经典液相色谱法课件.ppt

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1、1第1页，此课件共63页哦 第第1 1节节 液液-固吸附柱色谱法（固吸附柱色谱法（LSCLSC）经典的液经典的液固吸附色谱（固吸附色谱（liquidsolidadsorptionchromatography，LSC）是以吸附）是以吸附剂为固定相，有机溶剂为流动相，利用不同组分在剂为固定相，有机溶剂为流动相，利用不同组分在吸附剂上吸附性能的差异，进行分离分析的方法。吸附剂上吸附性能的差异，进行分离分析的方法。用于分离分析极性至弱极性的化合物，不适用于用于分离分析极性至弱极性的化合物，不适用于分离分析强极性的物质。分离分析强极性的物质。一、基本原理一、基本原理 1 1吸附与吸附平衡吸附与吸附平衡

2、第2页，此课件共63页哦 吸吸附附过过程程是是试试样样中中组组分分分分子子与与流流动动相相分分子子争争夺吸附剂表面活性中心的过程。夺吸附剂表面活性中心的过程。图图10-1 10-1 吸附色谱示意图吸附色谱示意图m.m.流流动动相相 a.a.吸吸附附剂剂 Xm.Xm.流流动动相相中中溶溶质质分分子子 Ym.Ym.流流动动相相分分子子 Xa.Xa.被被吸吸附的溶质分子附的溶质分子 第3页，此课件共63页哦这种吸附平衡过程可表示为这种吸附平衡过程可表示为吸附平衡常数吸附平衡常数:因因为为流流动动相的量很大，相的量很大，近似于常数，而且近似于常数，而且吸附只发生于吸附剂表面，所以，吸附平衡常数可吸附只

3、发生于吸附剂表面，所以，吸附平衡常数可写成写成第4页，此课件共63页哦CS为溶质在固定相表面的分析浓度，为溶质在固定相表面的分析浓度，Cm为溶质在流动相中的分析浓度为溶质在流动相中的分析浓度 K K与组分的性质、吸附剂的活性、流动相的与组分的性质、吸附剂的活性、流动相的 性质及温度有关。性质及温度有关。第5页，此课件共63页哦 K值小，说明该物质的吸附能力弱，在固定相中值小，说明该物质的吸附能力弱，在固定相中滞留时间短，移动速率快，先流出色谱柱；若滞留时间短，移动速率快，先流出色谱柱；若K值值大，说明该物质大，说明该物质的吸附能力强的吸附能力强，在固定相中滞留时间，在固定相中滞留时间长，移动速

4、率慢，后流出色谱柱。长，移动速率慢，后流出色谱柱。在一定条件下，在一定条件下，不同组分因吸附系数的差异得以分离。不同组分因吸附系数的差异得以分离。2 2吸附等温线吸附等温线 在一定温度下，某一组分在固定相和流动相在一定温度下，某一组分在固定相和流动相 之间之间达到平衡时，以组分在固定相中的浓度达到平衡时，以组分在固定相中的浓度C Cs s为纵坐标，为纵坐标，以组分在流动相中的浓度以组分在流动相中的浓度C Cm m为横坐标得到的曲线。为横坐标得到的曲线。第6页，此课件共63页哦等温线有三种类型：线性、凸形和凹形。通常在低等温线有三种类型：线性、凸形和凹形。通常在低浓度时，每种等温线均呈线性，而高

5、浓度时，等温浓度时，每种等温线均呈线性，而高浓度时，等温线则呈凸形（常见）或凹形。线则呈凸形（常见）或凹形。吸附等温吸附等温柱柱内内溶溶质质浓度分布浓度分布柱柱内内溶溶质质浓浓度度的的分分布曲线布曲线流出曲线流出曲线 保保留留时时间间与与进进样样量量的关系的关系 第7页，此课件共63页哦二、二、吸附剂吸附剂1.1.对吸附剂的要求：对吸附剂的要求：(1)表面积大，具有一定的吸附能力。表面积大，具有一定的吸附能力。(2)不应与流动相发生化学反应。不应与流动相发生化学反应。(3)粒度要细，一般为粒度要细，一般为150目左右。目左右。2.2.2.2.常用吸附剂常用吸附剂常用吸附剂常用吸附剂有机类有机类

6、 活性炭、淀粉、葡萄糖、聚酰胺、大孔活性炭、淀粉、葡萄糖、聚酰胺、大孔 树脂等树脂等无机类无机类 氧化铝、硅胶、活性炭、碳酸钙、氧化铝、硅胶、活性炭、碳酸钙、硅藻土等硅藻土等（1 1 1 1）硅胶（）硅胶（）硅胶（）硅胶（SiOSiOSiOSiO2 2 2 2xHxHxHxH2 2 2 2O O O O）第8页，此课件共63页哦结构结构：内部内部硅氧交联结构硅氧交联结构多孔结构多孔结构 表面表面有硅醇基有硅醇基氢键作用氢键作用吸附活性中心吸附活性中心 游离羟基游离羟基(I)键合羟基键合羟基()硅醚结构硅醚结构()硅醚结构硅醚结构()没有吸附活性。没有吸附活性。第9页，此课件共63页哦由于硅胶具

7、有弱酸性，能与碱起反应，只适用于分由于硅胶具有弱酸性，能与碱起反应，只适用于分离酸性和中性化合物。离酸性和中性化合物。碱性氧化铝碱性氧化铝 pH 9pH 910 10 适于分析碱性、中性物质适于分析碱性、中性物质 中性氧化铝中性氧化铝 pH7.5 pH7.5 适于分析酸性碱性和中性物质适于分析酸性碱性和中性物质 酸性氧化铝酸性氧化铝 pH 4pH 45 5 适于分析酸性、中性物质适于分析酸性、中性物质（2 2）氧化铝）氧化铝(3)(3)聚酰胺聚酰胺由酰胺聚合而成的高分子物质由酰胺聚合而成的高分子物质。第10页，此课件共63页哦酰胺基中的羰基与酚类、黄酮类、酚类中的酰胺基中的羰基与酚类、黄酮类、

8、酚类中的羟基或羧基形成氢键；酰胺基中的氨基与醌类、羟基或羧基形成氢键；酰胺基中的氨基与醌类、硝基类中的醌基、硝基形成氢键而产生吸附作用。硝基类中的醌基、硝基形成氢键而产生吸附作用。（4 4）大孔吸附树脂）大孔吸附树脂 一种不含交换基团，具有大孔网一种不含交换基团，具有大孔网状结构的高分子吸附剂。理化性质稳状结构的高分子吸附剂。理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂。大孔定，不溶于酸、碱及有机溶剂。大孔树脂可分为非极性和中等极性两类，树脂可分为非极性和中等极性两类，在水溶液中吸附力较强且有良好的吸在水溶液中吸附力较强且有良好的吸附选择性，而在有机溶剂中吸附能力附选择性，而在有机溶剂中吸附能力较弱。

9、较弱。第11页，此课件共63页哦硅胶含水量硅胶含水量（%）氧化氧化铝铝含水含水量（量（%）活度活度级别级别051525380361015表表10-1 硅胶、氧化铝的含水量与活度级别的关系硅胶、氧化铝的含水量与活度级别的关系2.2.吸附剂的吸附活性：吸附剂的吸附活性：氧氧化化铝铝、硅硅胶胶的的吸吸附附力力的的大大小小,还还与与其其含含水水量量有有较较大大的的关系：关系：第12页，此课件共63页哦活度级数活度级数含水量含水量活性活性吸附能力吸附能力小小少少大大强强大大多多小小弱弱加热除水，活性提高，吸附力加强（活化）加热除水，活性提高，吸附力加强（活化）吸水，活性下降，吸附力减弱。吸水，活性下降，

10、吸附力减弱。三、色谱条件的选择三、色谱条件的选择选择色谱分离条件时，必须从吸附剂、被分离物质、选择色谱分离条件时，必须从吸附剂、被分离物质、流动相流动相(洗脱剂洗脱剂)三方面进行综合考虑。三方面进行综合考虑。第13页，此课件共63页哦1.1.被分离物质的极性被分离物质的极性被分离物质的极性越大被分离物质的极性越大,被吸附剂吸附得越牢被吸附剂吸附得越牢!常见的化合物极性大小顺序常见的化合物极性大小顺序:烷烃烷烃烯烃烯烃醚类醚类硝基化合物硝基化合物二甲胺二甲胺脂类脂类酮类酮类醛类醛类硫醇硫醇胺类胺类酰胺酰胺醇类醇类酚类酚类羧酸羧酸类类被分离物质的极性与结构的关系被分离物质的极性与结构的关系(1)基

11、本母核相同基本母核相同,基团极性愈大基团极性愈大,分子极性愈大。分子极性愈大。基本母核相同基本母核相同,极性基团数目愈多极性基团数目愈多,分子极性愈大。分子极性愈大。(2)分子双键多分子双键多,吸附力吸附力。(3)空间排列空间排列,影响极性。影响极性。例如羟基处于能形成分子内氢键的位置时例如羟基处于能形成分子内氢键的位置时第14页，此课件共63页哦2.吸附剂的活性吸附剂的活性:吸附剂的活性吸附剂的活性大，对被测组分的吸附能力大，对被测组分的吸附能力强强物质的极性物质的极性吸附剂活性吸附剂活性大大小小防吸附太牢防吸附太牢,难洗脱难洗脱小小大大防防tR太小太小,不易分离不易分离3.3.流动相的极性

12、流动相的极性流动相极性大，对被测组分的洗脱能力强流动相极性大，对被测组分的洗脱能力强第15页，此课件共63页哦常用流动相极性强弱顺序常用流动相极性强弱顺序:石石油油醚醚环环己己烷烷四四氯氯化化碳碳苯苯甲甲苯苯乙乙醚醚氯氯仿仿醋醋酸酸乙乙酯酯正正丁丁醇醇丙丙醇醇乙乙醇醇、甲甲醇醇 1,说明B+较牢地结合在树脂上 KB/A 1,说明A+较牢地结合在树脂上 所以KB/A说明了树脂对A+、B+两种离子选择性交换的能力,故也称之为选择性系数选择性系数。第21页，此课件共63页哦 用离子交换树脂分离不同离子时，样品组分离子用离子交换树脂分离不同离子时，样品组分离子与流动相离子在树脂上产生竞争交换，交换能力

13、弱的离与流动相离子在树脂上产生竞争交换，交换能力弱的离子易被流动相洗脱。选择性系数大的离子交换能力强，子易被流动相洗脱。选择性系数大的离子交换能力强，保留时间长，后流出色谱柱。结果各种离子按选择性系保留时间长，后流出色谱柱。结果各种离子按选择性系数的大小顺序被洗脱。数的大小顺序被洗脱。二、离子交换树脂结构与分类二、离子交换树脂结构与分类离子交换树脂是具有网状立体结构的高分子多元酸离子交换树脂是具有网状立体结构的高分子多元酸或多元碱的聚合物。常用的是聚苯乙烯型离子交换或多元碱的聚合物。常用的是聚苯乙烯型离子交换树脂。它是以苯乙烯和二乙烯苯聚合而成球形网状树脂。它是以苯乙烯和二乙烯苯聚合而成球形网

14、状结构，结构，聚苯乙烯型磺酸基阳离子交换树脂的制备：聚苯乙烯型磺酸基阳离子交换树脂的制备：第22页，此课件共63页哦磺酸化磺酸化交联剂交联剂如果用其它基团代替磺酸基，如果用其它基团代替磺酸基，就可以得到一系列阳离子交换就可以得到一系列阳离子交换树脂。例如树脂。例如COOH、OH等。等。这些基团上的氢离子可被样品这些基团上的氢离子可被样品溶液中的阳离子交换。溶液中的阳离子交换。RSO RSO3 3-HH+X+X+RSO RSO3 3-X X+H+H+第23页，此课件共63页哦阴离子交换树脂具有与阳离子交换树脂同样的有阴离子交换树脂具有与阳离子交换树脂同样的有机骨架，只是在骨架上引入了可离解的碱性

15、基团，机骨架，只是在骨架上引入了可离解的碱性基团，如如季胺基季胺基(NR3OH)等等，就成为阴离子交换树，就成为阴离子交换树脂。其交换反应如下：脂。其交换反应如下：三、离子交换树脂的性能三、离子交换树脂的性能 1.交联度交联度:交换树脂中交换树脂中,交联剂交联剂(二乙烯苯二乙烯苯)的含量为的含量为交联度交联度,以重量百分比表示。以重量百分比表示。第24页，此课件共63页哦交联度交联度网眼网眼交换速度交换速度离子离子选择性选择性大大小小慢慢小离子小离子好好小小大大快快大小离子大小离子差差阳离子交换树脂一般交联度阳离子交换树脂一般交联度8%阴离子交换树脂一般交联度阴离子交换树脂一般交联度4%2.2

16、.交换容量交换容量:交换容量是指每克干树脂能参加交换反应的活性交换容量是指每克干树脂能参加交换反应的活性基团数。一般为基团数。一般为110mmol/g。它反映了离子交换树脂进行离子交换反应的能力，决定于它反映了离子交换树脂进行离子交换反应的能力，决定于网状结构内所含有的酸性或碱性基团的数目。树脂的结构网状结构内所含有的酸性或碱性基团的数目。树脂的结构与组成、溶液的与组成、溶液的pH等因素都影响交换容量。等因素都影响交换容量。第25页，此课件共63页哦第第4节节空间排阻柱色谱法（空间排阻柱色谱法（SEC）利用被测组分分子大小不同，在固定相上选择性渗利用被测组分分子大小不同，在固定相上选择性渗透，

17、实现分离。透，实现分离。主要用于大分子物质如蛋白质、多主要用于大分子物质如蛋白质、多糖等的分离。糖等的分离。固定相固定相多孔性凝胶多孔性凝胶 流动相流动相水水凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱 流动相流动相有机溶剂有机溶剂凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱 一、基本原理一、基本原理1 1分子筛效应分子筛效应 第26页，此课件共63页哦体积大的组分完全不能进入凝胶颗体积大的组分完全不能进入凝胶颗粒内的孔隙中，只能经过凝胶颗粒粒内的孔隙中，只能经过凝胶颗粒之间的间隙随流动相最先流出色谱之间的间隙随流动相最先流出色谱柱；而体积小的组分，可渗入凝胶柱；而体积小的组分，可渗入凝胶颗粒内的孔隙中，因此在流经凝胶颗粒内的孔隙中

18、，因此在流经凝胶颗粒之间的间隙和全部凝胶颗粒的颗粒之间的间隙和全部凝胶颗粒的孔隙之后，最后流出；介于大小分孔隙之后，最后流出；介于大小分子中间的组分，只能进入一部分颗子中间的组分，只能进入一部分颗粒内较大的孔隙，在中间时间段流粒内较大的孔隙，在中间时间段流出。出。根据溶质分子大小的不同进行分离的现象称为分根据溶质分子大小的不同进行分离的现象称为分子筛效应子筛效应2 2渗透系数渗透系数K KP P 第27页，此课件共63页哦Xm与与Xs分别代表在孔外流动相中和凝胶孔隙中同等分别代表在孔外流动相中和凝胶孔隙中同等大小的溶质分子。平衡时，两者浓度之比为渗透系大小的溶质分子。平衡时，两者浓度之比为渗透

19、系数数根据空间排阻理论，凝胶孔内外同等大小的分根据空间排阻理论，凝胶孔内外同等大小的分子处于扩散平衡状态子处于扩散平衡状态 KpKpKpKp仅仅仅仅取取取取决决决决于于于于待待待待测测测测分分分分子子子子尺尺尺尺寸寸寸寸和和和和凝凝凝凝胶胶胶胶孔孔孔孔径径径径大大大大小小小小，与与与与流流流流动动动动相的性质无关相的性质无关相的性质无关相的性质无关第28页，此课件共63页哦在凝胶孔径一定时，当分子大到不能进入凝胶所有在凝胶孔径一定时，当分子大到不能进入凝胶所有空隙时（排斥极限），空隙时（排斥极限），XS=0，则，则KP=0；而当分子小到能进入所有空隙时（全渗透），而当分子小到能进入所有空隙时（

20、全渗透），XS=Xm，KP=1；分子尺寸在上述两种分子之间时，能进入部分空隙，分子尺寸在上述两种分子之间时，能进入部分空隙，0KP1.在高分子溶液中，相同成分的分子尺寸大小与分子在高分子溶液中，相同成分的分子尺寸大小与分子量成比例，因此，在一定范围内，量成比例，因此，在一定范围内，KP与分子量相与分子量相关，分子量小，关，分子量小，KP大。大。第29页，此课件共63页哦排斥极限与全渗透之间对应的分子量范围称为凝排斥极限与全渗透之间对应的分子量范围称为凝胶的分子量范围。选择凝胶时应使试样的分子量胶的分子量范围。选择凝胶时应使试样的分子量落入此范围。落入此范围。当组分的分子量在凝胶的分子量范围之内

21、时，其保留当组分的分子量在凝胶的分子量范围之内时，其保留体积与渗透系数有如下关系体积与渗透系数有如下关系:VS为凝胶孔隙的总体积（固定相体积），为凝胶孔隙的总体积（固定相体积），Vm为凝胶的粒间体积（流动相体积）为凝胶的粒间体积（流动相体积）二、二、二、二、固定相和流动相固定相和流动相固定相和流动相固定相和流动相第30页，此课件共63页哦固定相固定相常用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶常用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和和.聚苯乙烯凝胶等。聚苯乙烯凝胶等。要要选选择择对对样样品品的的溶溶解解好好，又又能能润润湿湿凝凝胶胶，粘粘度度要要低低的的溶溶剂剂，否否则则，会会限限制制分分子子扩扩散

22、散而而影影响响分分离离效效果果。一一般般水水溶溶性性试试样样选选水水溶溶液液，非非水水溶溶性性试试样样选选四四氢氢呋呋喃喃、氯氯仿仿、甲甲苯和二甲基甲酰胺等有机溶剂。苯和二甲基甲酰胺等有机溶剂。流动相流动相第第5 5节节 薄层色谱法（薄层色谱法（TLCTLC）第31页，此课件共63页哦 将固定相均匀地涂铺在具有光洁表面的玻璃、塑料或将固定相均匀地涂铺在具有光洁表面的玻璃、塑料或金属板上形成薄层，在此薄层上进行色谱分离分析的方法金属板上形成薄层，在此薄层上进行色谱分离分析的方法称为薄层色谱法（称为薄层色谱法（TLC）。）。铺有固定相的板子称为薄层板简称薄板。在薄层色谱法中铺有固定相的板子称为薄层

23、板简称薄板。在薄层色谱法中使用的流动相又称为展开剂。使用的流动相又称为展开剂。按分离机制薄层色谱法可分为吸附、离子交换、按分离机制薄层色谱法可分为吸附、离子交换、分配和分子排阻色谱法等。按薄层板的分离效率不同，分配和分子排阻色谱法等。按薄层板的分离效率不同，又可分为经典薄层色谱法又可分为经典薄层色谱法(TLC)及高效薄层色谱法及高效薄层色谱法(HPTLC)。本节主要讨论应用最为广泛的吸附薄层。本节主要讨论应用最为广泛的吸附薄层色谱法。色谱法。操作过程：操作过程：第32页，此课件共63页哦特点：特点：设备简单，操作方便，分析速度快，分离效率设备简单，操作方便，分析速度快，分离效率高，灵敏度高，显

24、色方便，结果直观，高，灵敏度高，显色方便，结果直观，预处理简单预处理简单。应用：应用：定性、药物杂质检查、纯度测定定性、药物杂质检查、纯度测定一、基本原理一、基本原理1.分离过程分离过程将混合组分的试液将混合组分的试液,点在铺了吸附剂的玻璃板一端点在铺了吸附剂的玻璃板一端,在密闭容器中用适当的溶剂在密闭容器中用适当的溶剂(展开剂、流动相展开剂、流动相)展开展开,各各组分不断地被吸附组分不断地被吸附,解吸附解吸附随展开剂前移随展开剂前移,利用吸附利用吸附剂对不同组分的吸附能力剂对不同组分的吸附能力(吸附平衡常数吸附平衡常数)不同不同,产生产生差速迁移差速迁移,而达到分离。而达到分离。第33页，此

25、课件共63页哦2.比移值比移值 RfA=a/c RfB=b/c一般要求一般要求组组分的分的 值值在在0.20.20.80.8之之间间。Rf=0 ，被固定完全吸附，被固定完全吸附,K Rf=1 ，组分不被固定相吸附，组分不被固定相吸附,K 0)0 Rf 1第34页，此课件共63页哦 比移值是薄层色谱的基本定性参数，它说明组分在比移值是薄层色谱的基本定性参数，它说明组分在色谱系统中的保留行为。比移值的数值除与组分的性质色谱系统中的保留行为。比移值的数值除与组分的性质有关外，还与薄层板的性质有关外，还与薄层板的性质(活性等活性等)、展开剂的性质、展开剂的性质(极性、组成等极性、组成等)和温度有关。和

26、温度有关。影响影响影响影响R Rf f 值的因素很多，值的因素很多，测量测量测量测量重复性较差重复性较差 3相对比移值相对比移值在一定条件下，吸附平衡常数越大，容在一定条件下，吸附平衡常数越大，容量因子量因子k就越大，则比移值越小。就越大，则比移值越小。第35页，此课件共63页哦讨论讨论对对照照品品与与被被测测组组分分在在完完全全相相同同条条件件下下展展开开，可可以以消消除除系系统统误误差差，大大大大提提高高重重现现性性和和可靠性；可靠性；对对照照品品可可以以是是后后加加入入纯纯物物质质，也可是样品中已知组分。也可是样品中已知组分。相相对对比比移移值值Rst与与组组分分、对对照照品品性性质质等

27、等因因素素有有关关，可可以以大大于于或小于或小于1。AB对对cab第36页，此课件共63页哦二、固定相二、固定相吸附柱色谱的固定相薄层色谱也可以使用吸附柱色谱的固定相薄层色谱也可以使用,如硅如硅胶、胶、Al2O3等，但粒度比柱色谱更细。等，但粒度比柱色谱更细。硅胶微带酸性，适用于酸性及中性物质的分离。硅胶微带酸性，适用于酸性及中性物质的分离。薄层色谱用硅胶粒度为薄层色谱用硅胶粒度为40m，硅胶硅胶G硅胶硅胶+煅石膏（煅石膏（CaSO4）硅胶硅胶H硅胶硅胶(未加任何物质未加任何物质)硅胶硅胶HF254硅胶硅胶+荧光物质荧光物质硅胶硅胶GF254硅胶硅胶+煅石膏煅石膏+荧光物质荧光物质氧化铝一般适

28、用于碱性物质和中性物质的分离氧化铝一般适用于碱性物质和中性物质的分离第37页，此课件共63页哦三、展开剂三、展开剂在吸附薄在吸附薄层层色色谱谱法中，展开法中，展开剂选择剂选择的一般原的一般原则则与吸与吸附柱色附柱色谱谱法中法中选择选择流流动动相的原相的原则则相同，主要根据被相同，主要根据被分离物分离物质质的极性、吸附的极性、吸附剂剂的活性以及展开的活性以及展开剂剂本身的本身的极性来极性来选则选则。第38页，此课件共63页哦实验中，一般先选择单一溶剂展开，对难分离组分，实验中，一般先选择单一溶剂展开，对难分离组分，则需使用二元、三元甚至多元的溶剂系统。则需使用二元、三元甚至多元的溶剂系统。在多元

29、展开剂中占比例较大的主要溶剂起溶解样在多元展开剂中占比例较大的主要溶剂起溶解样品和基本分离的作用，占比例较小的溶剂起调整品和基本分离的作用，占比例较小的溶剂起调整Rf值、改善分离度和对某些组分的选择性作用。值、改善分离度和对某些组分的选择性作用。如某一物质在用苯作展开剂时，移动距离太小，说明展开剂如某一物质在用苯作展开剂时，移动距离太小，说明展开剂的极性太小，此时可以加入一定量的乙醇等极性大的溶剂。再视的极性太小，此时可以加入一定量的乙醇等极性大的溶剂。再视分离的效果适当改变溶剂的配比，如苯分离的效果适当改变溶剂的配比，如苯:乙醇为乙醇为91、82或或73等。必要时甚至还要加一些酸或碱。一般希

30、望等。必要时甚至还要加一些酸或碱。一般希望Rf值在值在0.20.8之间较为满意。之间较为满意。第39页，此课件共63页哦四、操作方法四、操作方法1.1.薄层板制备薄层板制备 薄层板分为硬板与软板。软板的制备是直接将吸附薄层板分为硬板与软板。软板的制备是直接将吸附剂置于玻璃板上并使成为一均匀薄层便制成了一块软板。剂置于玻璃板上并使成为一均匀薄层便制成了一块软板。硬板的制备需要以下几个步骤：硬板的制备需要以下几个步骤：载板的准备。载板的准备。匀浆的制备：制备匀浆时匀浆的制备：制备匀浆时有时需要加一些粘合剂，常用有时需要加一些粘合剂，常用粘合剂有煅石膏、羧甲基纤维粘合剂有煅石膏、羧甲基纤维素钠（素钠

31、（CMC-Na）等。）等。第40页，此课件共63页哦煅石膏：吸附剂的煅石膏：吸附剂的9-15%9-15%左右左右羧甲基纤维素钠羧甲基纤维素钠CMC-NaCMC-Na：0.5-1%0.5-1%水溶液水溶液例如，取一定量的硅胶例如，取一定量的硅胶H放入研钵中，加入放入研钵中，加入3倍倍量的含有量的含有0.3%0.7%羧甲基纤维素钠（羧甲基纤维素钠（CMC-Na）的水溶液，朝同一方向研磨成均匀稀糊状）的水溶液，朝同一方向研磨成均匀稀糊状.铺板铺板 手工涂铺法手工涂铺法 机械涂铺法机械涂铺法 第41页，此课件共63页哦活化：将铺好的薄层板先凉干，再在活化：将铺好的薄层板先凉干，再在105110进行加热

32、活化，活化的程度等要根据样品进行加热活化，活化的程度等要根据样品的性质决定。的性质决定。2.2.点样点样 （1）样品溶液的制备）样品溶液的制备 应尽量避免用水作溶剂，因为水溶液斑点容易扩散，应尽量避免用水作溶剂，因为水溶液斑点容易扩散，且不易挥发。一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等挥发性且不易挥发。一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等挥发性有机溶剂，最好用与展开剂极性相似的溶剂。水溶性样有机溶剂，最好用与展开剂极性相似的溶剂。水溶性样品可先用少量水溶解，再用甲醇或乙醇稀释定容。品可先用少量水溶解，再用甲醇或乙醇稀释定容。第42页，此课件共63页哦（2）点样量）点样量点样量的多少视薄层的性能及显色剂的灵敏

33、度等而点样量的多少视薄层的性能及显色剂的灵敏度等而定，在检测器灵敏度足够时，应降低点样量。点样量太定，在检测器灵敏度足够时，应降低点样量。点样量太多，展开后会出现斑点过大或拖尾等现象，而影响分离多，展开后会出现斑点过大或拖尾等现象，而影响分离效果。效果。点样体积一般在点样体积一般在几到几十微克（几到几十微克（110 l）,点样量点样量太大太大,斑易拖尾斑易拖尾,影响分离效果。影响分离效果。(3)点样方法点样方法点样方式：接触式点样与喷雾式点样点样方式：接触式点样与喷雾式点样点样形状；点状、条状点样点样形状；点状、条状点样点样器具微量进样器、定量毛细管；点样器具微量进样器、定量毛细管；底距：底距

34、：1.52cm点距：点距：0.51cm原点直径原点直径：23mm。（边点边热风吹）。（边点边热风吹）第43页，此课件共63页哦第44页，此课件共63页哦起始线起始线第45页，此课件共63页哦3.展开展开将点好样的薄层板浸入展开剂中，展开剂借薄层板上将点好样的薄层板浸入展开剂中，展开剂借薄层板上固定相的毛细作用携带样品组分在薄层板上迁移一定固定相的毛细作用携带样品组分在薄层板上迁移一定距离的过程称为展开。距离的过程称为展开。（1）展开装置）展开装置 常常用用的的展展开开装装置置有有直直立立型型的的单单槽槽色色谱谱缸缸和和双双槽槽色色谱谱缸缸、圆圆形形色色谱谱缸缸、卧式色谱缸等。卧式色谱缸等。第4

35、6页，此课件共63页哦(2)展开方式展开方式 一般展开方式一般展开方式：上行、下行、双向等：上行、下行、双向等展开距离：展开距离：615cm注意点：注意点：展展开开剂剂浸浸薄薄层层板板下下端端0.5cm,不不能能浸浸住住起起始始线线,层层析析缸缸应密闭。应密闭。先饱和先饱和1530分钟分钟,再展开再展开,防止边缘效应。防止边缘效应。第47页，此课件共63页哦 边缘效应是指同一物质的边缘效应是指同一物质的色谱斑点，在薄层板上两边色谱斑点，在薄层板上两边缘部分的缘部分的Rf值大于中间部分值大于中间部分的的Rf值的现象。值的现象。这是由于色谱缸内溶剂蒸这是由于色谱缸内溶剂蒸气未达饱和，造成展开剂的气

36、未达饱和，造成展开剂的蒸发速率在薄层板两边与中蒸发速率在薄层板两边与中间部分不等。展开剂中极性间部分不等。展开剂中极性较弱和沸点较低的溶剂在边较弱和沸点较低的溶剂在边缘挥发的快些，致使边缘部缘挥发的快些，致使边缘部分的展开剂中极性溶剂比例分的展开剂中极性溶剂比例增大，故增大，故Rf值相对变大。值相对变大。第48页，此课件共63页哦原点12双向展开双向展开4.斑点定位斑点定位有色化合物有色化合物直接定位直接定位第49页，此课件共63页哦无色化合物无色化合物无色化合物无色化合物紫外灯下检出紫外灯下检出紫外灯下检出紫外灯下检出荧光板上有暗斑荧光板上有暗斑荧光板上有暗斑荧光板上有暗斑显色剂定位显色剂定

37、位显色剂定位显色剂定位喷雾或浸渍显色喷雾或浸渍显色喷雾或浸渍显色喷雾或浸渍显色蒸气显色蒸气显色蒸气显色蒸气显色显色剂有通用型和专用型两种。通用型显色剂有碘、硫酸溶液、等。显色剂有通用型和专用型两种。通用型显色剂有碘、硫酸溶液、等。碘使许多化合物显色，如生物碱、氨基酸衍生物、肽类、脂类及皂甙碘使许多化合物显色，如生物碱、氨基酸衍生物、肽类、脂类及皂甙等。它的最大特点是与物质的反应是可逆的，当碘升华挥去后，斑点等。它的最大特点是与物质的反应是可逆的，当碘升华挥去后，斑点便于进一步处理。硫酸能对大部分有机化合物显色，但它是破坏性显便于进一步处理。硫酸能对大部分有机化合物显色，但它是破坏性显色剂。色剂

38、。斑点有荧光斑点有荧光斑点有荧光斑点有荧光物物理理捡捡出出法法化化学学捡捡出出法法第50页，此课件共63页哦 专用显色剂是指对某个或某一类化合物显色的试剂，专用显色剂是指对某个或某一类化合物显色的试剂，例如茚三酮是氨基酸的专用显色剂，。羧酸可用酸碱例如茚三酮是氨基酸的专用显色剂，。羧酸可用酸碱指示剂作显色剂，含酚羟基物质可喷三氯化铁指示剂作显色剂，含酚羟基物质可喷三氯化铁铁氰铁氰化钾试剂进行显色。化钾试剂进行显色。显色剂直接由喷雾器喷洒在硬板上，立即显色或加热显色剂直接由喷雾器喷洒在硬板上，立即显色或加热至一定温度显色。至一定温度显色。五、定性分析五、定性分析1.1.利用利用R Rf f 值定

39、性或相对比移值值定性或相对比移值R Rstst（在同一块板上）（在同一块板上）2.2.R Rf f 值值+斑点颜色特征（原位化学反应）斑点颜色特征（原位化学反应）;3.3.多种展开剂体系展开进行验证多种展开剂体系展开进行验证;4.4.与其他技术联用。与其他技术联用。第51页，此课件共63页哦六、定量分析六、定量分析（一）洗脱法（一）洗脱法薄层分离薄层分离 取下斑点取下斑点 洗脱洗脱 离心离心 取上取上清液进行测定清液进行测定（二）薄层扫描法（二）薄层扫描法又称原位定量薄层扫描法又称原位定量薄层扫描法1.基本原理基本原理第52页，此课件共63页哦用一束一定波长、一定强度的紫外或可见光对薄用一束一

40、定波长、一定强度的紫外或可见光对薄层板进行扫描，测定薄层板上的样品斑点对光的吸收层板进行扫描，测定薄层板上的样品斑点对光的吸收强度或斑点经激发后所产生的荧光强度，所得关系曲强度或斑点经激发后所产生的荧光强度，所得关系曲线下的面积与色谱斑点中待测物质的浓度或量成正比线下的面积与色谱斑点中待测物质的浓度或量成正比。薄层扫描法的分类薄层扫描法的分类扫描方式扫描方式吸收法吸收法荧光法荧光法反射法反射法透射法透射法大多用于凝胶色谱大多用于凝胶色谱非透明界质薄层板非透明界质薄层板第53页，此课件共63页哦方程是薄层扫描法定量的依据。方程是薄层扫描法定量的依据。Kubelka-Munk古柏尔卡古柏尔卡-曼克

41、曼克第54页，此课件共63页哦 通常在薄层扫描中都是以空白板为基准，测定通常在薄层扫描中都是以空白板为基准，测定相对相对透光率透光率及及相对反射率相对反射率来计算薄层色谱斑点的吸光来计算薄层色谱斑点的吸光度。度。透射法透射法 空白薄层和样品斑点空白薄层和样品斑点的透射率分别为的透射率分别为第55页，此课件共63页哦 反射法示意图反射法示意图 I0为为照射光照射光强强度；度；j0为为空白板反射光空白板反射光强强度；度；j为为斑点斑点处处反射光反射光强强度度空白薄层和样品斑点的反射率分别为空白薄层和样品斑点的反射率分别为斑点的吸光度斑点的吸光度第56页，此课件共63页哦SX=20SX=10SX=0

42、根据根据Kubelka-Munk方程，色谱斑点中待测物质的吸光方程，色谱斑点中待测物质的吸光度度A与被测物质存在严格的定量关系，但不是一种直线关系。与被测物质存在严格的定量关系，但不是一种直线关系。因此，薄层扫描定量不遵从于因此，薄层扫描定量不遵从于Lambert-Beer定律。定律。第57页，此课件共63页哦SX=0SX=10SX=20为方便定量，必须对其曲线进行校直。为方便定量，必须对其曲线进行校直。第58页，此课件共63页哦Kubelka-Munk曲曲线线的的校校直直：日日本本岛岛津津CS系系列列的的薄薄层层色色谱谱扫扫描描仪仪均均有有线线性性补补偿偿器器，其其工工作作原原理理即即根根据

43、据Kubelka-Munk方方程程式式用用电电路路系系统统将将弯弯曲曲的的曲曲线线校校正正为为直直线后用于定量，线后用于定量，瑞瑞 士士CAMAG公公 司司SCANNER系系列列的的薄薄层层色色谱谱扫扫描描仪仪，则则采采用用计计算算机机进进行行线线性性回回归归或或非非线线性性回回归归，求求出出回回归归方方程程，然然后后进行定量分析。进行定量分析。第59页，此课件共63页哦 扫描模式扫描模式直线扫描直线扫描应用一长方应用一长方形光束（其长度大于斑点形光束（其长度大于斑点直径）以直线轨迹通过色直径）以直线轨迹通过色谱斑点。谱斑点。适用于圆形规则的斑点，且适用于圆形规则的斑点，且扫描结果受扫描方向的

44、影响。扫描结果受扫描方向的影响。锯齿扫描锯齿扫描照射在薄层照射在薄层板上的光束与薄层板的相对板上的光束与薄层板的相对运动的轨迹呈锯齿形或矩形。运动的轨迹呈锯齿形或矩形。适用于任何形状的斑点，适用于任何形状的斑点，扫描结果不受扫描方向扫描结果不受扫描方向的影响。的影响。重复性较好，但重复性较好，但速度较慢。速度较慢。第60页，此课件共63页哦2.2.定量分析方法定量分析方法 常用随行标准的外标两点法。所谓随行标准，即是常用随行标准的外标两点法。所谓随行标准，即是把样品溶液与对照品溶液点在同一薄层板上，展开，把样品溶液与对照品溶液点在同一薄层板上，展开，测定。目的是克服板间误差，提高定量分析的准确

45、度。测定。目的是克服板间误差，提高定量分析的准确度。外标两点法是配制高低两种不同浓度的对照品溶液，外标两点法是配制高低两种不同浓度的对照品溶液，分别点在薄层板上，测定峰面积。用两种浓度的对照分别点在薄层板上，测定峰面积。用两种浓度的对照品液品液(或一种浓度、两种点样量或一种浓度、两种点样量)与样品液对比定量。与样品液对比定量。未知浓度的样品溶液的含量未知浓度的样品溶液的含量a,b需要由需要由对对照品溶液的点照品溶液的点样浓样浓度和度和对应对应的峰的峰面面积积A求得求得第61页，此课件共63页哦为了提高测量精度，通常相同体积同一浓度为了提高测量精度，通常相同体积同一浓度的对照品溶液点的对照品溶液点2个斑点，相同体积的样品溶液个斑点，相同体积的样品溶液点点34个斑点，且交叉点样于同一薄层板上，展个斑点，且交叉点样于同一薄层板上，展开，测定。开，测定。第62页，此课件共63页哦除了应用外标两点法进行定量分析外，如标准曲线除了应用外标两点法进行定量分析外，如标准曲线通过原点也可采用外标一点法通过原点也可采用外标一点法第63页，此课件共63页哦