DNA的粗提取与鉴定_实验报告.ppt

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1、DNADNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定 一、基础知识一、基础知识（一）提取（一）提取DNADNA的的方法方法1 1、提取生物大分子的基本思路、提取生物大分子的基本思路选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子或化学性质的生物大分子2 2、提取、提取DNADNA的基本思路的基本思路利用利用DNADNA与与RNARNA、蛋白质和脂质等在物理和化蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取学性质方面的差异，提取DNADNA，去除其他成分去除其他成分3 3、DNADNA的溶解性的溶解性DNADNA和和蛋白质等其他成分蛋白质等其他成分在不同

2、浓度的在不同浓度的NaClNaCl溶溶液中溶解度不同液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使盐浓度就能使DNADNA充分溶解，而使杂质沉淀，充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反或者相反根根根根据据据据DNADNADNADNA在在在在NaClNaClNaClNaCl溶溶溶溶液液液液中中中中的的的的溶溶溶溶解解解解度度度度曲曲曲曲线线线线图图图图，思思思思考考考考在在在在什什什什么么么么浓浓浓浓度度度度下下下下，DNADNADNADNA的的的的溶溶溶溶解解解解度度度度最最最最小小小小？DNADNADNADNA在在在在NaClNaClNaClNaCl溶溶溶溶液液液液

3、中中中中的的的的溶溶溶溶解解解解度度度度是是是是如何变化的如何变化的如何变化的如何变化的？DNA在在NaClNaCl溶液中的溶解度曲线图溶液中的溶解度曲线图溶液中的溶解度曲线图溶液中的溶解度曲线图在在 NaClNaCl溶溶 液液 浓浓 度度 低低 于于0.14 0.14 mol/Lmol/L时时，DNADNA的的溶溶解解度度随随NaClNaCl溶溶液液浓浓度度的的增增加加而而逐逐渐渐降降低低；在在0.14 0.14 mol/Lmol/L时时，DNADNA溶溶解解度度最最小小；当当NaClNaCl溶溶液液浓浓度度继继续续增增加加时时，DNADNA的的溶溶解度又逐渐增大。解度又逐渐增大。如如如如何

4、何何何通通通通过过过过控控控控制制制制NaClNaClNaClNaCl溶溶溶溶液液液液的的的的浓浓浓浓度度度度使使使使DNADNADNADNA在在在在盐盐盐盐溶溶溶溶液液液液中中中中溶溶溶溶解解解解或或或或析析析析出？出？出？出？当当氯氯化化钠钠的的物物质质的的量量浓浓度度为为 2 2 molmolL L时时，DNADNA的的溶溶解解度度最最大大，浓浓度度为为 0 014 14 molmolL L时时，DNADNA的的溶溶解解度度最最低低。利利用用这这一一原原理理，可可以以使使DNADNA在在盐盐溶溶液中溶解或析出。液中溶解或析出。DNADNA不不溶溶于于酒酒精精溶溶液液，但但是是细细胞胞中中

5、的的某某些些物物质质则则可可以以溶溶于于酒酒精精。利利用用这这一一原原理理，可可以以将将DNADNA与蛋白质进一步分离与蛋白质进一步分离4 4、DNADNA在在酒精溶液中的酒精溶液中的溶解性溶解性5 5、DNADNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解蛋白质，但是对蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNADNA没有影响没有影响大多数蛋白质不能忍受大多数蛋白质不能忍受60608080的高温，而的高温，而DNADNA在在8080以上才会变性以上才会变性洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和去除脂质和蛋白质蛋白质,但对但对DNADNA没有影响没有影响6

6、6、DNADNA的鉴定的鉴定DNADNA与与二苯胺（沸水浴）二苯胺（沸水浴）会染成会染成蓝色蓝色，因此，因此，二苯胺可以作为鉴定二苯胺可以作为鉴定DNADNA的试剂的试剂 二、实验设计二、实验设计（一）实验材料的选取（一）实验材料的选取 1 1、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取2 23 3种实验材料）种实验材料）2 2、原则：凡是含有、原则：凡是含有DNADNA的生物材料都可以考的生物材料

7、都可以考虑，但选用虑，但选用DNADNA含量相对较高的生物组织，成功含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大的可能性更大动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻璃棒搅拌，过，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可滤后收集滤液即可（二）破碎细胞，获取含（二）破碎细胞，获取含DNADNA的滤液的滤液1 1、动物细胞、动物细胞答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加

8、速了鸡血细胞的破裂加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出，从而释放出DNADNA讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜细胞膜2 2、植物细胞、植物细胞讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于有利于DNADNA的释放；食盐的主要成分是的释放；食盐的主要成分是NaClNaCl，有利于有利于DN

9、ADNA的溶解的溶解实例：提取洋葱实例：提取洋葱DNADNA时，在切碎的洋葱中加时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行从分的搅拌和研入一定的洗涤剂和食盐，进行从分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液磨，过滤后收集研磨液答：研磨不充分会使细胞核内的答：研磨不充分会使细胞核内的DNADNA释放不完全，释放不完全，提取的提取的DNADNA量变少，影响实验结果，导致看不到量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？的影响？（三）去除滤液中的杂质（三）

10、去除滤液中的杂质为了纯化提取的为了纯化提取的DNADNA需要将滤液作进一步处理需要将滤液作进一步处理讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？成分？答：可能含有核蛋白、多糖和答：可能含有核蛋白、多糖和RNARNA等杂质等杂质讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的使提取的DNADNA与蛋白质分开；方案三利用的是与蛋白质分开；方案三利用的是DNADNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性

11、，与白质变性，与DNADNA分离分离（四）（四）DNADNA的的析出与鉴定析出与鉴定DNADNA的析出用的是与滤液体积相等的的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精冷却的酒精溶液（体积分数为溶液（体积分数为95 95），静置，静置2 23min3min，溶溶液中会出现液中会出现白色丝状物，白色丝状物，这就是粗提取这就是粗提取DNADNA。用用玻璃棒沿玻璃棒沿一个方向一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水吸取上面的水1 1、DNADNA的析出的析出2 2、DNADNA的鉴定的鉴定鉴定鉴定DNADNA时在试管中先加入物质的量的浓度为时在试管中先加入物质的量的浓度为2

12、mol/L 2mol/L 的的NaClNaCl溶液溶液5ml5ml于两只试管中，其中一于两只试管中，其中一只加入只加入DNADNA丝状物，各加入丝状物，各加入二苯胺二苯胺4ml 4ml 试剂。试剂。混合均匀后，将试管置于混合均匀后，将试管置于沸水中加热沸水中加热5min,5min,待试待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有看溶解有DNADNA的溶液是否有的溶液是否有蓝色蓝色鸡血细胞液中鸡血细胞液中鸡血细胞液中鸡血细胞液中DNADNA的粗提取实验流程图的粗提取实验流程图的粗提取实验流程图的粗提取实验流程图2mol/L2mol/L鸡血细胞液

13、中鸡血细胞液中鸡血细胞液中鸡血细胞液中DNADNA的粗提取实验流程图的粗提取实验流程图的粗提取实验流程图的粗提取实验流程图5 5、过滤、过滤、过滤、过滤取纱布上的滤物取纱布上的滤物取纱布上的滤物取纱布上的滤物纱布过滤纱布过滤纱布过滤纱布过滤6 6、再次溶解、再次溶解、再次溶解、再次溶解DNADNA2mol/LNaCl2mol/LNaCl溶液溶液溶液溶液取滤物取滤物取滤物取滤物鸡血细胞液中鸡血细胞液中鸡血细胞液中鸡血细胞液中DNADNA的粗提取实验流程图的粗提取实验流程图的粗提取实验流程图的粗提取实验流程图7 7、加冷酒精使、加冷酒精使、加冷酒精使、加冷酒精使DNADNA析出（纯化）析出（纯化）

14、析出（纯化）析出（纯化）冷酒精冷酒精冷酒精冷酒精鸡血细胞液中鸡血细胞液中鸡血细胞液中鸡血细胞液中DNADNA的粗提取实验流程图的粗提取实验流程图的粗提取实验流程图的粗提取实验流程图DNA的鉴定DNA的的粗粗提提取取与与鉴鉴定定实验原理实验原理DNA在不同浓度在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同溶液中溶解度不同DNA与其他细胞成分在酒精中溶解度不同与其他细胞成分在酒精中溶解度不同DNA和蛋白质对酶、高温和洗涤剂耐受性不同和蛋白质对酶、高温和洗涤剂耐受性不同DNA与二苯胺呈现蓝色反应与二苯胺呈现蓝色反应DNA粗提取粗提取选择适宜材料选择适宜材料破碎细胞破碎细胞DNA的溶解和析出的溶解和析出DNA的纯

15、化的纯化鉴定鉴定DNA与二苯胺混合，沸水浴，呈现蓝色反应与二苯胺混合，沸水浴，呈现蓝色反应总结：总结：方法步骤方法步骤 加入物质加入物质 目的目的 1 1.制备鸡血细胞液制备鸡血细胞液 柠檬酸钠溶液柠檬酸钠溶液 2 2.提取鸡血细胞细胞核物质提取鸡血细胞细胞核物质 20 m120 m1蒸馏水蒸馏水 3 3.溶解细胞核内的溶解细胞核内的DNADNA 2 mo12 mo1 L L 的的 NaClNaCl 溶液溶液 40 40 mLmL 4 4.析出含析出含DNADNA的黏稠物的黏稠物 蒸馏水蒸馏水 5 5.滤取含滤取含DNADNA的黏稠物的黏稠物 6 6.将将DNADNA的黏稠物再溶解的黏稠物再溶

16、解 2 mol2 molL L 的的NaClNaCl溶液溶液20 20 mLmL 7 7.过滤含过滤含DNADNA的的NaCNaCl l 溶液溶液 8 8.提取含有杂质较少的提取含有杂质较少的 DNADNA 冷却的冷却的9595的酒精的酒精50 50 mLmL A A:(1)(1)向试管中加入向试管中加入2mol2molL L 的的NaClNaCl溶液溶液5 5mLmL (2)(2)加入加入DNADNA (3)4(3)4 mLmL二苯胺试剂二苯胺试剂 9 9.DNADNA的鉴定的鉴定 B B:(1)(1)向试管中加入向试管中加入 2mol 2mol L L 的的NaClNaCl溶液溶液5 5m

17、LmL (2)4 m(2)4 mL L 二苯胺试剂二苯胺试剂 加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固加速血细胞破裂加速血细胞破裂 溶解溶解DNA 使使2mol/L的的NaCl溶液稀释至溶液稀释至0.14mol/L使得使得DNA最大限度地释出最大限度地释出 使含使含DNA的黏稠物被留在纱布上的黏稠物被留在纱布上使含使含DNA的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中除去含除去含DNA的滤液中的杂质的滤液中的杂质提取提取DNA A出现蓝色出现蓝色 B无变化无变化DNADNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定一、实验原理一、实验原理 1.1.血细胞在蒸馏水中

18、会渗透吸水过度而导致细胞膜和细血细胞在蒸馏水中会渗透吸水过度而导致细胞膜和细胞核膜的破裂。利用此特性可得到含有胞核膜的破裂。利用此特性可得到含有DNA的溶液。的溶液。2.2.DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度的在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度的变化而改变的。变化而改变的。DNA在在物质的量浓度为物质的量浓度为0.14 molL的的氯化钠溶液中的溶解度最低，氯化钠溶液中的溶解度最低，利用这一原理，可以使溶利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的解在氯化钠溶液中的DNA析出析出。3.3.DNA不溶于酒精溶液不溶于酒精溶液，但细胞中的但细胞中的某些物质则可以溶于某些物质则可以

19、溶于酒精。酒精。利用这一原理，可以进一步利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的提取出含杂质较少的DNA。4.4.DNA遇二苯胺（沸水浴）会变成蓝色，因此，遇二苯胺（沸水浴）会变成蓝色，因此，二苯胺可二苯胺可以作为鉴定以作为鉴定DNA的试剂的试剂。二、方法与过程二、方法与过程 1.1.制鸡血细胞液制鸡血细胞液（活鸡鲜血经分离或沉淀获得）（活鸡鲜血经分离或沉淀获得）0.1g/mL柠檬酸檬酸钠100mL活鸡鲜血活鸡鲜血180mL500mL烧杯中，玻棒烧杯中，玻棒搅拌搅拌，离心、分离或静置沉淀。离心、分离或静置沉淀。2.提取提取DNA取血细胞取血细胞5-10mL20mL蒸馏水，用玻棒沿一个方向蒸馏

20、水，用玻棒沿一个方向快速搅拌快速搅拌。纱布纱布过滤过滤：滤液中含：滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质。和其他核物质，如蛋白质。原理：血细胞的细胞膜、核摸吸水胀破，玻璃棒原理：血细胞的细胞膜、核摸吸水胀破，玻璃棒快速快速搅拌搅拌，机械加速血细胞破裂。，机械加速血细胞破裂。.提取提取血血细胞核物质：细胞核物质：.溶解核内的溶解核内的DNA：滤液滤液2mol/L的的NaCl溶液溶液40mL，玻棒沿一个方向，玻棒沿一个方向轻缓搅拌轻缓搅拌。.析出析出含含DNA的粘稠物：的粘稠物：.滤取含滤取含DNA的粘稠物：的粘稠物：.DNA粘稠物的再溶解：粘稠物的再溶解：在上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并沿一个方向在

21、上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并沿一个方向轻轻轻搅拌轻搅拌，出现丝状物；当丝状物不在增加时，停止加，出现丝状物；当丝状物不在增加时，停止加水（此时水（此时NaCl溶液的浓度相当于溶液的浓度相当于0.14mol/L）。）。用多层纱布用多层纱布过滤过滤，含，含DNA的粘稠物留在纱布上。的粘稠物留在纱布上。20mL 2mol/L的的NaCl溶液溶液步骤步骤含含DNA的粘稠物的粘稠物在20mL烧杯中烧杯中轻缓搅拌轻缓搅拌3min，使尽可能多的，使尽可能多的DNA溶解在溶解在NaCl溶液溶液。.过滤含有过滤含有DNA的的NaCl溶液：溶液：用放有两层纱布的漏斗用放有两层纱布的漏斗过滤过滤步骤步骤所得的溶液，

22、所得的溶液，滤液中含有滤液中含有DNA。.提取含有杂质较少的提取含有杂质较少的DNA：步骤步骤所得的滤液体积分数为所得的滤液体积分数为95%的冷却酒精的冷却酒精50mL，用玻棒沿一个方向，用玻棒沿一个方向轻缓搅拌轻缓搅拌，溶液中（，溶液中（析出析出）出现乳白色丝状物，用玻棒将丝状物卷起，并用滤纸吸出现乳白色丝状物，用玻棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。取上面的水分。3.DNA的鉴定：的鉴定：加入二苯胺试剂加入二苯胺试剂4mL，用玻棒，用玻棒搅拌搅拌使使DNA溶解，溶解，沸水浴沸水浴5min，观察溶液是否出现蓝色。，观察溶液是否出现蓝色。1.共有共有“三次过滤，两次析出，七次搅拌三次过滤，

23、两次析出，七次搅拌”2.加加入入“两两次次蒸蒸馏馏水水，三三次次NaCl溶液，一一次次酒酒精精”三、实验小结三、实验小结练习练习1、请解释提取、请解释提取DNA的实验操作中主要的步骤的目的。的实验操作中主要的步骤的目的。答：提取答：提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的的关键，要尽

24、可能使细胞内的DNA全部溶解；第三全部溶解；第三步是步是DNA的纯化，即根据的纯化，即根据DNA的溶解特性、对酶的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步是对与杂质分开；最后一步是对DNA进行鉴定，这是对进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。整个实验的结果的检测。2、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与提取提取DNA一样容易吗？一样容易吗？答：提取蛋白质比提取答：提取蛋白质比提取DNA的难度大。这的难度大。这是因为，与是因为，与DNA相比，蛋白质对温度、盐相比，蛋白质对温度、盐

25、浓度、浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。摸索提取的条件，设计特定的方法。2.实验中实验中NaCl的物质的量浓度为的物质的量浓度为2 molL和和0.14 molL对对DNA有何影响有何影响?1.在在DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是中加入蒸馏水的作用是()。A.稀

26、释血液、冲洗样品稀释血液、冲洗样品B.使血细胞破裂、降低使血细胞破裂、降低NaCl浓度使浓度使DNA析出析出C.使血细胞破裂、增大使血细胞破裂、增大DNA溶解量溶解量 D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNAB答：答：前者是溶解前者是溶解DNA，后者是使后者是使DNA析出析出3.DNA3.DNA遇二苯胺遇二苯胺(沸水浴沸水浴)会染成会染成()()A.A.砖红色砖红色 B.B.橘黄色橘黄色 C.C.紫色紫色 D.D.蓝色蓝色4.提取鸡血中的提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液时，为什么要除去血液中的上清液中的上清液?答：答：DNA的提取，关键是对杂质的去除，由于的提取，关键是对杂质的去除，由于上清液是血液中的血浆部分，不含上清液是血液中的血浆部分，不含DNA，所以所以要除去上清液要除去上清液(含有蛋白质含有蛋白质)。D