ELISA基础知识和注意事项.ppt

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1、 ELISA基础知识和注意事项基础知识和注意事项11/19/2022 类容类容oELISA的基本原理和相关概念o特别说说捕获法oELISA结果的影响因素oELISA结果的处理11/19/2022ELISA的基本原理和相关概念oo将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或 抗体后，这种酶标抗原或抗体既能保留与相抗体后，这种酶标抗原或抗体既能保留与相应抗体或抗原结合的免疫活性，又同时保留应抗体或抗原结合的免疫活性，又同时保留酶的活性。酶的活性。oo由于酶具有很高的催化效率，因此可放大抗由于酶具有很高的催化效率，因此可放大抗原抗体反应效果，从而使测定方法达到很高原抗体反

2、应效果，从而使测定方法达到很高的的敏感性敏感性。11/19/2022ELISA的基本原理的基本原理抗原或抗体在体外结抗原或抗体在体外结抗原或抗体在体外结抗原或抗体在体外结合到某种固相载体表合到某种固相载体表合到某种固相载体表合到某种固相载体表面后，仍然能保持其面后，仍然能保持其面后，仍然能保持其面后，仍然能保持其免疫学活性而能相互免疫学活性而能相互免疫学活性而能相互免疫学活性而能相互特异性特异性特异性特异性结合。结合。结合。结合。11/19/2022抗原抗体复合物与酶标的二抗结合，加入合适的底物在酶的作用下抗原抗体复合物与酶标的二抗结合，加入合适的底物在酶的作用下抗原抗体复合物与酶标的二抗结合

3、，加入合适的底物在酶的作用下抗原抗体复合物与酶标的二抗结合，加入合适的底物在酶的作用下显色，显色，显色，显色，颜色的深浅颜色的深浅颜色的深浅颜色的深浅与与与与特异性抗体水平特异性抗体水平特异性抗体水平特异性抗体水平成比例关系，可进行定性和定成比例关系，可进行定性和定成比例关系，可进行定性和定成比例关系，可进行定性和定量分析。量分析。量分析。量分析。11/19/2022ELISA的分类o测抗原：竞争法（也可用于测抗体）、双抗体夹心法。o测抗体：间接法、捕获法、双抗原夹心法11/19/2022竞争法elisao 竞争法ELISA原理原理标本中的抗原和一标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结

4、合，标本定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，标本中的抗原含量越多，结合在固相上的酶标抗中的抗原含量越多，结合在固相上的酶标抗原越少，显色越浅。原越少，显色越浅。oo要用于小分子抗原或半抗原的定量测定，也要用于小分子抗原或半抗原的定量测定，也可对抗体进行测定。可对抗体进行测定。11/19/2022 包被特异性抗体包被特异性抗体 酶标抗原酶标抗原检测抗原检测抗原孵育孵育洗涤后显色洗涤后显色加样加样AB竞争法竞争法ELISAELISA3.显色显色3.孵育孵育1.加样加样11/19/2022 双抗体夹心法oo双抗体夹心法双抗体夹心法ELISA 将特异性抗体包将特异性抗体包被于固相载体表面，与标本中相应抗

5、原相结被于固相载体表面，与标本中相应抗原相结合，洗涤后再加入酶标的第二特异性抗体与合，洗涤后再加入酶标的第二特异性抗体与抗原结合，加入底物后显色。抗原结合，加入底物后显色。o检测测抗原要有至少具有2个抗原决定簇11/19/2022包被特异性抗体包被特异性抗体双抗体夹心法双抗体夹心法ELISAELISA检测抗原检测抗原1.加样加样2.孵育孵育3.洗涤洗涤4.加入二抗加入二抗5.孵育孵育6.显色显色酶标特异性抗体酶标特异性抗体11/19/2022双抗原夹心法oo双抗原夹心法双抗原夹心法ELISA检测标本中的总检测标本中的总抗体（包括抗体（包括IgM和和IgG型抗体）型抗体）。将特异。将特异性抗原包

6、被于固相载体表面，与标本中特异性抗原包被于固相载体表面，与标本中特异性性IgM和和IgG型抗体结合，洗涤后加入酶标型抗体结合，洗涤后加入酶标的特异性抗原与相应的抗体结合，洗涤后加的特异性抗原与相应的抗体结合，洗涤后加入底物显色入底物显色11/19/20223.洗涤洗涤1.加样加样2.孵育孵育6.显色显色5.孵育孵育4.加入酶标加入酶标抗原抗原双抗原夹心法双抗原夹心法ELISA11/19/2022间接法oo间接法间接法 ELISA（Indirect ELISA）将特异性抗原包被于固相载体表面，与标本将特异性抗原包被于固相载体表面，与标本中相应特异性抗体结合，洗涤后再加入酶标中相应特异性抗体结合，

7、洗涤后再加入酶标的抗人的抗人IgG或或IgM抗体与之结合，洗涤后加抗体与之结合，洗涤后加入底物显色。入底物显色。o酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子o只需要变换包被抗原，就可用一种酶标二抗只需要变换包被抗原，就可用一种酶标二抗检测各种与抗原结合的抗体检测各种与抗原结合的抗体11/19/20221.加样加样2.孵育孵育3.洗涤洗涤4.加入二抗加入二抗5.孵育孵育6.显色显色间接法间接法ELISA11/19/2022捕获法ooELISA（Capture ELISA）专门用专门用来检测来检测IgM型抗体的方法。将抗人型抗体的方法。将抗人IgM抗抗体包被于固相载体表面，与

8、标本中所有人体包被于固相载体表面，与标本中所有人IgM抗体结合，洗涤后加入特异性抗原与相抗体结合，洗涤后加入特异性抗原与相应的特异性应的特异性IgM抗体结合，洗涤后再加入酶抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗原特异性抗体与之结合，洗涤后加入标的抗原特异性抗体与之结合，洗涤后加入底物显色。底物显色。11/19/20221.加样加样2.孵育孵育3.洗涤洗涤4.加入抗原加入抗原孵育孵育5.加入二抗加入二抗孵育孵育6.显色显色捕获法捕获法ELISA11/19/2022 区别理解o 检测抗原？抗体？o 包被什么？标记什么？11/19/2022间接法和捕获法比较o 间接法：假阴性，假阳性o捕获法：酶标抗体的要求

9、较高11/19/2022间接法的假阳性麻疹IgG麻疹抗原麻疹IgM抗人抗人酶标IgM抗体类风湿因子阳阳性性结结果果假假阳阳性性结结果果11/19/2022间接法的假阴性麻疹IgG麻疹抗原麻疹IgM酶标抗人IgM抗体阳阳性性结结果果假假阴阴性性结结果果11/19/2022ELISA的有关名词概念o质控血清：质控血清是为了对实验结果进行控制而配制的血清。质控血清可以是定值也可以是不定值，可以购置也可以自配。自己配制时要注意选用无脂血的血清或血浆，不能用试剂盒内的阳性对照。若用稀释的血清作为质控血清，应考虑稀释基质成分对结果的影响。因质控血清与临床标本不一致，应该注意对结果的分析，应该注意质控血清只

10、能用于质控活动，不可用于标定仪器或评价方法。用于室用于室内质控的质控血清一般选取内质控的质控血清一般选取CUTOFF值值2-3倍的倍的质控品。质控品。11/19/2022o室内质控：实验室内部使用控制实验结果可靠性的一种质量控制。o室间质评：用于考核各个实验室结果可靠性的一种考核，可分为国家级和地方级的室间质评。可以理解为“各个实验室的质量评比”。11/19/2022o临界值（CUTOFF值）：临界值是判断阴阳性或有临床意义水平的数值，临界值的确定是测定大量数据后应用统计学方法确定的。许多试剂都会给出临界值或临界值的计算方法。o 本底：就是底色。如ELISA HBsAg，阳性显色，阴性不显色，

11、本底就是整个阴性显色的情况。ELISA 抗HBcAb，阳性不显色，阴性显色，本底就是整个阳性显色的情况。11/19/2022o灵敏度：能检测到的分析物的最小量，表示检测下限的能力。o相对灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）100%o测定方法及表示方法：灵敏度标准品、质控血清、阳性标本稀释终点、血清盘（pannel）及临床标本阳性率。11/19/2022o特异性特异性：真阴性标本的检出能力。o相对特异性=真阴性/（真阴性+假阳性）100%o测定及表示方法：质控血清、血清盘、临床标本阴性率。11/19/2022Elisa结果的影响因素o 试剂盒的选择 o 标本o 加样与稀释o 温育o 洗版o 显色o

12、 质控11/19/2022试剂盒的选择o 同行的试剂使用情况o 上级部门对试剂实际使用的综合评价o 使用临界值质控血清进行实际检测比较,选择林敏度和准确度高、特异性强试剂盒11/19/2022标本o应注意避免溶血 o在5 天内测定的血清标本可放置于4、超过一周测定的需20保存o尽量避免反复冻融（少量分装）11/19/2022加样和稀释o 加样本的准确性（个人因素和实验条件）o 尽可能排除主关因素（尽可能用加样枪，避免直接使用滴瓶）o 各种试剂盒标本的稀释使用，严格按照说明是操作11/19/2022温育o 温度o 水浴箱o 发硬板应漂浮于水上或水面应高于反应板11/19/2022洗版o 手洗o

13、洗板机（微孔液体残留45s）11/19/2022显色o 通常是A、B两种液体，不稳定，又颜色应立即丢弃o 先加A后加B，显色时间严格按说明书进行o 终止后15内比色11/19/2022质控o 室内质控血清o 即刻法11/19/2022ELISA试剂的常见问题原因及其解决o 显色浅，灵敏度低o 假阳性多，本底高甚至花板o 重复性不好o 白板11/19/2022显色浅 灵敏度低序号原因解决方法1试剂盒运输时间过长，受高温天气影响，酶的活性降低。试剂运输过程加放足够冰袋并尽可能缩短运输时间。2试剂盒（包括未用完的板条及其他组分）保藏条件不正确。试剂盒内所有组分都应当在4冷藏，未使用完的板条要密封保存

14、。3试剂盒使用时已超出有效期。过期试剂盒不可以使用。4温育时间不够。严格按照说明书操作。5恒温箱温度达不到37。注意控制恒温箱温度，尽可能让其稳定在370.5。尽量避免频繁开关恒温箱门。经常注意水箱中合适的水位。在保证水不没过酶标板的前提下，使水位尽量高，以保证反应温度。11/19/20226加样量不足；移液时抽吸排放过快，有气泡、或吸头内残留液体过多。经常校正移液器。注意吸头要与移液器吻合。移液不宜过快，排放要完全。7显色剂加量不足，或加入顺序颠倒。按照说明书要求，先加入A液、后加入B液，并保证加入量。8样品用NaN3防腐，影响了酶的活性。不可以使用NaN3防腐。9试剂、样品使用前未平衡至室

15、温。试剂、样品从低温保藏条件中拿出来后，要先平衡至室温方可以使用。10试剂开启时间过长，污染。试剂开启后应该在尽可能短的时间内用完，在保证正确贮存的前提最长不要超过。12不同批号试剂中混用不同批号试剂不能混用11/19/2022假阳性多，本底高甚至花板 序号原因解决方法1试剂过期过期试剂不能使用2加样时污染注意更换吸头。尽可能避免污染。3加酶时污染对先加样后加酶的操作，加酶时要注意吸头不要接触标本，造成污染。当可能造成污染时，一定要更换吸头，切忌侥幸心理。4恒温箱温度过高注意控制恒温箱温度，尽可能让其稳定在370.5。5整个操作时间过长、造成反应时间不同（第一孔与最后一孔反应时间相差很悬殊）。

16、气温高时更明显。在尽可能短的时间内完成操作。尽量不要堆积多块板子操作（尤其手工操作时）。11/19/20226洗液稀释倍数过高按照要求倍数稀释洗液7洗板次数不够按试剂要求，不可任意减少洗板次数8洗板时浸泡时间不够按要求操作，并适当延长浸泡时间。9手工洗板方式不正确洗板时，垂直加入洗液，保证一定的冲击力；洗液要注满板孔，并保证30-60秒的浸泡时间。10洗板机调试不正确或者有故障（可通过手工洗板判定）手工洗板，并联系仪器厂家维修。11酶被污染防止组分的污染。如使用容器，注意容器的清洁。12显色液B液被污染13显色完后没有终止反应。显色完立即终止反应。11/19/2022重复性不好 1加样量多少不

17、一，操作时间长短不一。重复同一样品时，加样量与加样时间相同；同时注意移液器的校准。加样后应该将酶标板放置在微量振荡器上，充分混合；标本保证一致、无污染；尽可能由同一名操作人员操作。尽可能模拟相同的反应条件。2加入标本后没有混匀。3重复实验的操作人员不同，操作习惯不同。4反应时间、温度等不相同。5标本不同（被混淆或者处理不同）6精密度测定方法不标准采用正确的方法操作11/19/2022白板 1忘记加酶严格按照说明书操作。2忘记加显色液3酶或A、B液被污染失效防止组分被污染，注意保存。4把终止液当A液注意液体组分加样顺序。11/19/2022结果处理o OD值出现负值o 阴性对照值比空白小o 样本样本OD值和值和cutoff接近接近 11/19/2022OD值出现负值o波长不对，酶标仪上显示的波长和实际的滤光片不对应o溶液里有沉淀o板子脏了，如果有能冲洗的洗板机可以冲洗bottom，或者洗瓶冲干净用滤纸吸干，然后双波长检测11/19/202211/19/2022