1.2基因工程的基本操作程序(上课).ppt

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1、基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 原核细胞的基因结构原核细胞基因原核细胞基因编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的合成，即能够编码蛋白质合成，即能够编码蛋白质非编码区（调控序列）：位于编码区上游和非编码区（调控序列）：位于编码区上游和编码区下游的编码区下游的DNA序列，虽不序列，虽不能指导有关蛋白质的合成，但能指导有关蛋白质的合成，但有调控遗传信息表达的核苷酸有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等序列，如启动子、终止子等原核细胞的基因结构 RNA聚合酶的作用是催化聚合酶的作用是催化DNA转录为转录为RNA。它能够识别调控序列中的结合

2、位点，并与其结合。它能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，转录开始后，RNA聚合酶沿聚合酶沿DNA分子移动，并分子移动，并与与DNA分子的一条链为模板合成分子的一条链为模板合成RNA。真核细胞的基因结构与原核细胞比较，真核细胞基因结构的主要特点是：与原核细胞比较，真核细胞基因结构的主要特点是：编码区是间隔的、不连续的。也就是说，能够编码编码区是间隔的、不连续的。也就是说，能够编码蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的序列分隔开来，成蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的序列分隔开来，成为一种断裂的形式。为一种断裂的形式。其中，能够编码蛋白质的序列叫做其中，能够编码蛋白质的序列叫做外显子外显

3、子，一般不，一般不能够编码蛋白质的序列叫做能够编码蛋白质的序列叫做内含子内含子。真核细胞的基因结构真核细胞基因真核细胞基因编码区编码区（间隔、不连续）（间隔、不连续）外显子：能编码蛋白质外显子：能编码蛋白质的的DNA序列序列内含子：不能编码蛋白内含子：不能编码蛋白质的质的DNA序列序列非编码区：与原核生物具有相似功能的启非编码区：与原核生物具有相似功能的启动子、终止子动子、终止子原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是连续的连续的编码区是间隔编码区是间隔的、不连续的的、不连续的相同点相同点都由能够编码蛋白质的编都由能够编码蛋白质的编码区和具有

4、调控作用的非码区和具有调控作用的非编码区组成的编码区组成的基因的种类（1）编码蛋白质的基因：包括结构基因和）编码蛋白质的基因：包括结构基因和调节基因。调节基因。（2）没有转译产物的基因：如）没有转译产物的基因：如rRNA基因基因和和tRNA基因。基因。（3）不能转录的）不能转录的DNA片段：如操纵基因。片段：如操纵基因。（目的基因）（目的基因）启动子与终止子 启动子启动子是在非编码区内，基因的是在非编码区内，基因的首端首端，它是它是RNA聚合酶识别和结合的部位，聚合酶识别和结合的部位，驱动驱动基因转录出基因转录出mRNA。终止子终止子是在非编码区内，基因的是在非编码区内，基因的尾端尾端，它，它

5、能阻碍能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使模板链上脱离下来，使转录终止转录终止。基因工程的基本操作流程目的基因的获得n从基因文库获得从基因文库获得基因文库基因文库n利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增n人工合成人工合成基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库(cDNA(cDNA文库文库)已知序列已知序列未知序列未知序列基因组文库和部分基因文库基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库基因组文库和部分基因文库cDNA合成过程 n第一步，反转录酶以第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与为模板合成一条与RNA互互补的补的DNA单链，形成单链，形成

6、RNA-DNA杂交分子。杂交分子。n第二步，核酸酶第二步，核酸酶H使使RNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNA链链降解，使之变成单链的降解，使之变成单链的DNA。n第三步，以单链第三步，以单链DNA为模板，在为模板，在DNA聚合酶的作用聚合酶的作用下合成另一条互补的下合成另一条互补的DNA链，形成双链链，形成双链DNA分子。分子。寻根问底（1）为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？提取不行吗？提示：提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基

7、因序列已知，不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的方式从含有该基因的生物的DNA中，中，直接获得，也可以通过反转录，用直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想

8、知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。就需要构建基因文库。利用PCR技术扩增目的基因原理原理:DNA双链复制双链复制前提前提:要有一段已知要有一段已知目的基因的脱目的基因的脱氧核苷酸序列，氧核苷酸序列，以便合成引物。以便合成引物。PCR基本操作过程：基本操作过程：n高温（高温（90-95摄氏度）变性摄氏度）变性 DNA解链解链n低温（低温（55-60摄氏度）复性摄氏度）复性 引物结合引物结合n中温（中温（70-75摄氏度）摄氏度）

9、延伸延伸 互补链的合成互补链的合成PCR基本操作条件：基本操作条件：n解旋酶、解旋酶、n引物、引物、n热稳定聚合酶（热稳定聚合酶（Taq酶）、酶）、n四种脱氧核苷酸、四种脱氧核苷酸、nDNA母链母链构建表达载体（核心）表达载体的组成表达载体的组成1.目的基因目的基因2.启动子启动子3.终止子终止子4.标记基因标记基因寻根问底：寻根问底：将目的基因直接导入受体细胞不是更简将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？便吗？如果这么做，结果会怎样？提示：提示：有人采用总有人采用总DNA注射法进行遗传转化，注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总即将一个生物中的总DNA提取出来，通过

10、注射提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。议颇多，严格来讲不算基因工程。基因工程载体的构建需要考虑哪些因素（1）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的的剪

11、接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。基因的产。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。的，而细菌无这些细胞器。（2）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产有弱，选择强启动子可

12、以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。的启动子。（3）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。正的转基因生物。将目的基因导入受体细胞（植物细胞）农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法将目的基因导入受体细胞（动物细胞）n显微注射法显微注射法1.提纯提纯2.取卵取卵3.注射注射4.移植移植将目的基因导入受体细胞（微生物细胞）nCa2+处理

13、处理感受态大肠杆菌细胞感受态大肠杆菌细胞目的基因的检测与鉴定n检测检测:n是否插入目的基因是否插入目的基因n是否转录是否转录n是否翻译是否翻译n鉴定鉴定:n功能活性鉴定功能活性鉴定n抗性鉴定抗性鉴定分别提取什么进行检测归纳步骤归纳:基因工程的基本操作程序1.1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRPCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2.2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法、基因枪法农杆菌转化法、显微注射法、基因枪法4.

14、4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译基因操作的基本步骤思考：思考：1.1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？因就可以完成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物生物之间进行基因交流，只

15、有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；增加一些其他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识

16、存在部细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。基因），如绿色荧光蛋白基因等。2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因若将一个抗病基因导入小麦中导入小麦中,理论上讲你应该怎样做理论上讲你应该怎样做?要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导

17、的物质，一般为乙酰丁香酮要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）区（诱导）的基因，使的基因，使T-DNA转移并插入到染色体转移并插入到染色体DNA上。上。3.3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些

18、蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。寻根问底：寻根问底：（1）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。）。（2）将将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环

19、素的基因，构建成一个表达载体。外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基珠蛋白基因已进入其中。因已进入其中。（4）培养进入了）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提

20、取破碎后从中提取-珠蛋白。珠蛋白。4.-4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？珠蛋白，想一想，应如何进行设计？1为为了了培培育育节节水水高高产产品品种种，科科学学家家将将大大麦麦中中与与抗抗旱旱节节水水有有关关的的基基因因导导入入小小麦麦，得得到到转转基基因因小小麦麦，其其水水分利用率提高了分利用率提高了20%。

21、这项技术的遗传学原理是。这项技术的遗传学原理是A基因重组基因重组 B基因突变基因突变 C基因复制基因复制 D基因分离基因分离巩固练习巩固练习A2利利用用苏苏云云金金芽芽孢孢杆杆菌菌的的抗抗虫虫基基因因培培育育的的抗抗虫虫棉棉是是否成功，最好检测否成功，最好检测A是否有抗生素产生是否有抗生素产生 B是否有目的基因表达是否有目的基因表达C是否有抗虫的性状出现是否有抗虫的性状出现 D是否能分离到目的基因是否能分离到目的基因 巩固练习巩固练习C3水水母母发发光光蛋蛋白白由由236个个氨氨基基酸酸构构成成，其其中中天天冬冬氨氨酸酸、甘甘氨氨酸酸和和丝丝氨氨酸酸构构成成发发光光环环，现现已已将将这这种种蛋

22、蛋白白质质的的基基因因作作为为生生物物转转基基因因的的标标记记，在在转转基基因因技技术术中中，这这种蛋白质的作用是种蛋白质的作用是A促使目的基因导入受体细胞促使目的基因导入受体细胞 B促使目的基因在受体细胞内复制促使目的基因在受体细胞内复制C使目的基因容易被检测出来使目的基因容易被检测出来 D使目的基因容易成功表达使目的基因容易成功表达巩固练习巩固练习C4 4根据根据mRNAmRNA的信息推出获取目的基因的方法是（）的信息推出获取目的基因的方法是（）A A、用用DNADNA探针测出目的基因探针测出目的基因B B、用用mRNAmRNA探针测出目的基因探针测出目的基因C C、用用mRNAmRNA反

23、转录形成目的基因反转录形成目的基因D D、用用PCRPCR技术扩增技术扩增mRNAmRNA巩固练习巩固练习C5 PCR5 PCR技术扩增技术扩增DNA,DNA,需要的条件是需要的条件是()()目目的的基基因因引引物物四四种种脱脱氧氧核核苷苷酸酸DNADNA聚聚合合酶酶等等mRNAmRNA核糖体核糖体A A、B B、C C、D D、巩固练习巩固练习A6 6 获获取取目目的的基基因因的的方方法法有有多多种种，下下列列不不属属于于目目的的基因获取方法的是（）基因获取方法的是（）A A、从基因组文库中获取从基因组文库中获取B B、从从cDNAcDNA文库中获取文库中获取 C C、从含目的基因生物细胞中

24、获取从含目的基因生物细胞中获取D D、利用利用PCRPCR技术获取技术获取巩固练习巩固练习C7 7 下下列列高高科科技技成成果果中中，根根据据基基因因重重组组原原理理进进行行的的是是（）A A、我我国国科科学学家家袁袁隆隆平平利利用用杂杂交交技技术术培培育育出出超超级级水稻。水稻。B B、我我国国科科学学家家将将苏苏云云金金杆杆菌菌的的某某些些基基因因转转移移到到棉花体内，培育出抗虫棉。棉花体内，培育出抗虫棉。C C、我我国国科科学学家家通通过过返返回回式式卫卫星星搭搭载载种种子子培培育育出出太空椒。太空椒。D D、我国科学家通我国科学家通过过体体细细胞胞克隆克隆技技术术培育出克隆培育出克隆牛。牛。巩固练习巩固练习A C