醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白.ppt

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1、醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白【实验目的】【实验目的】1、了解电泳的一般原理、掌握醋酸纤维素了解电泳的一般原理、掌握醋酸纤维素薄膜电泳操作技术；薄膜电泳操作技术；2、掌握醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白的、掌握醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白的方法。方法。实验六实验六【实验原理实验原理】由于各种血清蛋白质的等电点不同，由于各种血清蛋白质的等电点不同，因此在的缓冲液中，各种血清蛋白质所带因此在的缓冲液中，各种血清蛋白质所带电荷量不同，同时由于它们的相对分子质电荷量不同，同时由于它们的相对分子质量也不同，造成电泳迁移率不同，所以在量也不同，造成电泳迁移率不同，所以在醋酸纤维薄膜上

2、电泳后，可将各种血清蛋醋酸纤维薄膜上电泳后，可将各种血清蛋白质分离开。白质分离开。血血清清中中含含有有清清蛋蛋白白，-球球蛋蛋白白、-球球蛋蛋白白、-球球蛋蛋白白和和各各种种脂脂蛋蛋白白等等。各各种种蛋蛋白白质质由由于于氨氨基基酸酸组组分分、立立体体构构象象、分分子子量量、等等电电点点及及形形状状不不同同，在在电电场场中中迁迁移移速速度度不不同同。分分子子量量小小、等等电电点点低低、在在相相同同碱碱性性PHPH值值缓缓冲冲体体系系中中，带带负负荷荷电电荷荷多多的的蛋蛋白白质质颗颗粒粒在在电电场中迁移速度快。场中迁移速度快。例例如如，以以醋醋酸酸纤纤维维素素薄薄膜膜为为支支持持物物，正正常常人人

3、血血清清在在的的缓缓冲冲体体系系中中电电泳泳1h1h左左右右，染染色色后后可可显显示示5 5条条区区带带。清清蛋蛋白白泳泳动动最最快快，其其余余依依次次为为1 1-、2 2-、-及及-球蛋白（如图球蛋白（如图3-53-5）。）。图图3-53-5正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图1 1为清蛋白，为清蛋白，2 2，3 3，4 4，5 5分别分别1 1-，2 2-，-及及-球蛋白，球蛋白，6 6为点样原点为点样原点 这这些些区区带带经经洗洗脱脱后后可可用用分分光光光光度度法法定定量量，也也可可直直接接进进行行光光吸吸收收扫扫描描自自动动绘绘出出区区带带吸收峰及相对百

4、分比。吸收峰及相对百分比。此此法法由由于于操操作作简简单单，快快速速，分分辨辨率率高高及及重重复复性性好好等等优优点点。它它不不仅仅可可用用于于分分离离血血清清蛋蛋白白，还还可可用用于于分分离离脂脂蛋蛋白白、血血红红蛋蛋白及同工酶的分离测定。白及同工酶的分离测定。【实验材料实验材料】1电泳仪电泳仪 包括直流电源整流器和包括直流电源整流器和电泳槽两个部分。电泳槽两个部分。2醋酸纤维素薄膜。醋酸纤维素薄膜。试试剂剂4 4 试剂试剂 巴巴比比妥妥-巴巴比比妥妥钠钠缓缓冲冲液液(pH8.6,(pH8.6,0.07mol/L,0.07mol/L,离离子子强强度度0.06)0.06)称称取取巴巴比比妥妥（

5、ARAR）和和巴巴比比妥妥钠钠（ARAR），置置于于三三角角烧烧瓶瓶中中，加加蒸蒸馏馏水水约约600mL600mL，稍稍加加热热溶溶解解，冷冷却却后后用用蒸蒸馏馏水水定定容容至至1000mL1000mL。置置40C40C保存，备用。保存，备用。血清蛋白染色血清蛋白染色染染色色液液（0.5%0.5%氨氨基基黑黑10B10B）：称称取取氨氨基基黑黑10B10B，加加蒸蒸 馏馏 水水 40mL40mL，甲甲 醇醇（ARAR）50mL50mL，冰冰 乙乙 酸酸（ARAR）10mL10mL，混匀溶解后置具寒试剂瓶内贮存。，混匀溶解后置具寒试剂瓶内贮存。漂漂 洗洗 液液：取取 95%95%乙乙 醇醇（AR

6、AR）45mL45mL，冰冰 乙乙 酸酸（ARAR）5mL5mL和和蒸蒸馏馏水水50mL50mL，混混匀匀置置具具塞塞试试剂剂瓶瓶中中贮存。贮存。透明液：临用前配制。透明液：临用前配制。甲甲液液：取取冰冰乙乙酸酸（ARAR）15mL15mL，无无水水乙乙醇醇（ARAR）85mL85mL，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。乙乙液液：取取冰冰乙乙酸酸（ARAR）25mL25mL，无无水水乙乙醇醇（ARAR）75mL75mL，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。保存液：液体石蜡。保存液：液体石蜡。定量洗脱液（定量洗脱液（溶液）：溶液）：称

7、称取取16g16g氢氢氧氧化化钠钠（ARAR）用用少少量量蒸蒸馏馏水水溶溶解解后后定定容容至至1000ml1000ml。【实验方法与步骤】实验方法与步骤】4 4 实验方法实验方法与步骤与步骤 仪器与仪器与薄膜的准备薄膜的准备1 1、仪器与薄膜的准备、仪器与薄膜的准备 醋酸纤维素薄膜的润湿与选择醋酸纤维素薄膜的润湿与选择用用竹竹夹夹子子取取一一片片薄薄膜膜，小小心心地地平平放放在在盛盛有有缓缓冲冲液液的的平平皿皿中中，若若漂漂浮浮于于液液面面的的薄薄膜膜在在15-30s15-30s内内迅迅速速润润湿湿，整整条条薄薄膜膜色色泽泽深深浅浅一一致致，则则此此膜膜均均匀匀可可用用于于电电泳泳；若若薄薄膜

8、膜润润湿湿缓缓慢慢，色色泽泽深深浅浅不不一一或或有有条条纹纹及及斑斑点点等等，则则表表示示薄薄膜膜厚厚薄薄不不均均匀匀应应弃弃去去，以以免影响电泳结果。免影响电泳结果。将将选选好好的的薄薄膜膜用用竹竹子子轻轻压压，使使其其完完全全浸浸泡泡于于缓缓冲冲液中约液中约30min30min后，方可用于电泳。后，方可用于电泳。电泳槽的准备电泳槽的准备根据电泳槽膜支架的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条。根据电泳槽膜支架的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条。在在两两个个电电极极槽槽中中，各各倒倒入入等等体体积积的的电电极极缓缓冲冲液液，在在电电泳泳槽槽的的两两个个膜膜支支架架上上，各各放放两两层层滤滤纸纸条条，使使滤滤纸

9、纸一一端端的的长长边边与与支支架架前前沿沿对对齐齐，另另一一端端浸浸入入电电极极缓缓冲冲液液内内。当当滤滤纸纸条条全全部部润润湿湿后后，用用玻玻璃璃棒棒轻轻轻轻挤挤压压在在膜膜支支架架上上的的滤滤纸纸以以驱驱赶赶气气泡泡，使使滤滤纸纸的的一一端端能能紧贴在膜支架上。紧贴在膜支架上。滤滤纸纸条条是是两两个个电电极极槽槽联联系系醋醋酸酸纤纤维维素素薄薄膜膜的的桥桥梁梁，因因而而称称为为滤滤纸桥。纸桥。电极槽的平衡电极槽的平衡用平衡装置（或自制平衡管）连接两个电泳槽，使两个电极槽用平衡装置（或自制平衡管）连接两个电泳槽，使两个电极槽内的缓冲液彼此处于同一水平状态，一般需平衡内的缓冲液彼此处于同一水平

10、状态，一般需平衡15-20min15-20min。注。注意，取出平衡装置时应将活塞关紧。意，取出平衡装置时应将活塞关紧。点样点样2 2、点样、点样取取一一张张干干净净滤滤纸纸（1010cm1010cm），在在距距纸纸边边处处用用铅铅笔笔划一平行线，此线为点样标志区。划一平行线，此线为点样标志区。用用竹竹夹夹子子取取出出浸浸透透的的薄薄膜膜，夹夹在在两两层层滤滤纸纸间间以以吸吸去去多多余余的的缓缓冲冲液液。无无光光泽泽面面向向上上平平放放在在点点样样模模板板上上，使使其其底底边边与与模模板板底底边边对对齐齐。点点样样区区距距阴阴极极端端处处。点点样样时时，先先用用玻玻璃璃棒棒或或血血色色素素吸吸

11、管管取取2-3L2-3L血血清清，均均匀匀涂涂在在加加样样器器上上，再再将将点点样样器器轻轻轻轻印印在在点点样样区区内内，如如图图3-63-6所所示示，使使血血清清完完全全渗渗透透至至薄薄膜膜内内，形形成成一一定定宽宽度、粗细均匀的直线。度、粗细均匀的直线。此此步步是是实实验验的的关关键键，点点样样前前应应在在滤滤纸纸上上反反复复练练习习，掌握点样技术后再正式点样。掌握点样技术后再正式点样。图图3-6 3-6 醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（虚线处为点样位置）（虚线处为点样位置）电泳电泳3 3、电泳电泳用用竹竹夹夹子子将将点点样样端端的的薄薄膜膜平平贴贴在

12、在阴阴极极电电泳泳槽槽支支架架的的滤滤纸纸桥桥上上（点点样样面面朝朝下下），另另一一端端平平贴贴在在阳阳极极端端支支架架上上，如如图图3-73-7所所示示，要要求求薄薄膜膜紧紧贴贴滤滤纸纸桥桥并并绷绷直直，中中间间不不能能下下垂垂。如如一一电电泳泳槽槽中中同同时时安安放放几几张张薄薄膜膜，则则薄薄膜膜之之间间应应相相隔隔几几毫毫米米。盖盖上上电电泳泳槽槽盖盖，使使薄薄膜膜平衡平衡10min10min。用用导导线线将将电电泳泳槽槽的的正正、负负极极与与电电泳泳仪仪的的正正、负负极极分分别别连连接接，注注意意不不要要接接错错。在在室室温温下下电电泳泳，打打开开电电源源开开关关，用用电电泳泳仪仪上上

13、细细调调节节旋旋扭扭调调到到每每厘厘米米膜膜宽宽电电流流强强度度为为（8 8片片薄薄膜膜则则为为）。通通电电10-15min10-15min后后，将将电电流流调调节节到到每每厘厘米米膜膜宽宽电电流流强强度度为为（8 8片片共共8mA8mA），电电泳泳时时间间约约50-80min50-80min。电电泳泳后后调调节节旋旋扭扭使使电电流流为为零零，关关闭电泳仪切断电源。闭电泳仪切断电源。图图3-7 3-7 电泳装置剖视示意图电泳装置剖视示意图 1.1.纸桥纸桥 2.2.电泳槽电泳槽 3.3.醋酸纤维素薄膜醋酸纤维素薄膜 4.4.电泳槽膜支架电泳槽膜支架 5.5.电极室中央隔板电极室中央隔板 染色与

14、漂染色与漂洗（血清蛋洗（血清蛋白染色与漂白染色与漂洗脱色）洗脱色）4 4、染色与漂洗（血清蛋白染色与漂洗脱色）、染色与漂洗（血清蛋白染色与漂洗脱色）用用解解剖剖镊镊子子取取出出电电泳泳后后的的薄薄膜膜，放放在在含含0.5%0.5%氨氨基基黑黑10B10B染染色色液液的的培培养养皿皿中中，浸浸染染5min5min，取取出出后后再用漂洗液浸洗脱色，每隔再用漂洗液浸洗脱色，每隔10min10min换换漂漂洗洗液一次，连续数次，直至背景蓝色脱尽。液一次，连续数次，直至背景蓝色脱尽。取取出出薄薄膜膜放放在在滤滤纸纸上上，用用吹吹风风机机的的冷冷风风将将薄薄膜膜吹干。吹干。图图 3-8 3-8 血清蛋白与

15、脂蛋白醋酸纤维素薄膜电泳血清蛋白与脂蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱比较示意图图谱比较示意图a.a.蛋白染色蛋白染色 b.b.脂蛋白染色脂蛋白染色 结果结果判断与判断与定量定量6 6、结果判断与定量、结果判断与定量一一般般血血清清蛋蛋白白电电泳泳经经蛋蛋白白染染色色后后，可可显显示示5 5条条区区带带，其其排排列列顺顺序序见见图图3-8a3-8a，未未经经透透明明处处理理的的电电泳泳图谱可直接用于定量测定。图谱可直接用于定量测定。可可采采用用洗洗脱脱法法或或光光吸吸收收扫扫描描法法，测测定定各各蛋蛋白白组组分分相对百分含量。相对百分含量。本本实实验验不不要要求求进进行行定定量量分分析析，如如有有需需

16、要要，可可采采用用薄薄层层扫扫描描仪仪进进行行扫扫描描定定量量，或或采采用用洗洗脱脱后后再再进进行行比比色色的的方方法法进进行定量。下面为后者的具体操作步骤：行定量。下面为后者的具体操作步骤：取取试试管管6 6支支，编编好好号号码码，分分别别用用吸吸管管取取0.4N0.4N氢氢氧氧化化钠钠4ml4ml，剪剪开开薄薄膜膜上上各各条条蛋蛋白白色色带带，另另于于空空白白部部位位剪剪一一平平均均大大小小的的薄薄膜膜条条，将将各各条条分分别别浸浸于于上上述述试试管管内内，不不时时摇摇动动，使使蓝蓝色色洗洗出出。约约半半小小时时后后，用用分分光光光光度度计计进进行行比比色色，波波长长用用650nm650n

17、m，以以空空白白薄薄膜膜条条洗洗出出液液为为空空白白对对照照，读读取取白白蛋蛋白白A A、11、22、球蛋白各管的光密度。球蛋白各管的光密度。光密度总和光密度总和T TA+A+1 12 2各部分蛋白质的分数为：各部分蛋白质的分数为：A A（清蛋白）（清蛋白）%=A/T100%=A/T100 1 1-球蛋白球蛋白%=%=1 1/T100/T100 2 2-球蛋白球蛋白%=%=2 2/T100/T100 -球蛋白球蛋白%=%=/T100/T100 -球蛋白球蛋白%=%=/T100/T100附附：迁迁移移率率是是胶胶体体颗颗粒粒的的一一个个物物理理常常数数，可可用用来来鉴鉴定定蛋蛋白白质质等等物物质

18、质以以及及研研究究它它们们的的某某些些理理化化性性质质现现将将人人血血浆浆蛋蛋白白质质的等电点，迁移率等列于下表，供分析参考。的等电点，迁移率等列于下表，供分析参考。蛋白质名称蛋白质名称等电点等电点泳动脉泳动脉/(cm/(cm2 2V V-1-1S S-1 1)分子量分子量清蛋白清蛋白4.884.88-5.910-5-5.910-569000690001-1-球蛋白球蛋白 5.065.06-5.110-5-5.110-52000002000002-2-球蛋白球蛋白5.065.06-4.110-5-4.110-5300000300000-球蛋白球蛋白5.125.12-2.810-5-2.810-

19、59000-1500009000-150000-球蛋白球蛋白6.85-7.506.85-7.50-1.010-5-1.010-5156000-300000156000-300000纤维蛋白元纤维蛋白元5.405.40-3.110-5-3.110-5 正常值：白蛋白正常值：白蛋白575772%72%1 1球蛋白球蛋白2 25 5 2 2球蛋白球蛋白4 49 9 球蛋白球蛋白6.56.51212 球蛋白球蛋白12122020表表3-12 3-12 人血浆蛋白质的等电及迁移率人血浆蛋白质的等电及迁移率备注备注 备注：备注：醋醋酸酸纤纤维维薄薄膜膜电电泳泳分分析析血血清清蛋蛋白白的的正正常常结结果果不

20、不同同于于纸纸上上电电泳泳，主主要要是是白白蛋蛋白白偏偏高高，个个别别正正常常人人白白蛋蛋白白仅仅超超过过7070。-，-，和和，都都偏偏低低，个个别别正正常常人人球球蛋蛋臼臼可低到可低到1212左右。上述正常值仅供参考。左右。上述正常值仅供参考。经经电电泳泳，染染色色之之干干燥燥膜膜浸浸于于冰冰醋醋酸酸：9595乙乙醇醇（2:82:8）溶溶液液中中2020分分钟钟，取取出出后后将将薄薄膜膜平平贴贴于于玻玻璃璃板板上上。干干燥燥过过程程中中，薄薄膜膜渐渐变变透透明明。此此透透明明薄薄膜膜可可用用扫扫描描光光密密度度计计绘绘出出电电泳泳曲曲线线，并并可可根根据据曲曲线线的的面面积积计计算算各各组

21、组分分的的百百分分数数。目目前前国国内内已已有有自自动动定定量量的的光光密密度度计计生生产产。此此透透明明薄薄膜膜可可长期保存，供教学示教用。长期保存，供教学示教用。【注意事项注意事项】5 注意事项注意事项 醋酸纤维醋酸纤维素薄膜的预素薄膜的预处理处理 醋酸纤维素薄膜的预处理醋酸纤维素薄膜的预处理薄薄膜膜的的浸浸润润与与选选膜膜是是电电泳泳成成败败的的重重要要关关键键之之一一。将将干干膜膜片片漂漂浮浮于于电电极极缓缓冲冲液液表表面面，其其目目的的是是选选择择膜膜片片厚厚薄薄及及均均匀匀度度，如如漂漂浮浮15-30s15-30s时时，膜膜片片吸吸水水不不均均匀匀，则则有有白白色色斑斑点点或或条条

22、纹纹，这这提提示示膜膜片片厚厚薄薄不不均均，应应弃弃去去不不用用，以以免免造造成成电电泳泳后后区区带带扭曲，界线不清，背景脱色困难，结果难以重复。扭曲，界线不清，背景脱色困难，结果难以重复。点点样样时时，应应将将膜膜片片表表面面多多余余的的缓缓冲冲液液用用滤滤纸纸吸吸去去，以以免免缓缓冲冲液液太太多多引引起起样样品品扩扩散散。但但也也不不能能吸吸得得太太干干，太太干干则则样样品品不不易易进进入入薄薄膜膜的的网网孔孔内内，而而造造成成电电泳泳起起始始点点参参差差不不齐齐，影影响响分分离离效效果果。吸吸水水量量以以不不干干不不湿湿为为宜宜。为为防防止止指指纹纹污污染染，取膜时，应戴指套或用夹子。取

23、膜时，应戴指套或用夹子。缓冲液的缓冲液的选择选择 缓冲液的选择缓冲液的选择醋醋酸酸纤纤维维素素薄薄膜膜电电泳泳常常选选用用巴巴比比妥妥缓缓冲冲液液，其其浓浓度度为为。选选择择何何种种浓浓度度与与样样品品及及薄薄膜膜的的厚厚薄薄有有关关。在在选选择择时时，先先初初步步定定下下某某一一浓浓度度，如如电电泳泳槽槽两两极极之之间间的的膜膜长长度度为为8-10cm8-10cm，则则需电压需电压25V/cm25V/cm膜长，电流强度为膜长，电流强度为膜宽。膜宽。当当电电泳泳时时达达不不到到或或超超过过这这个个值值时时，则则应应增增加加缓缓冲冲液液浓浓度度或或进进行行稀稀释释。缓缓冲冲液液浓浓度度过过低低，

24、则则区区带带泳泳动动速速度度快快，并并由由于于扩扩散散变变宽宽；缓缓冲冲液液浓浓度度过过高高，则则区区带带泳泳动动速速度度慢慢，区区带带分分布过于集中，不易分辨。布过于集中，不易分辨。加样加样量量 加样量加样量加加样样品品量量的的多多少少与与电电泳泳条条件件、样样品品的的性性质质、染染色色方方法法与与检检测测手手段段灵灵敏敏度度密密切切相相关关。作作为为一一般般原原则则，检检测测方方法法越越灵灵敏敏，加加样样量量则则越越少少，对对分分离离更更有有利利。如如加加样样量量过过大大，则则电电泳泳后后区带分离不清楚，甚至互相干扰，染色也较费时。区带分离不清楚，甚至互相干扰，染色也较费时。如如电电泳泳后

25、后用用洗洗脱脱法法定定量量时时，每每厘厘米米加加样样线线上上需需加加样样品品，相相当当于于5-1000g5-1000g的的蛋蛋白白，血血清清蛋蛋白白常常规规电电泳泳分分离离时时，每每厘厘米米加加样样线线加加样样量量不不超超过过1L1L，相相当当于于6080g6080g的的蛋蛋白白质质。但但糖糖蛋蛋白白和和脂脂蛋蛋白白电电泳泳时时，加加样样量量则则应应多多些些。对对每每种种样样品品加加样量均应先作预实验加以选择。样量均应先作预实验加以选择。点点样样好好坏坏是是获获得得理理想想图图谱谱的的重重要要环环节节之之一一，以以印印章章法法加加样样时时，动动作作应应轻轻、稳稳，用用力力不不能能太太重重，以以

26、免免将将薄薄膜膜弄弄破破或或印印出凹陷而影响电泳区带分离效果。出凹陷而影响电泳区带分离效果。电量的电量的选择选择 电量的选择电量的选择电电泳泳过过程程应应选选择择合合适适的的电电流流强强度度，一一般般电电流流强强度度为为宽膜为宜。宽膜为宜。电电流流强强度度高高，则则热热效效应应高高，尤尤其其在在温温度度较较高高的的环环境境中中，可可引引起起蛋蛋白白变变性性或或由由于于热热效效应应引引起起缓缓冲冲液液中中水水分分蒸蒸发发，使使缓缓冲冲液液浓浓度度增增加加，造造成成膜膜片片干干涸涸。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。染色液染色液的选择的选择 染色液的选择染色液

27、的选择对对醋醋酸酸纤纤维维素素薄薄膜膜电电泳泳后后染染色色应应根根据据样样品品的的特特点点加加以以选选择择。其其原原则则是是染染料料对对被被分分离离样样品品有有较较强强的的着着色色力力，背背景景易易脱脱色色；应应尽尽量量采采用用水水溶溶性性染染料料，不不宜宜选选择择醇醇溶溶性性染染料料，以以免免引引起起醋醋酸酸纤纤维维素素薄薄膜膜溶解。溶解。应应控控制制染染色色时时间间。时时间间长长，薄薄膜膜底底色色深深不不易易脱脱去去；时时间间太太短短，着着色色浅浅不不易易区区分分，或或造造成成条条带带染染色色不不均匀，必要时可进行复染。均匀，必要时可进行复染。透明透明及保存及保存 透明及保存透明及保存透透

28、明明液液应应临临用用前前配配制制，以以免免冰冰乙乙酸酸及及乙乙醇醇挥挥发发而而影影响响透透明明效效果果。这这些些试试剂剂最最好好选选用用分分析析纯纯。透透明明前前，薄薄膜膜应应完完全全干干燥燥。透透明明时时间间应应掌掌握握好好，如如在在透透明明乙乙液液中中浸浸泡泡时时间间太太长长则则薄薄膜膜溶溶解解，太太短短则则透透明度不佳。明度不佳。透透明明后后的的薄薄膜膜完完全全干干燥燥后后才才能能浸浸入入液液体体石石蜡蜡中中，使使薄薄膜膜软软化化。如如有有水水，则则液液体体石石蜡蜡不不易易浸浸入入，薄薄膜不易展平。膜不易展平。【实验方法实验方法】1准备与点样准备与点样(1)将薄膜切成将薄膜切成2.5 c

29、m8 cm的小片。在薄膜无光的小片。在薄膜无光泽面泽面(正面正面)的一端约的一端约2 cm处用硬铅笔划一点样线。处用硬铅笔划一点样线。(2)将薄膜无光泽面向下，置巴比妥缓冲中，将薄膜无光泽面向下，置巴比妥缓冲中，使使膜条自然浸湿膜条自然浸湿。(3)将充分浸透的膜条取出，用滤纸吸去多余的缓将充分浸透的膜条取出，用滤纸吸去多余的缓冲液，把膜条置洁净滤纸上。冲液，把膜条置洁净滤纸上。(4)用载玻片点样。用载玻片点样。2电泳电泳 将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时，将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时，无光泽面无光泽面(即点样面即点样面)向下，点样端置于阴极，槽向下，点样端置于阴极，槽架上以四层滤纸

30、作桥垫，膜条与滤纸需贴紧，待架上以四层滤纸作桥垫，膜条与滤纸需贴紧，待平衡平衡5 min后通电，电压为后通电，电压为110 V，电流为，电流为0.6 mA/cm，通电，通电1 h左右关闭电源。左右关闭电源。3染色染色 通电完毕后用镊子将薄膜取出，直接通电完毕后用镊子将薄膜取出，直接浸于氨基黑浸于氨基黑10B的染色液中，染的染色液中，染5 min取出，取出，立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净为止。用滤纸吸干洗数次，直至背景漂净为止。用滤纸吸干薄膜。薄膜。4定量定量 本实验不要求进行定量分析，如有需要，可本实验不要求进行定量分析，如有需要，

31、可采用薄层扫描仪进行扫描定量，或采用洗脱后再采用薄层扫描仪进行扫描定量，或采用洗脱后再进行比色的方法进行定量。下面为后者的具体操进行比色的方法进行定量。下面为后者的具体操作步骤：作步骤：取试管取试管6支，编好号码，分别用吸管取支，编好号码，分别用吸管取0.4 mol/L氢氧化钠氢氧化钠4 ml，剪开薄膜上各条蛋白色带，剪开薄膜上各条蛋白色带，另于空白部位剪一平均大小的薄膜条，将各条分另于空白部位剪一平均大小的薄膜条，将各条分别浸于上述试管内，不时摇动，使蓝色洗出。约别浸于上述试管内，不时摇动，使蓝色洗出。约0.5 h后，用分光光度计进行比色，波长用后，用分光光度计进行比色，波长用650 nm，

32、以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取白，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取白蛋白蛋白A，1，2，球蛋白各管的吸光度。球蛋白各管的吸光度。5计算计算吸光度吸光度 TA12各部分蛋白质的百分含量为：各部分蛋白质的百分含量为：白蛋白（白蛋白（A/T）1001球蛋白（球蛋白（1/T）1002球蛋白（球蛋白（2/T）100球蛋白（球蛋白（/T）100球蛋白（球蛋白（/T）100【实验思考实验思考】1电泳时，点样端置于电场的正极还是负电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？为什么？极？为什么？2电泳后，泳动在最前面的是何种蛋白质电泳后，泳动在最前面的是何种蛋白质？各谱带为何种成分？请分析原因。？各谱带为何种成分？请分析原因。