紫外可见分子荧光仪器分析课件.ppt

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1、紫外可见分子荧光仪器分析1第1页，此课件共145页哦方法特点方法特点基于物质吸收基于物质吸收紫外或可见光紫外或可见光引起分子中引起分子中价电价电子子跃迁、产生跃迁、产生分子吸收光谱分子吸收光谱与物质组分之与物质组分之间的关系建立起来的分析方法，称为间的关系建立起来的分析方法，称为紫外紫外可见分光光度法可见分光光度法（UV-vis）。）。1.用于无机物和有机物的定量分析，也可以进用于无机物和有机物的定量分析，也可以进行有机物的定性及结构分析行有机物的定性及结构分析 2.较高的灵敏度（较高的灵敏度（10-410-7gmL-1）和较高准）和较高准确度，选择性好确度，选择性好3.仪器操作简单快速，应用

2、广泛仪器操作简单快速，应用广泛2第2页，此课件共145页哦主要内容主要内容一一 概述概述 二二 光的吸收定律（朗伯比尔定光的吸收定律（朗伯比尔定律）律）三三 仪器介绍仪器介绍四四 分析条件的选择分析条件的选择五五 应用应用3第3页，此课件共145页哦一一 概述概述1.11.1电磁辐射的选择吸收电磁辐射的选择吸收 当光照射到物体上，光与物质发生相互作用，当光照射到物体上，光与物质发生相互作用，产生反射、散射、吸收或透射，对于均匀物体，产生反射、散射、吸收或透射，对于均匀物体，光的散射可忽略光的散射可忽略一束光通过某一有色溶液，一些波长的光一束光通过某一有色溶液，一些波长的光被溶液吸收，另一些波长

3、的光则透过透过被溶液吸收，另一些波长的光则透过透过光或反射光刺激人眼而使人感觉到颜色存在光或反射光刺激人眼而使人感觉到颜色存在 4第4页，此课件共145页哦可见光：可见光：400-750nm0nm；溶液的颜色由透射光波长决定；溶液的颜色由透射光波长决定；物质呈现的颜色是物质对不同波长的光选物质呈现的颜色是物质对不同波长的光选择性吸收的结果如择性吸收的结果如CuSO4溶液，吸收白溶液，吸收白光光(复合光复合光)中的黄光而呈蓝色中的黄光而呈蓝色 单色光，复合光，互补色光单色光，复合光，互补色光5第5页，此课件共145页哦 1.21.2分子吸收光谱的产生分子吸收光谱的产生 在分子中，除了电子相对于原

4、子核的运动在分子中，除了电子相对于原子核的运动外，还有核间相对位移引起的振动和转动这外，还有核间相对位移引起的振动和转动这三种运动能量都是量子化的，并对应有一定能三种运动能量都是量子化的，并对应有一定能级级若用若用EEe e,E,Ev v,E,Er r分别表示电子能级、振分别表示电子能级、振动能级转动能级差，即有动能级转动能级差，即有EEe e EEv v EEr r分分子跃迁时，分子中总的内能变化：子跃迁时，分子中总的内能变化：E分子分子=E Ee e+EEv v +EEr r一一 概述概述 7第7页，此课件共145页哦对多数分子而言，对多数分子而言，Ee（电子）电子）约为约为1-1-202

5、0ev，紫外可见紫外可见(带光带光谱）；谱）；Ev（振动）振动）约约为为0.05-10.05-1ev，近红外、近红外、中红外区（带光谱）；中红外区（带光谱）；Er（转动）转动）小于小于0.050.05ev，远红外、微波远红外、微波区区8第8页，此课件共145页哦一一 概述概述1.31.3吸收的本质吸收的本质-选择性选择性o当入射光子的能量等于吸光物质的基态和激当入射光子的能量等于吸光物质的基态和激发态能量之差时才会被吸收发态能量之差时才会被吸收o由于物质的分子（或离子）只有有限数目由于物质的分子（或离子）只有有限数目的量子化能级，所以物质对辐射的吸收是的量子化能级，所以物质对辐射的吸收是有选择

6、性的与光子碰撞发生能量转移：有选择性的与光子碰撞发生能量转移：M+hv M*基态基态激发态激发态9第9页，此课件共145页哦由于分子中的量子化能级是有限的，不同的由于分子中的量子化能级是有限的，不同的物质微粒由于结构不同而具有不同的量子化物质微粒由于结构不同而具有不同的量子化能级，能级差不同，因此物质对光的吸收具能级，能级差不同，因此物质对光的吸收具有选择性有选择性o被激发的粒子在被激发的粒子在10-8s后又回到基态，并以热后又回到基态，并以热的形式或荧光等形式释放能量的形式或荧光等形式释放能量10第10页，此课件共145页哦一一 概述概述1.41.4吸收曲线吸收曲线定义：定义：将不同波长的光

7、透过某一固定浓度和厚度的将不同波长的光透过某一固定浓度和厚度的有色溶液，测量每一波长下对光吸收程度，以波有色溶液，测量每一波长下对光吸收程度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，这种图谱称长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，这种图谱称为该物质的吸收曲线为该物质的吸收曲线 描述了物质对不同波长光的吸收能力描述了物质对不同波长光的吸收能力11第11页，此课件共145页哦定性依据定性依据吸收峰吸收峰maxmax吸收谷吸收谷minmin肩峰肩峰33末端吸收末端吸收44次峰或第二峰次峰或第二峰 112第12页，此课件共145页哦特征特征u不同浓度的同一物质，在吸收峰附近，吸光度不同浓度的同一物质，在吸收峰附

8、近，吸光度随浓度增加而增大，但最大吸收波长不变随浓度增加而增大，但最大吸收波长不变u在最大吸收波长处测定，灵敏度最高在最大吸收波长处测定，灵敏度最高u吸收曲线是光度法中选择测定波长的重要依吸收曲线是光度法中选择测定波长的重要依据据KMnO4溶液的最大吸收波长为溶液的最大吸收波长为525nm,吸吸收黄绿色的光，呈现紫红色收黄绿色的光，呈现紫红色13第13页，此课件共145页哦定性分析与定量分析的基础定性分析与定量分析的基础定性分析基础定性分析基础定性分析基础定性分析基础定量分析基础定量分析基础定量分析基础定量分析基础ABA 在一定的实验条件下，在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的物质对光的

9、吸收与物质的浓度成正比浓度成正比。A C增增大大物质对光的选择吸收物质对光的选择吸收14第14页，此课件共145页哦o透过光的强度透过光的强度(t)和入射光强度和入射光强度(o)之比称为之比称为透光度（透光度（T)：T=t/oo为表示物质吸收光的程度引入为表示物质吸收光的程度引入吸光度吸光度(A)概念：概念：2.12.1透光度和吸光度透光度和吸光度二二 光的吸收定律光的吸收定律15第15页，此课件共145页哦2.22.2朗伯比尔定律朗伯比尔定律朗伯定律（朗伯定律（1760年）：光吸收与溶液层厚度成年）：光吸收与溶液层厚度成正比正比比尔定律（比尔定律（1852年）：光吸收与溶液浓度成正年）：光吸

10、收与溶液浓度成正比比当一束当一束平行单色光平行单色光垂直照射到任一垂直照射到任一均匀非散射均匀非散射的的含有吸光物质介质时，吸光度与吸光物质的浓含有吸光物质介质时，吸光度与吸光物质的浓度及吸收层厚度成正比度及吸收层厚度成正比朗伯比尔定律朗伯比尔定律16第16页，此课件共145页哦 数学表达：数学表达：Alg(1/T)=Kbc其中，其中，A:吸光度，吸光度，T:透射比，透射比，K:比例常数，比例常数，b:溶液厚度，溶液厚度，c:溶液浓度溶液浓度k与物质的性质、入射光的波长及温度等因素有与物质的性质、入射光的波长及温度等因素有关关o吸光系数吸光系数(a)当当c以以gL-1,b以以cm表示时，常数表

11、示时，常数K以以a表示，表示，称为吸光系数，单位为称为吸光系数，单位为Lg-1cm-1 此时吸此时吸收定律为：收定律为：A=abc17第17页，此课件共145页哦u摩尔吸光系数摩尔吸光系数()浓度浓度c用用molL-1，液层厚度，液层厚度b以以cm为单位为单位时，则时，则K用另用另来表示，来表示，称为摩尔吸光系数，称为摩尔吸光系数，其单位为其单位为Lmol-1cm-1,摩尔吸光系数表示物质摩尔吸光系数表示物质浓度为浓度为1molL-1，液层厚度为，液层厚度为1cm时，溶液时，溶液的吸光度此时，吸收定律为的吸光度此时，吸收定律为A=bc u不能直接取不能直接取1molL-1这样高浓度的吸光物质溶

12、液这样高浓度的吸光物质溶液来测量其摩尔吸光系数，只能通过计算求得来测量其摩尔吸光系数，只能通过计算求得18第18页，此课件共145页哦o摩尔吸光系数表明物质对某一波长光的吸收摩尔吸光系数表明物质对某一波长光的吸收能力，能力，愈大，表示该物质对某波长光的吸收愈大，表示该物质对某波长光的吸收能力愈强，测定的灵敏度就愈高，因此进行吸能力愈强，测定的灵敏度就愈高，因此进行吸收测量时，为了提高分析的灵敏度，必须选择收测量时，为了提高分析的灵敏度，必须选择摩尔吸光系数大的化合物，以及选择具有最大摩尔吸光系数大的化合物，以及选择具有最大值的波长作入射光值的波长作入射光o实际上由实验结果计算实际上由实验结果计

13、算时，常以被测物质时，常以被测物质的总浓度代替吸光物质的浓度，则得到的的总浓度代替吸光物质的浓度，则得到的值实际上是表观摩尔吸光系数值实际上是表观摩尔吸光系数19第19页，此课件共145页哦u吸光度具有加和性在某一波长，溶液中含有吸光度具有加和性在某一波长，溶液中含有对该波长的光产生吸收的多种物质，那么溶液对该波长的光产生吸收的多种物质，那么溶液的总吸光度等于溶液中各个吸光物质的吸光度的总吸光度等于溶液中各个吸光物质的吸光度之和：之和：A1=e1bc1A2=e2bc2A =e1bc1+e2bc2根据吸光度的加和性可以进行根据吸光度的加和性可以进行多组分的测定多组分的测定以及以及某些化学反应某些

14、化学反应平衡常数平衡常数的测定的测定 各物间无相互作用，则测得的吸光度为各种吸光物质吸各物间无相互作用，则测得的吸光度为各种吸光物质吸光度之和。光度之和。20第20页，此课件共145页哦2.32.3 吸收的测量吸收的测量 I0和和I在实验室中都不容易加以测量，这是在实验室中都不容易加以测量，这是因为待测溶液必须装在吸收池内，辐射和器壁因为待测溶液必须装在吸收池内，辐射和器壁将相互作用，从而会因反射或吸收在每个界面将相互作用，从而会因反射或吸收在每个界面上造成辐射强度的损失，因此在实际测定工作上造成辐射强度的损失，因此在实际测定工作中，取另一个完全相同的吸收池，装溶剂作参中，取另一个完全相同的吸

15、收池，装溶剂作参比进行测定比进行测定 21第21页，此课件共145页哦22第22页，此课件共145页哦2.42.4 应用比尔定律的局限性应用比尔定律的局限性 标准曲线应当成直线，但是当浓度大时，标准曲线应当成直线，但是当浓度大时，标准曲线不成直线的情形，特别是明显地看标准曲线不成直线的情形，特别是明显地看到标准曲线向浓度轴弯曲，个别情形也有向到标准曲线向浓度轴弯曲，个别情形也有向吸光度轴弯曲者吸光度轴弯曲者 原因是多方面的，有的属于定律本身的基原因是多方面的，有的属于定律本身的基本限制，有的则同测定吸收的方法有关，或本限制，有的则同测定吸收的方法有关，或者是浓度改变时伴随着化学变化者是浓度改变

16、时伴随着化学变化 23第23页，此课件共145页哦24第24页，此课件共145页哦2.4.1.2.4.1.比尔定律的基本限制比尔定律的基本限制)朗伯定律总是适用的朗伯定律总是适用的吸光度与液层厚度成正比吸光度与液层厚度成正比)比尔定律的条件比尔定律的条件比尔定律只有在描述稀溶液的吸收时才比尔定律只有在描述稀溶液的吸收时才是正确是正确(原因）原因）吸光物质的高浓度（负偏离）吸光物质的高浓度（负偏离）电解质的高浓度（负偏离）电解质的高浓度（负偏离）25第25页，此课件共145页哦正偏差：正偏差：在理想状况下，吸光物质的光学性质必在理想状况下，吸光物质的光学性质必须是均匀的，当试样为胶体、乳状液或有

17、悬须是均匀的，当试样为胶体、乳状液或有悬浮物质存在时，入射光通过溶液后，有一部浮物质存在时，入射光通过溶液后，有一部分光会因散射而损失，使吸光度增大，对分光会因散射而损失，使吸光度增大，对Beer定律产生正偏差质点的散射强度是与定律产生正偏差质点的散射强度是与入射光波长的四次方成反比的，所以散射对入射光波长的四次方成反比的，所以散射对紫外区的测定影响更大紫外区的测定影响更大26第26页，此课件共145页哦2.4.2.2.4.2.非单色光引起的偏离非单色光引起的偏离 o比尔定律只适用于单色光，实际中入射光比尔定律只适用于单色光，实际中入射光用的是复合光。用的是复合光。o实际上，在测量中，只要在入

18、射光所包括的实际上，在测量中，只要在入射光所包括的波长范围内，吸光物质的吸光系数没多大差波长范围内，吸光物质的吸光系数没多大差别，对比尔定律的偏离一般是很小的由于别，对比尔定律的偏离一般是很小的由于溶液在紫外及可见区的吸收曲线一般比较平溶液在紫外及可见区的吸收曲线一般比较平滑且较宽，这个条件容易达到，只需要所选滑且较宽，这个条件容易达到，只需要所选用的入射辐射波长不在吸收曲线陡变部分即用的入射辐射波长不在吸收曲线陡变部分即可。可。27第27页，此课件共145页哦o标准曲线是吸光度标准曲线是吸光度A与浓度与浓度c的关系曲线，其的关系曲线，其斜率斜率 当当1=2=时，即当入射光为单色光时，时，即当

19、入射光为单色光时，上式变为上式变为 dA/dc=b 标准曲线的斜率为一定值，即符合比尔标准曲线的斜率为一定值，即符合比尔定律定律 28第28页，此课件共145页哦o当入射光为复合光时（当入射光为复合光时（1 2），标准曲线），标准曲线不再是直线关系，将式（不再是直线关系，将式（5）对）对c微分，则微分，则 上式右边恒为负值，说明用复合光作上式右边恒为负值，说明用复合光作入射光时，标准曲线向浓度轴弯曲，使发入射光时，标准曲线向浓度轴弯曲，使发生对于比尔定律的偏离生对于比尔定律的偏离 1与与2相差愈大，吸收池愈厚，偏相差愈大，吸收池愈厚，偏离比尔定律愈严重离比尔定律愈严重 29第29页，此课件共1

20、45页哦30第30页，此课件共145页哦2.4.3 溶液中化学反应引起的偏离溶液中化学反应引起的偏离u 吸光物质的离解、缔合、形成新化合物及互变吸光物质的离解、缔合、形成新化合物及互变异构等化学变化往往也造成偏离比尔定律的现异构等化学变化往往也造成偏离比尔定律的现象象u依吸光物质的性质，溶液中化学平衡的知识，依吸光物质的性质，溶液中化学平衡的知识，对偏离加以预防和终止，也必须严格控制显色对偏离加以预防和终止，也必须严格控制显色反应的条件，获得较好的测量结果反应的条件，获得较好的测量结果 31第31页，此课件共145页哦三三紫外及可见吸收测量用仪器紫外及可见吸收测量用仪器 紫外紫外-可见分光光度

21、计的基本结构是由五个可见分光光度计的基本结构是由五个部分组成：即光源、单色器、吸收池、检部分组成：即光源、单色器、吸收池、检测器和信号指示系统测器和信号指示系统32第32页，此课件共145页哦3.13.1 光源光源o白炽光源：钨灯或卤钨灯可见光源白炽光源：钨灯或卤钨灯可见光源 3501000nmo气体放电光源：氢灯或氘灯紫外光源气体放电光源：氢灯或氘灯紫外光源 200600 nm 基基本本要要求求所需的光谱区域内能够发射所需的光谱区域内能够发射连续辐射连续辐射足够的辐射足够的辐射强度强度良好的良好的稳定性稳定性辐射辐射能量能量随波长的随波长的变化变化应尽可能应尽可能小小33第33页，此课件共1

22、45页哦3.3.2 单色器单色器 能能从从光光源源辐辐射射的的复复合合光光中中分分出出单单色色光光的的装装置置其主主要要功功能能：产产生生光光谱谱纯纯度度高高的的波波长长且且波波长长在在紫紫外外可可见见区区域域内内任任意意可调可调组成：狭缝、准直镜、色散元件（棱镜，光栅）组成：狭缝、准直镜、色散元件（棱镜，光栅）棱棱镜镜色色散散原原理理：依依据据不不同同的的波波长长光光通通过过棱棱镜镜时时有有不不同同的的折折射率而将不同波长的光分开射率而将不同波长的光分开(1)玻玻璃璃棱棱镜镜：由由于于玻玻璃璃可可吸吸收收紫紫外外光光，所所以以玻玻璃璃棱棱镜镜只只能能用用于于350 3200 nm的的波波长长

23、范范围围，即即只只能能用用于于可可见见光光域内域内(2)石石英英棱棱镜镜：石石英英棱棱镜镜可可使使用用的的波波长长范范围围较较宽宽，可可从从185 4000nm，即可用于紫外、可见和近红外三个光域，即可用于紫外、可见和近红外三个光域 34第34页，此课件共145页哦(1)棱镜的色散棱镜的色散35第35页，此课件共145页哦 光栅光栅原理：利用光的衍射与干涉作用制成的原理：利用光的衍射与干涉作用制成的范范围围：紫紫外外、可可见见及及红红外外光光域域，而而且且在在整整个个波波长长区区具有良好的、几乎均匀一致的分辨能力具有良好的、几乎均匀一致的分辨能力优优点点：它它具具有有色色散散波波长长范范围围宽

24、宽、分分辨辨本本领领高高、成成本本低低、便于保存和易于制备等优点便于保存和易于制备等优点缺缺点点：各各级级光光谱谱会会重重叠叠而而产产生生干干扰扰,可可用用二二维维色色散散技术克服技术克服（2）光栅的色散）光栅的色散36第36页，此课件共145页哦3.3.3 试样容器试样容器 1.1.吸收池功能：用于盛放分析试样吸收池功能：用于盛放分析试样2 材料材料玻璃玻璃能吸收能吸收UV光，仅适用于可见光区光，仅适用于可见光区 石石英英不不能能吸吸收收紫紫外外光光，适适用用于于紫紫外外和和可可见光区见光区3 要要求求：采采用用光光程程长长度度和和透透明明性性都都相相同同的的吸吸收收池池，以以使使能能正正确

25、确比比较较透透过过溶溶剂剂和和试试液液的的辐辐射射强强度度匹匹配配性性（对对光光的的吸吸收收和和反反射射应应一一致致），为为减减少少光光的的损损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向37第37页，此课件共145页哦3.43.4检测器检测器1 功能：功能：检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变化的一种装置化的一种装置2 检测器类型：检测器类型：光电池、光电管和光电倍增管光电池、光电管和光电倍增管3 硒光电池：硒光电池：光的敏感范围为光的敏感范围为300800nm，其中，其中500 600nm最为灵敏。一般用于低档的分

26、光最为灵敏。一般用于低档的分光光度计中光度计中4 光电管光电管：在紫外：在紫外-可见分光光度计上应用较为广泛可见分光光度计上应用较为广泛5 光电倍增管：光电倍增管：检测微弱光最常用的光电元件，它的检测微弱光最常用的光电元件，它的灵敏度比一般的光电管要高灵敏度比一般的光电管要高200倍，因此可使用倍，因此可使用较较窄窄的单色器狭缝，从而对光谱的精细结构有的单色器狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的较好的分辨能力分辨能力38第38页，此课件共145页哦对检测器的要求对检测器的要求o响应一个很大波长范围内的辐射能响应一个很大波长范围内的辐射能；o对弱的辐射也应有足够的灵敏度对弱的辐射也应有足够的灵敏度

27、；o能快速回答一个容易放大而噪声低的能快速回答一个容易放大而噪声低的电信号；电信号；o产生的电信号应正比于投射到检测器上的光产生的电信号应正比于投射到检测器上的光束强度，且有宽的线性范围束强度，且有宽的线性范围 这是定量的这是定量的基础基础39第39页，此课件共145页哦光电管光电管 o光电管是由封装在真空透明泡中的一个半圆柱形阴极和一个丝（状）阳极组成，阴极的凹面有光电发射材料层，在受光照射时，如果光子的能量超过阴极光电材料的功函数时，便有电子发射出来，所经过的时间最多不超过10-9秒的数量级o当在两级间加有电压时，发射的电子就流向丝阳极而产生光电流，对于给定的照射光强度，它所产生电流大约为

28、光电池的1/4，但光电管有很高的内阻，所产生的光电流很容易放大 40第40页，此课件共145页哦光电倍增管光电倍增管o对于低辐射强度的测量，光电倍增管要比普对于低辐射强度的测量，光电倍增管要比普通光电管优越得多一般说，它的灵敏度比通光电管优越得多一般说，它的灵敏度比光电管高光电管高200多倍多倍 o光电倍增管由阴极和多个附加极组成光电倍增管由阴极和多个附加极组成 o光电倍增管易被强辐射损坏，所以只可用于低光电倍增管易被强辐射损坏，所以只可用于低辐射强度的测量因此光电倍增管必须安装在辐射强度的测量因此光电倍增管必须安装在暗室中，并仔细屏蔽杂散光的影响暗室中，并仔细屏蔽杂散光的影响 41第41页，

29、此课件共145页哦3.53.5信号指示系统信号指示系统(读数指示器读数指示器)作用：放大信号并以适当方式指示或记录作用：放大信号并以适当方式指示或记录下来下来常用的信号指示装置：直读检流计、电常用的信号指示装置：直读检流计、电位调节指零装置以及数字显示或自动记录位调节指零装置以及数字显示或自动记录装置等很多型号的分光光度计装配有微装置等很多型号的分光光度计装配有微处理机，一方面可对分光光度计进行操作处理机，一方面可对分光光度计进行操作控制，另一方面可进行数据处理控制，另一方面可进行数据处理42第42页，此课件共145页哦3.63.6紫外可见分光光度计的类型紫外可见分光光度计的类型3.6.3.6

30、.1 单光束分光光度计单光束分光光度计o单光束分光光度计光路示意如后图所示单光束分光光度计光路示意如后图所示(仪器部件仪器部件)，经单色器分光后的平行光通过吸，经单色器分光后的平行光通过吸收池，进入检测器，进行吸光度的测定其收池，进入检测器，进行吸光度的测定其结构简单，操作方便，适用于常规分析结构简单，操作方便，适用于常规分析o属于此类光度计的有国产属于此类光度计的有国产72型、型、721型、型、723型、型、751型和型和752型等型等o结构简单，操作方便，维修容易，适用于常结构简单，操作方便，维修容易，适用于常规分析规分析43第43页，此课件共145页哦单光束分光光度计单光束分光光度计可变

31、波长单光束紫外可变波长单光束紫外-可见分光光度计示意图可见分光光度计示意图44第44页，此课件共145页哦3.6.3.6.2 双光束分光光度计双光束分光光度计45第45页，此课件共145页哦o将单色器所得的单色辐射，用切光器分成将单色器所得的单色辐射，用切光器分成两个光束，分别通过试样溶液和溶剂溶液，两个光束，分别通过试样溶液和溶剂溶液，这两个光束可通过与前一切光器同步的另这两个光束可通过与前一切光器同步的另一切光器在不同时间内交替由一个检测器一切光器在不同时间内交替由一个检测器来接受，并通过一个光电计时信号系统把来接受，并通过一个光电计时信号系统把来自两个光束的信号加以比较，获得吸光来自两个

32、光束的信号加以比较，获得吸光度度 46第46页，此课件共145页哦双光束分光光度计的优点：双光束分光光度计的优点：o双光束分光光度计一般都能自动记录吸双光束分光光度计一般都能自动记录吸收光谱曲线收光谱曲线o双光束仪器由于样品溶液与溶剂的对比双光束仪器由于样品溶液与溶剂的对比几乎是同时进行的，光源和检测系统的几乎是同时进行的，光源和检测系统的漂移可以得到一些补偿漂移可以得到一些补偿o由于两束光同时分别通过参比池和样品由于两束光同时分别通过参比池和样品池，还能自动消除光源强度变化所引起池，还能自动消除光源强度变化所引起的误差的误差47第47页，此课件共145页哦3.6.3.6.3 双波长分光光度计

33、双波长分光光度计o这种仪器是将一共同光源发出的辐射通过一特这种仪器是将一共同光源发出的辐射通过一特制的单色器，此单色器内设有两个可以单独调制的单色器，此单色器内设有两个可以单独调节的光栅，经光栅色散后，两种波长的辐射交节的光栅，经光栅色散后，两种波长的辐射交替通过切光器，又重新合并成同一光束，经过替通过切光器，又重新合并成同一光束，经过试液后到达光电倍增管，仪器配有一个同步开试液后到达光电倍增管，仪器配有一个同步开关装置以区别接通相应于各光束的电信号，经关装置以区别接通相应于各光束的电信号，经过仪器内的电子学单元装置可测量两种波长的过仪器内的电子学单元装置可测量两种波长的吸光度差值吸光度差值

34、A，其方框图如图所示，其方框图如图所示 48第48页，此课件共145页哦根据两波长根据两波长1和和2处吸光度差值处吸光度差值 A与吸光物质与吸光物质浓度浓度c的关系进行分析的的关系进行分析的 49第49页，此课件共145页哦工作原理调节仪器使两者入射光强度相同50第50页，此课件共145页哦o即在两波长处吸光度差即在两波长处吸光度差 A与物质浓度与物质浓度c成正比成正比51第51页，此课件共145页哦3-6 光度测量误差一、仪器测量误差1 测量误差的来源光源的不稳、检测器不灵敏和光电流测量不准确等等，在仪器透光率读数尺上表现为读数误差T对于同一台光度仪器，T基本上为一常数，一般为0.010.0

35、02这个读数误差是限制光度分析准确度的主要原因 52第52页，此课件共145页哦透光率与浓度测量误差oTc之间关系为对数性质，同样，T对不同浓度的溶液造成的c不同o当被测物质浓度很小时，由T造成的c也很小，但由于浓度c本身很小，相对误差c/c仍然较大o当被测物质的浓度很大时，由T 造成的c很大，所以相对误差c/c也较大 53第53页，此课件共145页哦只有当被测物质浓度c在适当范围时，即透光率T（或吸光度A）在适当范围时，仪器的测量误差所引起的结果的相对误差才比较小 o依比尔定律 A=-lgT=abco将上式写成自然对数并微分54第54页，此课件共145页哦o浓度测量误差不仅与仪器的绝对误差有

36、关，而且还与它本身的透光率有关 55第55页，此课件共145页哦o要使c/c最小，TInT应最大，即：56第56页，此课件共145页哦oT=1565%(A=0.20.8)范围内，浓度测量的相对误差较小oA过大或过小，误差非常大，不适于高含量或较低含量组分的测定o为了控制合适的读数范围，宜采取的方法有：1)控制溶液的浓度；2)选择不同厚度的吸收池57第57页，此课件共145页哦二、测量条件的选择辐射波长和狭缝宽度的选择根据吸收曲线，选择溶液具有最大吸收时的波长为宜优点：摩尔系数大，测定灵敏度高；在此波长处的一个较小范围内，吸光度随波长变化不大，不会造成对比尔定律的偏离，测定有较高的准确度58第5

37、8页，此课件共145页哦狭缝宽度 o狭缝的宽度直接影响到测定的灵敏度和标准曲线的线性范围狭缝宽度增大，入射光的单色性降低，在一定程度上使灵敏度下降，标准曲线偏离比尔定律，狭缝的宽度以减小狭缝宽度时，试样的吸光度不再增加为止一般情况下，狭缝宽度约是吸收峰半宽度的1/1059第59页，此课件共145页哦2 控制适当的吸光度范围o控制标准溶液和被测溶液的吸光度在0.20.8范围内o可以从控制溶液浓度和选择不同厚度的吸收池来考虑 60第60页，此课件共145页哦3 控制影响溶液吸收光谱的变量o影响一种溶液吸收光谱的常见变量有溶液的酸度、温度、高电解质浓度、溶剂的性质和存在的干扰物质等o必须了解这些变量

38、的影响，选择控制这些变量的条件 61第61页，此课件共145页哦4 选择适当的参比溶液 o总原则：试液的吸光度真正反映待测物的浓度o测量吸光度时，利用参比溶液来调节仪器的零点，可以消除由于吸收池器壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差A=lgI0/I=I参比I试液62第62页，此课件共145页哦选择参比溶液的原则o仅待测物与显色剂的反应产物有吸收，可用纯溶剂作参比溶液o若显色剂或其它试剂略有吸收，应用空白溶液（不加试样）作参比o试样中其它组份有吸收，但不与显色剂反应，则当显色剂无吸收时，选用试样溶液作参比溶液（不加显色剂）；当显色剂略有吸收时，在试样中加入适当掩蔽剂，再加显色剂，以此溶液作参比

39、溶液63第63页，此课件共145页哦三、显色反应及显色条件的选择o进行比色分析或光度分析时，常需把待测组份转化为有色或有吸收的化合物，然后进行测定o显色反应：将待测组份转变成有色化合物的反应o显色剂：与待测组份形成有色化合物的试剂o在分析工作中选择合适的显色反应，并严格控制反应条件，是十分重要的 64第64页，此课件共145页哦(一一)显色反应的选择显色反应的选择 显色反应可分为两大类，即络合反应和氧化还原反应，而络合反应是最重要的显色反应同一组分常可与多种显色剂反应，生成不同的有色物质，在分析时，究竟选用何种显色反应较适宜，应考虑以下因素 65第65页，此课件共145页哦1 灵敏度足够高 o

40、光度法一般用于微量组分的测定，因此，选择灵敏的显色反应是应考虑的主要方面摩尔吸光系数的大小是显色色反应灵敏度高低的重要标志，因此应当选择生成的有色物质的较大的显色反应一般来说，当值为104105时，可认为该反应灵敏度较高66第66页，此课件共145页哦2 选择性好，干扰少，或干扰易消除 选择性好指显色剂仅与一个组分或少数几个组分发生显色反应 仅与某一种离子发生反应者称为特效的(或专属的）显色剂这种显色剂实际上是不存在的，但是干扰较少或干扰易于除去的显色反应是可以找到的 67第67页，此课件共145页哦3 显色剂在测定波长处无明显吸收 o这样，试剂空白值小，可以提高测定的准确度通常把两种有色物质

41、最大吸收波长之差称为“对比度”，一般要求显色剂与有色化合物的对比度L在60 nm以上 68第68页，此课件共145页哦4 反应生成的有色化合物组成恒定，化学性质稳定 o对于形成不同络合比的络合反应，必须注意控制实验条件，使生成一定组成的络合物，以免引起误差 o性质稳定，至少保证在测量过程中溶液的吸光度变化小这就要求有色化合物不容易受外界环境条件的影响，如日光照射、空气中的氧和二氧化碳的作用等，此外，亦不应受溶液个其他化学因素的影响否则将影响吸光度测定的准确度及再现性 69第69页，此课件共145页哦(二二)显色条件的选择显色条件的选择 o吸光光度法是测定显色反应达到平衡时溶液的吸光度，因此要能

42、得到准确的结果，必须从研究平衡着手，了解影响显色反应的因素，控制适当的条件，使显色反应充全和稳定o现对显色的主要条件讨论如下 70第70页，此课件共145页哦1 显色剂用量 o 显色反从一般可用下式表示：M 十 nR MRn (待测组分)(显色剂)(有色化合物)或 71第71页，此课件共145页哦o式中M代表金属离子，R为显色剂，n为络合物的累积稳定常数由上式可见，当R固定时，从M转化成MRn的转化率将不发生变化对稳定性好的（即n大）络合物，只要显色剂过量，显色反应即能定量进行而对不稳定的络合物或可形成逐级络合物时，显色剂用量要过量很多或必须严格控制 72第72页，此课件共145页哦o根据溶液

43、平衡原理，有色络合物稳定常数愈大，显色剂过量愈多，愈有利于待测组分形成有色络合物但是过量显色剂的加入，有时会引起副反应的发生，对测定反而不利显色剂的适宜用量常通过实验来确定 73第73页，此课件共145页哦o其方法是将待测组分的浓度及其它条件固定，然后加入不同量的显色剂，测定其收光度，绘制吸光度(A)浓度(c)关系曲线，一般可得到下图所示三种不同的情况：图3-01 吸光度与显色剂浓度的关系曲线 74第74页，此课件共145页哦2酸度a)影响显色剂的平衡浓度和颜色o 由于大多数有机显色剂是有机弱酸，在溶液中存在着下列平衡：M+HR MR+H+增大H+，对显色反应不利酸度改变，将引起平衡移动，从而

44、影响显色剂及有色化合物的浓度变化，可能引起配位基团(R-)数目的改变以致改变溶液的颜色 75第75页，此课件共145页哦 b)影响被测金属离子的存在状态 o酸度对待测离子存在状态及是否发生水解也是有影响的酸度太低，水解水解反应的存在对显色反应不利发生成沉淀，则使显色反应无法进行opH值增大会引起某些金属离子水解而形成各种型体的羟基络合物，甚至可能析出沉淀；或者由于生成金属的氢氧化物沉淀而破坏了有色络合物，使溶液的颜色完全退去 76第76页，此课件共145页哦c)影响络合物的组成 o对于生成逐级络合物的显色反应，酸度不同，络合物的络合比往往不同，其颜色也往往不同 o由于pH值不同，可形成具有不同

45、配位数、不同颜色的配台物金属离子与弱酸阴离子在酸性溶液中大多生成低配位数的配合物，可能并没有达到阴离子的最大配位数当pH值增大时，游离的阴离子浓度相应增大，使得可能生成高配位效的化合物 77第77页，此课件共145页哦o如磺基水杨酸与Fe3+的显色反应，在不同酸度下，可能生成1:1、1:2和1:3三种颜色不同的络合物，因此在用这类反应进行测定时，控制溶液的pH至关重要opH值范围 络合物组成 颜 色 1.84 Fe(C7H4O3)+紫红色 48 Fe(C7H4O3)2-棕褐色 811.5 Fe(C7H4O3)33-黄色 78第78页，此课件共145页哦o一种金属离子与某种显色剂反应的适宜酸度范

46、围，是通过实验来确定的o确定的方法是固定待测组分及显色剂浓度，改变溶液pH值，测定其吸光度作出吸光度与pH关系曲线，如图所示选择曲线平坦部分对应的pH值作为测定条件 79第79页，此课件共145页哦3 显色温度o显色反应一般在室温下进行，有的反应则需要加热，以加速显色反应进行完全有的有色物质当温度偏高时又容易分解为此，对不同的反应，应通过实验找出各自适宜的温度范围80第80页，此课件共145页哦4 显色时间 o大多数显色反应需要经一定的时间，才能完成时间的长短又与温度的高低有关有的有色物质在放置时，受到空气的氧化或发生光化学反应，会使颜色减弱因此必须通过实验，作出在一定温度下(一般是室温下)的

47、吸光度时间关系曲线，求出适宜的显色时间 81第81页，此课件共145页哦5 干扰的消除 o光度分析中，体系内存在的干扰物质的影响有以下几种情况：1)共存离子如本身有颜色，或与显色剂作用生成有色化合物，在测定条件下也吸收；2)在显色条件下，干扰物质水解，析出沉淀使溶液混浊，致使吸光度的测定无法进行；3)与待测离子或显色剂形成更稳定的络合物，使显色反应不能进行完全都将干扰测定 82第82页，此课件共145页哦消除共存离子干扰的方法o(1)加入络合掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂，使干扰离子生成无色络合物或无色离子o(2)选择适当的显色条件以避免干扰o(3)利用校正系数o(4)利用参比溶液消除显色剂和某些共存

48、有色离子的干扰o(5)选择适当的波长o(6)分离干扰离子83第83页，此课件共145页哦四、显色剂四、显色剂 1 无机显色剂o无机显色剂在光度分析中应用不多，这主要是因为生成的络物不够稳定，灵敏度和选择性也不高目前，应用较多的仅有硫氰酸盐、钼酸铵和过氧化氢等下表列出了它们的些应用 84第84页，此课件共145页哦表3-02 常用的无机显色剂及应用85第85页，此课件共145页哦2 有机显色剂 o大多数有机显色剂常与金属离子生成稳定的螯合物，显色反应的选择性和灵敏度都较高有些有色螯合物易溶于有机溶剂，故可进行萃取光度法，进一步提高测定的灵敏度和选择性 o它广泛应用于吸光光度分析中正是由于有机显色

49、剂的研制和应用，推动了吸光光度分析法的应用和发展o目前研制高灵敏度和高选择性的显色剂仍然是吸光光度法研究中的重要课题 86第86页，此课件共145页哦生色团和助色团o有机显色剂及其产物的颜色与它们的分子结构有密切关系根据实践得知分子中含有一个或一个以上的某些不饱和基团(共轭体系)的有机化合物，往往是有颜色的，这些基团称为发色团(或生色团)o 有机显色剂中一般都含有生色团和助色团 87第87页，此课件共145页哦o生色团有机化合物分子中的不饱和键基团，能吸收波长大于200nm的光这种基团称为广义的生色团例如，偶氮基(一N=N一)、羰基(C=O)、硫碳基(C=S)、亚硝基(一N=O)等 88第88

50、页，此课件共145页哦o助色团某些含有弧对电子的基团，虽然本身没有颜色，但它们的存在却会影响有机试剂及其与金属离子的反应产物的颜色，这些基因称为助色团 o助色团与生色团上的不饱和键相互作用，可以影响有机化合物对光的吸收，使颜色加深例如，胺基(-NH2、RNH-或R2N-)、羟基(-OH)、巯基(-SH)、-Cl-、-Br-等 89第89页，此课件共145页哦1 偶氮类显色剂 o凡含有偶氮结构的有机化合物，都是带色的物质 o当偶氮基两端与芳烃碳原子相连，而且在其邻位上有一定的络合基团(-OH，-AsO3H2、-COOH，-N)时，此类化合物在一定的条件下就能与某些金属离子作用，改变生色团的电子云