碱性磷酸酶km值测定.ppt

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1、酶促反应动力学研究方法介绍EXPERIMENT 3 碱性磷酸酶km值测定实验目的n学习环境因素对酶促反应速度的影响；n学习米氏方程及Km值得测定；n测量碱性磷酸酶km值；实验原理 E的反应速度受到环境因素的影响，这些因素包括底物浓度、E浓度、PH、温度、激活剂、抑止剂等（一）米曼氏方程式中间产物中间产物 酶促反应模式酶促反应模式中间产物学说中间产物学说E+S k1k2k3ESE+P相关E学原理1913191319131913年年年年MichaelisMichaelisMichaelisMichaelis和和和和MentenMentenMentenMenten提提提提出出出出反反反反应应应应速速

2、速速度度度度与与与与底底底底物物物物浓浓浓浓度度度度关关关关系系系系的的的的数数数数学学学学方方方方程程程程式式式式，即即即即米米米米曼曼曼曼氏氏氏氏方方方方程程程程式式式式(Michaelis equation)(Michaelis equation)(Michaelis equation)(Michaelis equation)。S：底物浓度底物浓度V：不同不同S时的反应速度时的反应速度Vmax：最大反应速度最大反应速度(maximum velocity)m：米氏常数米氏常数(Michaelis constant)VmaxS Km+S 米曼氏方程式推导基于两个假设：米曼氏方程式推导基于两个

3、假设：(1)(1)E E与与S S形成形成ESES复合物的反应是快速平衡反应，而复合物的反应是快速平衡反应，而ESES分解分解为为E E及及P P的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即 V Vk k3 3ESES。(2)(2)S S的总浓度远远大于的总浓度远远大于E E的总浓度，因此在反应的初始的总浓度，因此在反应的初始阶段，阶段，S S的浓度可认为不变即的浓度可认为不变即SSSSt t。推导过程推导过程n稳态：稳态：是指是指ES的生成速度与分解速度相等，即的生成速度与分解速度相等，即 ES恒定。恒定。K1(EtES)SK2 ES+K3 ESK2+K3 K

4、m（米氏常数）（米氏常数）K1令：令：则则(2)(2)变为变为:(EtES)S Km ES(2)(EtES)SK2+K3ES K1整理得：整理得：当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即即EtES，反应达最大速度反应达最大速度VmaxK3ESK3Et (5)ES EtSKm+S(3)整理得整理得:将将(5)(5)代入代入(4)(4)得米氏方程式：得米氏方程式：VmaxS Km+S V 将将(3)(3)代入代入(1)(1)得得K3EtS Km+S(4)V当反应速度为最大反应速度一半时当反应速度为最大反应速度一半时v Km值的推导KmS K Km m值

5、等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是底物浓度，单位是mol/Lmol/L。2Km+S Vmax VmaxSV VmaxmaxV VSSKKmmV Vmaxmax/2 /2 （二）（二）K Km m与与V Vmaxmax的意义的意义 K Km m值值 K Km m等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。度。意义：意义：a)a)K Km m是酶的特征性常数之一；是酶的特征性常数之一；b)b)K Km m可近似表示酶对底物的亲和力；可近似表示酶对底物的亲和力；c)c)同一酶对于不同底物有不同

6、的同一酶对于不同底物有不同的KmKm值。值。V Vmaxmax定义：定义：V Vm m是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。成正比。意义：意义：V Vmaxmax=K=K3 3 EE如果酶的总浓度已知，可从如果酶的总浓度已知，可从V Vmaxmax计算计算 酶的酶的转换数转换数(turnover number)(turnover number)，即动力学常数，即动力学常数K K3 3。定义定义定义定义 当酶被底物充分饱和时，单位时间当酶被底物充分饱和时，单位时间当酶被底物充分饱和时，单位时间当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子催化底物转变

7、为产物的内每个酶分子催化底物转变为产物的内每个酶分子催化底物转变为产物的内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。分子数。分子数。分子数。意义意义意义意义 可用来比较每单位酶的催化能力。可用来比较每单位酶的催化能力。可用来比较每单位酶的催化能力。可用来比较每单位酶的催化能力。酶的转换数酶的转换数（三）（三）m m值与值与maxmax值的测定值的测定双倒数作图法双倒数作图法(double reciprocal plot)(double reciprocal plot)-1/Km 1/V 1/Vmax max 1/S 1/S 1/V 1/V V VmaxmaxS S KKmm+S+SV=V=林林-贝

8、氏贝氏(Lineweaver-Burk)(Lineweaver-Burk)方程方程+1/V=1/V=KKmmV Vmax max 1/V1/Vmax max 1/S 1/S 两边同取倒数两边同取倒数 HanesHanes作图法作图法S S S/V S/V -Km K Kmm/V/Vm m 在林贝氏方程基础上，两边同乘在林贝氏方程基础上，两边同乘SSS/V=KS/V=Kmm/V/Vmax max+S/V+S/Vmax max 酶浓度对反应速度的影响酶浓度对反应速度的影响当当SE，酶酶可可被被底底物物饱饱和和的的情情况况下下，反反应应速度与酶浓度成正比。速度与酶浓度成正比。关系式为：关系式为：V=

9、K3 E0 V E 当当SE时，时，Vmax=k3 E 酶浓度对反应速度的影响酶浓度对反应速度的影响 q双重影响温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度降低 。温度对反应速度的影响q最适温度(optimum temperature)：酶促反应速度最快时的环境温度。*低温的应用酶酶活活性性0.51.02.01.50 10 20 30 40 50 60 温度温度 C 温度对淀粉酶活性的影响 pH对反应速度的影响q最适pH (optimum pH)：酶催化活性最大时的环境pH。0酶酶活活性性 pH pH对某些酶活性的影响 胃蛋白酶胃蛋白酶 淀粉酶淀粉酶

10、 胆碱酯酶胆碱酯酶 246810碱性磷酸酶km值的测定 以不同浓度的磷酸苯二钠作为碱性磷酸酶的底物，在最适条件下，37)，准确反应15min。在碱性条件下产物酚可以与酚试剂作用生成蓝色化合物，该蓝色化合物在650nm波长比色，色泽深浅与光密度成正比。反应式如下：然后，以吸光度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度，即以吸光度的倒数作纵坐标以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法求出Km值。n1酚试剂n2L磷酸苯二钠基质液 n3碱性缓冲液(pH-10.0)n4碱性磷酸酶液【试剂】称取磷酸苯二钠635mg，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，加氯仿数滴以防腐，置于冰箱中可保存1年

11、之久。称取无水Na2CO3 和NaHcO3，先以适量蒸馏水溶解，再定容至1000ml。称取碱性磷酸酶lmg，加水34ml，置于冰箱可保存5周左右。操作试剂试剂（mlml）1234562.5mM2.5mM磷酸苯二钠磷酸苯二钠0.20.40.60.81.01.0蒸馏水蒸馏水0.80.60.40.2碱性缓冲液碱性缓冲液1.01.01.01.01.01.0混匀后，37水浴5min碱性磷酸酶碱性磷酸酶0.10.10.10.10.1混匀后，37水浴15min(准确计时）酚试剂酚试剂1.01.01.01.01.01.0碱性磷酸酶碱性磷酸酶0.110%10%碳酸钠碳酸钠3.03.03.03.03.03.0混匀后，37水浴15min,以第6管调0与650nm比色，读取各管A值。实验数据及结果管号管号A6501/A650s1/s123456以上述数据双倒数作图，求出碱性磷酸酶的Km值。nKm值的定义和意义是什么？n米氏方程度表达式是什么，如何求出Vmax和Km？【实验讨论】加入碱性磷酸酶液的量要准确，否则误差较大。保湿时间要准确。【注意事项】