23白喉白喉破伤风破伤风百日咳百日咳疫苗疫苗451霍乱霍乱伤寒伤寒副伤寒副伤寒百日咳百日咳疫苗疫苗卡介苗卡介苗鼠疫鼠疫布氏杆菌布氏杆菌伤寒伤寒痢疾痢疾霍乱霍乱疫苗疫苗脑膜炎脑膜炎伤寒伤寒vivi 肺炎肺炎流感嗜流感嗜血杆菌血杆菌多糖疫多糖疫苗苗ACAC脑膜脑膜炎球菌炎球菌多糖结多糖结合疫苗合疫苗HIBHIB脑膜炎脑膜炎伤寒伤寒vivi流感嗜流感嗜血杆菌血杆菌多糖疫多糖疫苗苗百日咳疫苗百日咳疫苗 伤寒疫苗伤寒疫苗结合疫苗结合疫苗 白喉疫苗白喉疫苗白喉疫苗白喉疫苗一、白喉概述一、白喉概述二、病原学二、病原学三、白喉杆菌的致病力及毒素产生的遗传学三、白

2、喉杆菌的致病力及毒素产生的遗传学四、白喉毒素四、白喉毒素五、白喉类毒素五、白喉类毒素六、生产工艺六、生产工艺七、类毒素的质量检定七、类毒素的质量检定外毒素外毒素对神经对神经系统损系统损害害细菌产生细菌产生的外毒素的外毒素对心肌损对心肌损害害外毒素外毒素对肾脏对肾脏损害损害白喉曾经是对儿童威胁非常大的传染病。白喉曾经是对儿童威胁非常大的传染病。它是由白喉棒状杆菌引起的一种呼吸道传染病它是由白喉棒状杆菌引起的一种呼吸道传染病主要临床表现为上呼吸道发炎主要临床表现为上呼吸道发炎，常常表现在咽部，有时在鼻腔、喉部和气管，常常表现在咽部，有时在鼻腔、喉部和气管，白喉疫苗白喉疫苗白喉流行特点白喉流行特点1

3、.1.传染原：白喉杆菌是严格寄生于人类的细菌传染原：白喉杆菌是严格寄生于人类的细菌 没有中间宿主，病人及带菌者是唯没有中间宿主，病人及带菌者是唯 一的传染原。一的传染原。2.2.传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也可通传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也可通 过被污的器具和食物传播。过被污的器具和食物传播。3.3.易感人群：人对白喉普遍易感，新生儿易感人群：人对白喉普遍易感，新生儿1 1岁时岁时白喉易感性达高峰。白喉易感性达高峰。二、病原学二、病原学1.1.细菌形态细菌形态 白喉棒状杆菌菌体一端或两端膨大呈白喉棒状杆菌菌体一端或两端膨大呈 棒状，有着色较深的异染颗粒，革兰棒状，有着色较深的异染颗粒

4、，革兰 氏染色阳性，白喉杆菌无动力，无荚氏染色阳性，白喉杆菌无动力，无荚 膜，不形成芽孢。膜，不形成芽孢。白喉棒状杆菌显微镜下形态白喉棒状杆菌显微镜下形态白喉棒状杆菌显微镜下形态白喉棒状杆菌显微镜下形态 2.2.培养特性培养特性 白喉杆菌是需氧菌，最适温度为白喉杆菌是需氧菌，最适温度为34343535。能分解。能分解 葡萄糖、麦芽糖和糊精，产酸不产气，能还原硝酸葡萄糖、麦芽糖和糊精，产酸不产气，能还原硝酸 盐，不产生吲哚，不消化蛋白。盐，不产生吲哚，不消化蛋白。3.3.抵抗力抵抗力 .白喉杆菌对抗生素有不同程度敏感，对青霉素和白喉杆菌对抗生素有不同程度敏感，对青霉素和 红霉素极敏感。红霉素极敏

5、感。.对消毒剂抵抗力弱，对消毒剂抵抗力弱，3 3苯酚苯酚10min10min可将该菌杀死可将该菌杀死 .不耐热，不耐热，58 10mi58 10mi或或100 1min100 1min即可被杀死。即可被杀死。二、病原学二、病原学三、白喉杆菌的致病力及毒素产生遗传学三、白喉杆菌的致病力及毒素产生遗传学1.1.致病力致病力 自然界中动物不感染白喉，只能在敏感动物中造成自然界中动物不感染白喉，只能在敏感动物中造成 人工感染。猴、马、家兔和豚鼠对白喉敏感实验人工感染。猴、马、家兔和豚鼠对白喉敏感实验 室常用的动物是家室常用的动物是家兔、豚鼠和兔、豚鼠和NIHNIH小鼠小鼠。2.2.毒素产生遗传学毒素产

6、生遗传学 白喉是由白喉杆菌产生毒性很强的外毒素引起的。白喉是由白喉杆菌产生毒性很强的外毒素引起的。白喉杆菌的产毒基因是由白喉杆菌的产毒基因是由嗜菌体携带。嗜菌体携带。嗜菌嗜菌 体感染无毒白喉杆菌后嗜菌体体感染无毒白喉杆菌后嗜菌体DNADNA与细菌与细菌DNADNA整合，整合，形成溶原性白喉杆菌而获得产毒能力（形成溶原性白喉杆菌而获得产毒能力（PW8PW8株目前株目前 用于白喉类毒素生产用于白喉类毒素生产)。四、白喉毒素四、白喉毒素1.1.白喉外毒素为棒状杆菌白喉外毒素为棒状杆菌-噬菌体噬菌体toxtox基因表达基因表达 产物产物,可与细胞表面的特异性受体结合可与细胞表面的特异性受体结合,干扰蛋

7、干扰蛋 白质的合成，对人和动物都引起致死性毒性，白质的合成，对人和动物都引起致死性毒性，如心脏、肾上腺、肝、肾、胰及神经组织等均如心脏、肾上腺、肝、肾、胰及神经组织等均 受到损害。受到损害。2.2.白喉毒素是单一多肽，由白喉毒素是单一多肽，由560560个氨基酸组成，个氨基酸组成，分子量为分子量为62kDa62kDa,等电点等电点pH4.1pH4.1，在，在pH6pH6时加热时加热5555 很快失活。很快失活。3.3.通过物理和化学方法将其纯化。通过物理和化学方法将其纯化。细细菌菌毒毒素素甲醛甲醛类毒素类毒素毒素经毒素经甲醛处理后去除毒性甲醛处理后去除毒性 而保留免疫原性而保留免疫原性五、白喉

8、类毒素五、白喉类毒素甲醛甲醛浓度浓度温度温度PH脱毒脱毒影响脱毒因素影响脱毒因素温度、温度、pHpH和甲醛浓度等均影响脱毒效果和甲醛浓度等均影响脱毒效果.温度越高脱毒越快，超过温度越高脱毒越快，超过4040影响抗原性，影响抗原性，一般一般373738 38。.在酸性时脱毒较慢，但游离甲醛含量高，在在酸性时脱毒较慢，但游离甲醛含量高，在 保存过程中由于甲醛的继续作用，可导致脱保存过程中由于甲醛的继续作用，可导致脱 毒过甚，并影响毒素的稳定性；在碱性时脱毒过甚，并影响毒素的稳定性；在碱性时脱 毒快，但抗原性损失较大，一般采用毒快，但抗原性损失较大，一般采用弱碱性。弱碱性。.甲醛浓度大则脱毒快，但抗

9、原损失大。甲醛浓度大则脱毒快，但抗原损失大。温度升高温度升高游离甲醛的浓度低游离甲醛的浓度低毒素纯度高毒素纯度高易发生毒易发生毒性逆转性逆转提高甲醛浓度、脱毒提高甲醛浓度、脱毒pHpH、脱毒温度和延长脱毒时间；脱毒温度和延长脱毒时间；增加非蛋白氮含量（于精制增加非蛋白氮含量（于精制毒素中加入赖氨酸、精氨酸毒素中加入赖氨酸、精氨酸等）等）防止或减防止或减轻毒性逆轻毒性逆转转类毒素的毒性逆转类毒素的毒性逆转 六、白喉疫苗工艺流程六、白喉疫苗工艺流程 菌种（菌种（PW8PW8株株 ）传代扩增传代扩增 3 34 4代代 发酵罐培养发酵罐培养 34343535培养对数生长培养对数生长 末期收获，甲苯杀菌

10、。末期收获，甲苯杀菌。离心去菌体离心去菌体 收集清液收集清液 超滤浓缩超滤浓缩 硫酸铵两段盐析硫酸铵两段盐析 除盐除菌除盐除菌 氨离子及无菌检查氨离子及无菌检查 脱毒脱毒 甲醛液甲醛液 37 37 脱毒试验（家兔）脱毒试验（家兔）原液原液 检定（浓度、纯度、安全等）检定（浓度、纯度、安全等）Al(OH)Al(OH)3 3吸附吸附 成品成品检定检定（安全、效价等）（安全、效价等）七、类毒素的质量检定七、类毒素的质量检定1 絮状单位（絮状单位（Lf）是毒素或类毒素与抗毒素的结合单位，只能代表是毒素或类毒素与抗毒素的结合单位，只能代表“量量”而不能完全代表活性。使用抗毒素絮状单位标准品来测定而不能完

11、全代表活性。使用抗毒素絮状单位标准品来测定类毒素的絮状单位。类毒素的絮状单位。絮状单位测定絮状单位测定毒素或类毒素与相应抗毒素在适当的含量、比例、温度毒素或类毒素与相应抗毒素在适当的含量、比例、温度反应时间等条件下可在试管中发生抗原抗体结合，产生肉反应时间等条件下可在试管中发生抗原抗体结合，产生肉眼可见的絮状凝集反应，眼可见的絮状凝集反应，根据抗毒素絮状单位标准品可测定类毒素的絮状单位根据抗毒素絮状单位标准品可测定类毒素的絮状单位（Lf）值。）值。2 纯度：纯度：1500Lf/mgPN3 安全性试验（豚鼠）安全性试验（豚鼠）七、类毒素的质量检定七、类毒素的质量检定4 4效价测定效价测定 类毒素

12、刺激机体产生特异性抗体的免疫应答和对相应抗类毒素刺激机体产生特异性抗体的免疫应答和对相应抗 体的特异性结合反应。体的特异性结合反应。小鼠小鼠VeroVero细胞法细胞法 将标准和待检类毒素将标准和待检类毒素2 2倍稀释倍稀释3 35 5个稀释度，皮下免疫个稀释度，皮下免疫N N IH IH小鼠小鼠8 8只（只（0.5ml/0.5ml/只只)，免疫，免疫5 5周采血，根据周采血，根据verovero细胞细胞 生长情况，以标准品的效价为标准，用平行线分析法进生长情况，以标准品的效价为标准，用平行线分析法进 行结果计算。行结果计算。豚鼠毒素攻击法豚鼠毒素攻击法 皮下免疫豚鼠皮下免疫豚鼠1010只（只

13、（1ml/1ml/只），免疫只），免疫4 4周后用毒素攻击，周后用毒素攻击，观察观察5 5天根据存活率以标准品的效价为标准，用平行线分天根据存活率以标准品的效价为标准，用平行线分 析法进行结果计算。析法进行结果计算。百日咳疫苗百日咳疫苗一、百日咳概述一、百日咳概述二、病原学二、病原学三、百日咳疫苗发展简史三、百日咳疫苗发展简史四、无细胞百日咳疫苗四、无细胞百日咳疫苗、生产工艺流程、生产工艺流程、质量检定、质量检定、APVAPV的效果的效果、接种不良反应、接种不良反应急性脑炎、急性脑炎、呕吐、痉挛呕吐、痉挛和昏迷，死和昏迷，死亡或脑损伤亡或脑损伤并发症肺炎并发症肺炎形成肺气肿形成肺气肿肺不张，甚

14、肺不张，甚至死亡。至死亡。营养缺营养缺乏症乏症百日咳是对儿童威胁非常大的传染病，百日咳是对儿童威胁非常大的传染病，它是由百日咳杆菌引起的一种呼吸道传染病。它是由百日咳杆菌引起的一种呼吸道传染病。典型症状为突然阵发性痉咳，并带有吸气性尾典型症状为突然阵发性痉咳，并带有吸气性尾声或伴有呕吐，可持续数月。声或伴有呕吐，可持续数月。百日咳概述百日咳概述百日咳流行特点百日咳流行特点1.1.传染原：人是百日咳唯一的天然宿主百日咳传染原：人是百日咳唯一的天然宿主百日咳 病人是传染原。病人是传染原。2.2.传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也可通传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也可通 过被污的器具和食物传播。过

15、被污的器具和食物传播。3.3.易感人群：主要传染对象是易感人群：主要传染对象是6 6岁以下儿童，岁以下儿童，1 1 岁以内婴幼儿发病率岁以内婴幼儿发病率50%50%。二、病原学二、病原学细菌形态细菌形态百日咳菌呈革兰氏染色阴性，短杆状或椭圆形百日咳菌呈革兰氏染色阴性，短杆状或椭圆形生长特性生长特性1.1.百日咳菌可分四种相变，百日咳菌可分四种相变，相菌毒力最强有免相菌毒力最强有免 疫原性疫原性；相菌毒力消失，无免疫原性；相菌毒力消失，无免疫原性；相菌介于相菌介于 相之间。相之间。2.2.百日咳菌是需氧菌，最适温度为百日咳菌是需氧菌，最适温度为353536,36,最最 适适pH6.8-7.0pH

16、6.8-7.0。3.3.不发酵任何糖类、不分解糊精，尿素盐，不液不发酵任何糖类、不分解糊精，尿素盐，不液 化明胶不产生吲哚，不利用枸橼酸盐。化明胶不产生吲哚，不利用枸橼酸盐。作用作用 PT PT FHA FHAAggsAggsPRNPRN AC ACTCTTCTHLTHLT 呼吸道粘附作用呼吸道粘附作用 -细胞毒性细胞毒性 免疫原性免疫原性 -1 1百日咳百日咳相菌有两大类抗原相菌有两大类抗原 菌体菌体O O抗原抗原 表面表面K K抗原（荚膜物质）抗原（荚膜物质）2 2百日咳菌可产生百日咳菌可产生 外毒素外毒素(PT)(PT)内毒素内毒素 其他生物活性物质，据报道有其他生物活性物质，据报道有2

17、525种之多。种之多。、主要抗原和生物学活性、主要抗原和生物学活性 百日咳菌粘附在上呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖百日咳菌粘附在上呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖 重患重患 (FHA PT PRN Agg)(FHA PT PRN Agg)下呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖下呼吸道上皮细胞纤毛上繁殖 细菌不进入组织和血液循环细菌不进入组织和血液循环 干扰吞噬细胞功能干扰吞噬细胞功能 AC AC 分泌大量分泌大量PTPT麻痹上皮细胞功能麻痹上皮细胞功能 TCT TCT 产生血细胞增多产生血细胞增多损伤支气管血管周损伤支气管血管周 HLT HLT 细胞代谢发生变化细胞代谢发生变化 组织胺致敏性增强组织胺致敏性增强 围组织

18、围组织 分泌胰岛素增强和分泌胰岛素增强和 血糖降低血糖降低.、致病机理、致病机理三、百日咳疫苗发展简史三、百日咳疫苗发展简史粗制百日咳灭活疫苗粗制百日咳灭活疫苗 第一次世界大战时期，在对病原菌的生物学构造及其第一次世界大战时期，在对病原菌的生物学构造及其 与与 致病机理间的关系缺乏认识的前提下，凭经验制造的灭活致病机理间的关系缺乏认识的前提下，凭经验制造的灭活 疫苗，工艺粗造、含量不确定。疫苗，工艺粗造、含量不确定。全菌体百日咳疫苗全菌体百日咳疫苗(WPV)(WPV)以标准化方式生产的，制造疫苗的菌株必须含有以标准化方式生产的，制造疫苗的菌株必须含有123123型凝型凝 集原（集原（Agg1A

19、gg1、Agg2Agg2 、Agg3Agg3）。经过）。经过5050多年的临床应用证多年的临床应用证 明该疫苗的免疫效果是肯定的，但接种后的不良反应问题明该疫苗的免疫效果是肯定的，但接种后的不良反应问题 一直未解决。一直未解决。无细胞百日咳疫苗无细胞百日咳疫苗(APV)(APV)2020世纪世纪8080年代初期，对百日咳菌的成分及其所引起生物学年代初期，对百日咳菌的成分及其所引起生物学 作用的认识，产生了作用的认识，产生了APVAPV。基因工程疫苗正在研究中。基因工程疫苗正在研究中。四、无细胞百日咳疫苗四、无细胞百日咳疫苗19811981年日本的佐藤教授等人在纯化出年日本的佐藤教授等人在纯化出

20、PTPT和和FHAFHA两种抗原的基础两种抗原的基础 上，在世界上第一次研制成功了含有两种抗原成分的无细胞百上，在世界上第一次研制成功了含有两种抗原成分的无细胞百 日咳疫苗，并且与白喉和破伤风类毒素联合制成无细胞百白破日咳疫苗，并且与白喉和破伤风类毒素联合制成无细胞百白破 联合疫苗。该疫苗在日本开始正式使用，目前日本已经全部取联合疫苗。该疫苗在日本开始正式使用，目前日本已经全部取 代了菌体百白破疫苗。代了菌体百白破疫苗。19921992年美国正式批准使用日本生产的无细胞百日咳疫苗。美国年美国正式批准使用日本生产的无细胞百日咳疫苗。美国 获得生产许可证的获得生产许可证的APVAPV还含有还含有A

21、gg2Agg2和和PRNPRN。目前。目前WHOWHO已经将其作已经将其作 为儿童预防免疫推荐用疫苗。为儿童预防免疫推荐用疫苗。我国是于我国是于8080年代中期开始研制无细胞百白破联合疫苗，年代中期开始研制无细胞百白破联合疫苗，9090年代年代 中期获得正式生产文号。中期获得正式生产文号。近期的临床试验证明含有近期的临床试验证明含有5 5种保护性抗原（种保护性抗原（PT FHA PRN Agg2PT FHA PRN Agg2 A A gg3 gg3 ）的）的APVAPV效果最佳。效果最佳。冻干百日咳菌种（冻干百日咳菌种（相相CS菌株）菌株）接种血培养基大管培养接种血培养基大管培养 36 48-

22、72小时培养小时培养传代传代接种发酵罐培养（综合培养基）接种发酵罐培养（综合培养基）培养培养 48小时小时收集培养物收集培养物第一段硫酸铵盐析及浸提第一段硫酸铵盐析及浸提第二段硫酸铵盐析及浸提第二段硫酸铵盐析及浸提透析透析密度梯度离心密度梯度离心戊二醛脱毒戊二醛脱毒透析透析超声超声无细胞百日咳原液无细胞百日咳原液、生产工艺流程、生产工艺流程检测项目检测项目标准标准蛋白含量蛋白含量 抗原纯度测定抗原纯度测定PTPT和和FHAFHA不低于总蛋白质不低于总蛋白质含量的含量的85%85%热原测定热原测定符合规定符合规定毒毒性性试试验验 小鼠体重减轻试验小鼠体重减轻试验不高于不高于10BWDU/ml10

23、BWDU/ml小鼠白细胞增多试验小鼠白细胞增多试验不高于不高于0.5PLU/ml0.5PLU/ml小鼠组胺致敏试验小鼠组胺致敏试验不高于不高于0.8HSU/ml0.8HSU/ml毒性逆转试验毒性逆转试验不高于不高于0.8HSU/ml0.8HSU/ml效价测定（脑腔保护力试验）效价测定（脑腔保护力试验）不低于不低于4.0IU/4.0IU/剂量剂量、质量检定、质量检定日本和中国的日本和中国的APVAPV和和DTPaDTPa按以上主要检定项目进行质量按以上主要检定项目进行质量 控制。控制。美国、欧洲一些国家及美国、欧洲一些国家及WHOWHO推荐的毒性和效价测定方法推荐的毒性和效价测定方法 等与之不同

24、。等与之不同。毒性试验毒性试验仅要求做仅要求做HSTHST，效价测定效价测定采用采用ELEL ISA ISA法检测疫苗注射小鼠后百日咳抗体应答水平。法检测疫苗注射小鼠后百日咳抗体应答水平。用小鼠脑腔保护力试验用小鼠脑腔保护力试验（MPTMPT）评价疫苗效果，评价疫苗效果，WPV WPV 的的 效价明显高于效价明显高于APVAPV，而且并非所有的而且并非所有的APVAPV均可通过均可通过MPTMPT试试 验。验。因此还没有令人满意的针对因此还没有令人满意的针对APVAPV疫苗的效价试验方疫苗的效价试验方 法。法。免疫原性试验在衡量制品的一致性方面是有用的，但免疫原性试验在衡量制品的一致性方面是有

25、用的，但 与临床保护之间还缺乏相关性。与临床保护之间还缺乏相关性。效价测定方法探讨效价测定方法探讨接种种类接种种类免疫人数免疫人数病例数病例数发病率（发病率（%）报道时间报道时间WPVWPV56568 814.314.319831983APVAPV36364 411.311.3_ _5858484882.882.8APVAPV30303 310.010.019881988_ _4242373780.080.0APVAPV26261 13.83.819881988 _ _2727171762.962.9APVAPV62622 23.23.219901990_ _3737303081.081.0表

26、明表明APVAPV的保护效果是肯定的，能够达到的保护效果是肯定的，能够达到WPAWPA的保护水平。的保护水平。、APVAPV的效果的效果疫苗种类疫苗种类发热发热(%)(%)持续性喊持续性喊(%)(%)红晕红晕(%)(%)肿胀肿胀(%)(%)疼痛疼痛(%)(%)APVAPV0.8-2.80.8-2.84.5-9.04.5-9.01.4-5.51.4-5.51.2-5.51.2-5.51.4-4.81.4-4.8WPVWPV6.66.620.520.59.59.515.415.420.820.8表明表明APVAPV的不良反应明显低于的不良反应明显低于WPVWPV。、接种不良反应、接种不良反应伤寒疫

27、苗伤寒疫苗一、概述一、概述二、病原学二、病原学三、伤寒疫发展简史三、伤寒疫发展简史四、伤寒四、伤寒ViVi疫苗疫苗1.伤伤寒寒病病是是一一种种急急性性全全身身性性感感染染，感感染染网网状状内内皮皮细细胞胞系系统统，肠肠道道淋淋巴巴组组织织及及胆胆囊囊，病病原是伤寒沙门氏菌。原是伤寒沙门氏菌。2.传播途径是食入被污染的食物或水源。传播途径是食入被污染的食物或水源。3.学学龄龄儿儿童童发发病病率率最最高高，两两岁岁以以下下儿儿童童和和35岁以上成人发病率低。岁以上成人发病率低。一、一、概述概述1潜伏期为潜伏期为7 72121天天病期为一病期为一个月，恢个月，恢复缓慢。复缓慢。3表情迟钝表情迟钝脉搏

28、相对脉搏相对缓慢，肝缓慢，肝脾肿大和脾肿大和白细胞减白细胞减少。少。2长期发热、长期发热、持续高烧持续高烧达达10101414天、腹部天、腹部不适、头不适、头痛等。痛等。2长期发热、长期发热、持续高烧持续高烧达达10101414天、腹部天、腹部不适、头不适、头痛等。痛等。典型的临床症状典型的临床症状二、病二、病 原原 学学1.1.细菌形态细菌形态 伤寒沙门氏菌是革兰氏阴性杆菌，伤寒沙门氏菌是革兰氏阴性杆菌，有鞭毛，能运动。有鞭毛，能运动。伤寒沙门氏菌革兰染色伤寒沙门氏菌革兰染色伤寒沙门氏菌电镜形态伤寒沙门氏菌电镜形态 2.2.培养特性培养特性在肉汤琼脂、马丁琼脂或其他适宜培养基上以在肉汤琼脂、

29、马丁琼脂或其他适宜培养基上以易生长，需氧，适宜温度易生长，需氧，适宜温度35-3735-37，适宜的，适宜的pHpH为为7.07.07.27.2。发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇均产酸不产气；发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇均产酸不产气；不发酵乳糖、蔗糖；氧化酶试验阴性。不发酵乳糖、蔗糖；氧化酶试验阴性。1.1.鞭毛（鞭毛（H H）抗原：为蛋白质，煮沸破坏，不受抗原：为蛋白质，煮沸破坏，不受 （1 1）甲醛影响。）甲醛影响。2.2.菌体（菌体（O O）抗原：细胞壁部份，耐热，为脂多抗原：细胞壁部份，耐热，为脂多 糖（糖（LPSLPS）由多糖（重复寡）由多糖（重复寡 糖和核心寡糖）和类脂糖和核心寡糖）和类脂

30、A A组组 成。成。3.3.莢膜（莢膜（ViVi）抗原抗原:即荚膜多糖（即荚膜多糖（CPSCPS）,是伤寒是伤寒 杆菌细胞外壁的一种荚膜抗杆菌细胞外壁的一种荚膜抗 原原,Vi Vi抗原与其致病性有关抗原与其致病性有关 ViVi来源于毒力的缩写。来源于毒力的缩写。抗原结构抗原结构血清学诊断血清学诊断 1.1.肥达氏试验（肥达氏试验（widal testwidal test）选择抗原的方法：选择抗原的方法：.测定测定O O抗体抗体 用伤寒用伤寒09010901株（没有株（没有H H和和ViVi抗原）抗原）用加热杀菌破坏用加热杀菌破坏H H抗原（不耐热）抗原（不耐热）.测定测定H H抗体抗体 用伤寒

31、用伤寒S S株（没有株（没有O O菌体抗原）菌体抗原）用甲醛处理伤寒沙门氏菌破坏用甲醛处理伤寒沙门氏菌破坏O O抗原抗原 2.2.酶联免疫试验酶联免疫试验1234全菌全菌体灭体灭活疫活疫苗苗口服口服Ty21aTy21a减毒减毒活疫活疫苗苗伤寒伤寒ViVi多多糖疫糖疫苗苗伤寒伤寒结合结合疫苗疫苗二、伤寒疫苗的发展简史二、伤寒疫苗的发展简史1 1甲醛杀菌石碳酸防腐疫苗甲醛杀菌石碳酸防腐疫苗2.2.加热杀菌石碳酸防腐疫苗加热杀菌石碳酸防腐疫苗3.3.丙酮杀菌疫苗丙酮杀菌疫苗、全菌体灭活疫苗、全菌体灭活疫苗甲醛杀菌石碳酸防腐疫苗甲醛杀菌石碳酸防腐疫苗 50 50年代初期学自前苏联，为伤寒、副伤寒甲年代

32、初期学自前苏联，为伤寒、副伤寒甲乙三联疫苗。用甲醛杀菌，乙三联疫苗。用甲醛杀菌，0.50.5石炭酸生石炭酸生理盐水制成。每毫升含伤寒沙门氏菌体原为理盐水制成。每毫升含伤寒沙门氏菌体原为1 1亿亿-亿；副伤寒甲乙由每毫升各亿亿；副伤寒甲乙由每毫升各亿-.5.5亿，亿，细菌总量原三联疫苗为细菌总量原三联疫苗为2020亿亿-10-10亿。亿。加热杀菌石碳酸防腐疫苗加热杀菌石碳酸防腐疫苗 此法历史最久，此法历史最久，18961896年首创的伤寒疫苗即为此年首创的伤寒疫苗即为此法制成，只用法制成，只用5656水浴水浴3030inin杀菌加石碳酸防腐制杀菌加石碳酸防腐制成。美国仍用此法制作标成。美国仍用此

33、法制作标准品。准品。丙酮杀菌疫苗丙酮杀菌疫苗 1921 1921年创制，认为对稳定年创制，认为对稳定ViVi抗原有益，系抗原有益，系将一份菌液加三份丙酮处理，然后抽气将一份菌液加三份丙酮处理，然后抽气干燥制成。干燥制成。19431943年首次在意大利使用，经年首次在意大利使用，经世界卫生组织做现场考核，认为效果最好。世界卫生组织做现场考核，认为效果最好。观察组观察组观察人数观察人数中强反应中强反应百分率百分率(%)(%)第一组第一组1408140885856.056.05第二组第二组1313131315115111.5011.50合计合计272127212362368.758.75伤寒、副伤寒

34、甲乙三联疫苗接种反应伤寒、副伤寒甲乙三联疫苗接种反应 实践证明，菌体疫苗预防伤寒效果肯定的，但接实践证明，菌体疫苗预防伤寒效果肯定的，但接种后的严重反应一直困扰着人们。种后的严重反应一直困扰着人们。、口服、口服Ty21aTy21a疫苗疫苗 7070年代末期研究成年代末期研究成功的口服伤寒疫苗功的口服伤寒疫苗Ty21aTy21a活疫苗，是以活疫苗，是以Ty21Ty21伤寒毒株作为出发伤寒毒株作为出发株，用亚硝基胍诱变所株，用亚硝基胍诱变所得的突变株。得的突变株。口服口服Ty21aTy21a疫苗的特点疫苗的特点1.1.减毒活疫苗减毒活疫苗此突变株缺少尿苷二磷酸半乳糖此突变株缺少尿苷二磷酸半乳糖-4

35、-4-异构酶半乳糖异构酶半乳糖 激酶和半乳糖激酶和半乳糖1-1-磷酸尿苷酰转移酶的活性降低约磷酸尿苷酰转移酶的活性降低约8 8 0 0。且没有且没有ViVi抗原。所以其毒力减低，但此突变株有抗原。所以其毒力减低，但此突变株有 完整的完整的O O抗原抗原LPSLPS，并具有免疫原性，能诱导较好并具有免疫原性，能诱导较好 的免疫保护性反应。的免疫保护性反应。2.2.经过多年观察证明有效，反应也较轻。一些国家经过多年观察证明有效，反应也较轻。一些国家 批准应用。批准应用。口服口服Ty21aTy21a疫苗的特点疫苗的特点3.Ty21a3.Ty21a菌株营养要求苛刻，生长缓慢，菌株营养要求苛刻，生长缓慢

36、，产量很低，不易批量生产。产量很低，不易批量生产。4.4.目前无可靠的检定指标。目前无可靠的检定指标。5.5.基因背景不够清楚，因为它是用强诱变基因背景不够清楚，因为它是用强诱变 剂处理而得，作为活疫苗这是它的最大剂处理而得，作为活疫苗这是它的最大 的弱点。的弱点。地区地区疫苗制剂疫苗制剂效果效果效果比较效果比较埃及埃及液体液体NaHcoNaHco3 3 96%96%智利智利肠溶衣胶囊明胶囊肠溶衣胶囊明胶囊 6666ECCECC、1919明胶明胶 ECCECC明胶明胶 智利智利液体胶囊液体胶囊 35%35%ECCECC、76%76%液体液体 液体液体ECC ECC 印尼印尼液体胶囊液体胶囊 4

37、2%42%ECCECC、53%53%液体液体 液体液体ECC ECC 口服口服Ty21aTy21a减毒活疫苗的免疫效果减毒活疫苗的免疫效果、伤寒伤寒ViVi多糖疫苗多糖疫苗1.1.伤寒伤寒ViVi多糖疫苗的概述多糖疫苗的概述2.2.伤寒伤寒ViVi多糖疫苗的免疫效果多糖疫苗的免疫效果3.3.伤寒伤寒ViVi多糖疫苗不良反应观察结果多糖疫苗不良反应观察结果4.4.伤寒伤寒ViVi多糖疫苗的制造工艺多糖疫苗的制造工艺5.5.伤寒伤寒ViVi多糖疫苗的特点多糖疫苗的特点伤寒伤寒ViVi多糖疫苗概述多糖疫苗概述由于由于ViVi抗原是一种表面抗原，是由抗原是一种表面抗原，是由C3C3位乙酰化的位乙酰化的

38、 N-N-乙酰乙酰-D-D-半乳糖醛酸（半乳糖醛酸（1 14 4）连接的同聚体。）连接的同聚体。在美国在美国NIHNIH的的RobbinsRobbins等重新认识伤寒等重新认识伤寒ViVi抗原的免抗原的免 疫原性后，并受流脑多糖疫苗的启发，用与之类疫原性后，并受流脑多糖疫苗的启发，用与之类 似的方法提取似的方法提取ViVi抗原，以不伤害其抗原结构，保抗原，以不伤害其抗原结构，保 持它的免疫原性，制备了伤寒持它的免疫原性，制备了伤寒ViVi多糖疫苗。多糖疫苗。伤寒伤寒ViVi多糖疫苗概述多糖疫苗概述早期提取早期提取Vi Vi 抗原时为了降低抗原时为了降低LPSLPS的含量，的含量，采取采取1mo

39、l/L1mol/L乙酸乙酸100100处理处理24h24h，使，使O-O-乙酰乙酰 基和基和N-N-乙酰基脱落造成乙酰基脱落造成ViVi抗原结构变化，抗原结构变化，导致其免疫原性发生变化。导致其免疫原性发生变化。新方法是用十六烷基三甲基溴化铵处理伤新方法是用十六烷基三甲基溴化铵处理伤 寒沙门氏菌，所得寒沙门氏菌，所得ViVi抗原可以保留抗原可以保留O-O-乙酰乙酰 基和基和N-N-乙酰基，使其不变性。乙酰基，使其不变性。观察观察地区地区疫苗疫苗人数人数观察观察时间（月）时间（月）保护率保护率（）（）尼泊尔尼泊尔伤寒伤寒Vi Vi 34573457（5 54444岁）岁）17177272南非南非

40、伤寒伤寒Vi Vi 56925692（5 51616岁）岁）21216464伤寒伤寒ViVi多糖疫苗的免疫效果多糖疫苗的免疫效果疫苗疫苗局部反应局部反应发热率发热率 (%)(%)疼痛疼痛红肿红肿硬结硬结流脑流脑A+CA+C多糖多糖（50g/50g/人）人）N=129 N=129 89 89（6969）2323（1818）21 21（1616）2 2（2 2）伤寒伤寒ViVi（25g/25g/人）人）N=127 N=127 7878（6161）1010（8 8）2 2（2 2）1 1（1 1）伤寒伤寒ViVi（50g/50g/人）人）N=126 N=126 86 86（6868）9 9（7 7)

41、9 9（7 7）0 0伤寒伤寒ViVi多糖疫苗不良反应观察结果多糖疫苗不良反应观察结果（Ty2株）株）细菌培养细菌培养生物反应液体培养（生物反应液体培养（810h）对数生长期末收获对数生长期末收获,甲醛液灭活甲醛液灭活离心去菌体，收上清液离心去菌体，收上清液浓缩多糖浓缩多糖上清加上清加10%十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵离心收集沉淀，加氯化钙溶液振离心收集沉淀，加氯化钙溶液振荡解离荡解离除去核酸除去核酸加加95%乙醇至乙醇至25%浓度收集上浓度收集上清清上清中加上清中加95%乙醇至乙醇至80%浓度浓度沉淀粗制多糖，抽干沉淀粗制多糖，抽干除去蛋白除去蛋白加加1：10饱和中性醋酸钠溶液饱

42、和中性醋酸钠溶液溶解多糖溶解多糖按按1：2 2加冷酚提取加冷酚提取3次，离心收次，离心收集上清集上清液并透析液并透析沉淀多糖沉淀多糖透析液加透析液加95%乙醇至乙醇至80%沉淀多糖沉淀多糖用无水乙醇和丙酮各洗用无水乙醇和丙酮各洗3次次原液原液注射用水溶解多糖并除菌注射用水溶解多糖并除菌注射用水稀释分装注射用水稀释分装成品成品伤寒伤寒ViVi荚膜多糖疫苗工艺流程荚膜多糖疫苗工艺流程检定项目检定项目检定指标检定指标固总测定固总测定蛋白含量蛋白含量10mg/g10mg/g核酸含量核酸含量20mg/g20mg/gO O乙酰基含量乙酰基含量2mmol/g2mmol/gKd Kd 值值0.250.25Kd

43、 Kd 值值0.250.25回收率回收率50%50%热原检查热原检查0.025g/kg0.025g/kg伤寒伤寒ViVi多糖疫苗检定项目及检定指标多糖疫苗检定项目及检定指标伤寒伤寒ViVi多糖疫苗的特点多糖疫苗的特点安全有效安全有效 副反应较菌体疫苗轻，但却副反应较菌体疫苗轻，但却 有其大致相同的免疫效果。有其大致相同的免疫效果。稳定性好稳定性好 即可以为液体制剂，也可以即可以为液体制剂，也可以 为冻干制品，耐热，易于运输与保存。为冻干制品，耐热，易于运输与保存。使用方便使用方便 注射一针，即可以有一定的注射一针，即可以有一定的 保护力，易于用理化方法标准化。保护力，易于用理化方法标准化。同其

44、他多糖疫苗一样对婴幼儿免疫效果同其他多糖疫苗一样对婴幼儿免疫效果 差。差。结合疫苗结合疫苗一、结合疫苗的特点一、结合疫苗的特点二、免疫机理二、免疫机理三、用于制备结合疫苗的多糖抗原三、用于制备结合疫苗的多糖抗原四、用于制备结合疫苗的蛋白载体四、用于制备结合疫苗的蛋白载体五、结合化学制备结合疫苗的主要要素五、结合化学制备结合疫苗的主要要素六、结合疫苗应具备的两个共同特征六、结合疫苗应具备的两个共同特征七、结合疫苗的使用和发展现状七、结合疫苗的使用和发展现状八、结合疫苗的研究方向八、结合疫苗的研究方向九、存在问题九、存在问题一、结合疫苗的特点一、结合疫苗的特点1.1.抗原物质（多糖和蛋白质）经化学

45、共价结合形成抗原物质（多糖和蛋白质）经化学共价结合形成 了具有一定空间构象的结合物。了具有一定空间构象的结合物。抗原物质还包括多肽、甾族激素、脂肪胺、核苷抗原物质还包括多肽、甾族激素、脂肪胺、核苷 等小分子物质。等小分子物质。2.2.它能使多糖抗原的它能使多糖抗原的T T细胞非依赖性转化为细胞非依赖性转化为T T细胞依细胞依 赖性赖性,产生具有记忆特征的产生具有记忆特征的IgGIgG抗体抗体,提高多糖疫提高多糖疫苗的免疫原性和免疫持久性。苗的免疫原性和免疫持久性。3.3.能够在婴儿产生免疫应答。能够在婴儿产生免疫应答。二、免疫机理二、免疫机理1.1.胸腺非依赖性抗原（胸腺非依赖性抗原（TI-A

46、gTI-Ag）2.2.胸腺依赖性抗原（胸腺依赖性抗原（TD-AgTD-Ag）胸腺非依赖性抗原（胸腺非依赖性抗原（TI-AgTI-Ag）细菌脂多糖、荚膜多糖等。细菌脂多糖、荚膜多糖等。TI-AgTI-Ag分子结构呈长链，分子结构呈长链，O-O-乙酰基、丙酮酰基、糖苷键和乙酰基、丙酮酰基、糖苷键和 磷酸脂键等抗原表位重复排列而成簇，对每种表位来将磷酸脂键等抗原表位重复排列而成簇，对每种表位来将 可视为多价的，能与可视为多价的，能与B B细胞表面受体结合形成细胞表面受体结合形成“帽状现象帽状现象”。可单独触发可单独触发B B细胞产生抗体，不需细胞产生抗体，不需T T辅助性细胞辅助。辅助性细胞辅助。与

47、与TI-AgTI-Ag发生应答的是发生应答的是B B细胞的抗原识别受体细胞的抗原识别受体IgMIgM（B B细胞成细胞成 熟的标志），产生的抗体仅为熟的标志），产生的抗体仅为IgM,IgM,且抗体效价低、无且抗体效价低、无IgIg类类 型转换。型转换。不诱导细胞免疫应答，也不引起免疫记，即使再次采用相不诱导细胞免疫应答，也不引起免疫记，即使再次采用相 同抗原刺激也不能引起初次免疫应答，更无抗体亲和力成同抗原刺激也不能引起初次免疫应答，更无抗体亲和力成 熟过程熟过程。TI AgBIgM无记忆无记忆B B细胞（细胞（BmBm）形成，不产）形成，不产生加强应答，因而免疫原性弱。生加强应答，因而免疫原

48、性弱。B B细胞对（细胞对（TI-AgTI-Ag）应答特点）应答特点胸腺依赖性抗原（胸腺依赖性抗原（TD-AgTD-Ag）绝大多数天然抗原（蛋白质）都是绝大多数天然抗原（蛋白质）都是TD-AgTD-Ag。TD-Ag TD-Ag分子量大，结构复杂，表位种类多且不均匀分子量大，结构复杂，表位种类多且不均匀(就每就每 种表位而言它是单价的种表位而言它是单价的)。此类抗原含有此类抗原含有T T细胞和细胞和B B细胞决定簇，蛋白质通过单价表细胞决定簇，蛋白质通过单价表 位的相互作用与位的相互作用与B B细胞表面细胞表面IgMIgM受体结合，但不诱导受体结合，但不诱导“帽帽 状现象状现象”，不足以激活，不

49、足以激活B B细胞细胞,但被但被B B细胞胞饮、细胞胞饮、水解后水解后肽肽 表位与表位与T T细胞受体结合诱导细胞受体结合诱导THTH细胞产生细胞因子。细胞产生细胞因子。TD-AgTD-Ag需需THTH细胞产生细胞因子并激活细胞产生细胞因子并激活B2B2细胞产生抗体细胞产生抗体,浆浆 细胞在产生抗体中发生细胞在产生抗体中发生IgIg类型转换，合成类型转换，合成IgGIgG和和IgMIgM类抗类抗 体。体。形成记忆形成记忆BmBm细胞，当受到相同抗原再次刺激时引起再次细胞，当受到相同抗原再次刺激时引起再次 应答，而且抗体亲和力较初次应答明显提高。应答，而且抗体亲和力较初次应答明显提高。诱导体液免

50、疫应答，同时诱导细胞免疫应答。诱导体液免疫应答，同时诱导细胞免疫应答。TD-AgIgGIgMTH细胞细胞细胞因子细胞因子B2Bm停止分化停止分化记忆记忆B细胞（细胞（Bm）形成，产生加）形成，产生加强应答，增强免疫原性。强应答，增强免疫原性。B B细胞对（细胞对（TD-AgTD-Ag）应答特点）应答特点多糖多糖蛋白质结合物（蛋白质结合物（TD-AgTD-Ag）将多糖分子与蛋白质共价结合，由于蛋白质将多糖分子与蛋白质共价结合，由于蛋白质 抗原激活抗原激活THTH细胞，能诱导细胞，能诱导THTH细胞产生细胞因子细胞产生细胞因子（如（如r-IFN,IL-2r-IFN,IL-2、4 4、5 5）并传递