2.2.1动物细胞培养和核移植技术.ppt

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1、细胞工程细胞工程动物细胞工程常用的技术动物细胞工程常用的技术植物组织培养植物组织培养植物体细胞杂交植物体细胞杂交回顾：回顾：v植物细胞工程常用的技术手段有哪些？植物细胞工程常用的技术手段有哪些？动物动物胚胎胚胎或或幼龄幼龄动动物的组织、器官物的组织、器官胰蛋白酶胰蛋白酶剪碎剪碎单个细胞单个细胞加培养液加培养液制成制成细胞细胞悬液悬液培养瓶培养瓶中培养中培养部分细胞部分细胞“癌变癌变”，无限传代，无限传代动物细胞培养不能动物细胞培养不能最终培养成动物体最终培养成动物体50代细胞代细胞原原代代培培养养传代培养传代培养细细胞胞贴贴壁壁剥离、分瓶剥离、分瓶细胞株细胞株细胞细胞细胞系细胞系2.动物细胞培

2、养过程：动物细胞培养过程：增殖能力强，分裂旺盛，分化增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养程度低，容易培养去掉组织间去掉组织间蛋白蛋白动物动物细胞培养细胞培养和和核移植技术核移植技术从从动动物物机机体体中中取取出出相相关关组组织织，将将它它们们分分散散成成单单个个细细胞胞，然然后后放放在在适适宜宜的的培培养养基基中中，让让这这些些细细胞胞生生长和增殖长和增殖。3、动物细胞培养过程中几个重要的概念、动物细胞培养过程中几个重要的概念（1）细胞贴壁：）细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上（单层单层）。要求：）。要求：培养瓶或培养皿的内表面培养瓶或培养皿的

3、内表面光滑、无毒、易于贴附。光滑、无毒、易于贴附。（2）接触抑制：）接触抑制：当贴壁细胞分裂生长当贴壁细胞分裂生长到到表面相互接触时表面相互接触时，细，细胞就会停止分裂增殖，胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接这种现象称为细胞的接触抑制。触抑制。动物细胞培养特点动物细胞培养特点：贴壁生长、接触抑制：贴壁生长、接触抑制：(3)原代培养(primary culture)定义：定义：指将要培养的动物细胞取出后，先用指将要培养的动物细胞取出后，先用胰蛋白酶胰蛋白酶等使组织分散成单个细胞，然后配等使组织分散成单个细胞，然后配制成一定浓度的制成一定浓度的细胞悬液细胞悬液，再将该悬液放入，再将该悬液放入

4、培养瓶中培养瓶中培养。培养。过程：从动物机体中取出组织过程：从动物机体中取出组织 剪碎剪碎 加胰蛋白酶加胰蛋白酶 细胞游离细胞游离 制成细胞悬液制成细胞悬液 将细胞将细胞接种到培养瓶内接种到培养瓶内 培养（培养（1-21-2天换一天换一次培养液）次培养液）细胞贴壁生长细胞贴壁生长 长成单层细长成单层细胞胞定义：定义：当原代培养的当原代培养的细胞生长停止细胞生长停止，这，这时如果要使细胞继续生长，就要及时用时如果要使细胞继续生长，就要及时用胰蛋白酶胰蛋白酶等等，使细胞从瓶壁上脱离下来，使细胞从瓶壁上脱离下来，然后加入新的培养液，将然后加入新的培养液，将细胞分离稀释，细胞分离稀释，并从原培养瓶内转

5、接到新的培养瓶内，并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内，这个过程称传代培养这个过程称传代培养(4)传代培养(subculture)细胞株：细胞株：从原代培养细胞群中筛选出进行传代培从原代培养细胞群中筛选出进行传代培养的细胞，能传到养的细胞，能传到40-5040-50代，其代，其遗传物质没有遗传物质没有发生变化。发生变化。细胞系：细胞系：传到传到40-5040-50代后有代后有部分细胞遗传物质发生部分细胞遗传物质发生了变化了变化，带有癌变的特点，可能在培养条件下，带有癌变的特点，可能在培养条件下无限制的传代下去，这种传代细胞称为细胞系。无限制的传代下去，这种传代细胞称为细胞系。细胞株和细胞系的区别：

6、细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。容易传代培养。细胞悬细胞悬浮液浮液培养瓶培养瓶中培养中培养5050代代细胞细胞无限传无限传代代原代培养原代培养传代培养传代培养细胞株细胞株细胞系细胞系知识点小结：各个新名词之间的联系知识点小结：各个新名词之间的联系多数组织细胞固定在表面多数组织细胞固定在表面生长和分裂。生长和分裂。随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖遗传物质改变遗传物质改变1、无菌、无毒的环境、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液）（添加一

7、定量的抗生素，定期更换培养液）2、营养、营养 （葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清、微量元素等清、微量元素等）3、温度和、温度和PH 温度温度36.5+0.5度，pH7.27.44、气体环境、气体环境 O2和和CO2（95%空气和空气和5%CO2）4、动物细胞培养条件、动物细胞培养条件保证细胞顺利保证细胞顺利的生长增殖的生长增殖离体培养的细胞对离体培养的细胞对微生物和有毒物质微生物和有毒物质没有防御能力没有防御能力能否用胃蛋白酶能否用胃蛋白酶代替胰蛋白酶？代替胰蛋白酶？5 5、动物细胞培养技术的应用、动物细胞培养技术的应用（1 1）生产蛋白生物制品

8、：）生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰素、病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体单克隆抗体等。等。（4 4）用于）用于检测有毒物质检测有毒物质（3 3）获得大量自身的）获得大量自身的皮肤细胞皮肤细胞，用于植皮。，用于植皮。（5 5）用于生理、病理、药理等方面的研究，）用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据为治疗和预防疾病提供理论依据（2 2）作为基因工程的受体细胞）作为基因工程的受体细胞获得细胞获得细胞细胞的全能性细胞的全能性细胞株、细胞系细胞株、细胞系植物体植物体培养结果培养结果或细胞分泌蛋白或细胞分泌蛋白快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株等无病毒植株等培养目的培养目的葡萄糖

9、、动物血清葡萄糖、动物血清促生长因子促生长因子蔗糖、植物激素蔗糖、植物激素培养基特有成分培养基特有成分液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基培养基性质培养基性质细胞增殖细胞增殖原理原理动物细胞培养动物细胞培养植物组织培养植物组织培养比较项目比较项目6 6、植物细胞和动物细胞培养的比较、植物细胞和动物细胞培养的比较本节内容小结本节内容小结1、动物细胞培养过程涉及的概念、动物细胞培养过程涉及的概念 细胞贴壁、细胞的接触抑制、原代培养、细胞贴壁、细胞的接触抑制、原代培养、传代培养、细胞株、细胞系传代培养、细胞株、细胞系3 3、植物细胞和动物细胞培养的比较、植物细胞和动物细胞培养的比较4 4、动物细

10、胞培养技术的应用、动物细胞培养技术的应用2、动物细胞培养条件、动物细胞培养条件2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组织培养培养基有何独特、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组织培养培养基有何独特之处？之处？3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？个体？主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。

11、主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。独特之处有：独特之处有：1、液体培养基、液体培养基 2、成分中有动物血清等、成分中有动物血清等因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体 1 1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是变的细胞是-（）A A细胞系细胞系 B B细胞株细胞株

12、 C C原代细胞原代细胞 D D传代细胞传代细胞2 2、动物细胞工程技术的基础是、动物细胞工程技术的基础是-（）（）A.A.动物细胞融合动物细胞融合 B.B.单克隆抗体单克隆抗体 C.C.胚胎移植胚胎移植 D.D.动物细胞培养动物细胞培养AD3 3、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞是这样的组织细胞 （）A.A.容易产生各种变异容易产生各种变异 B B具有更强的全能性具有更强的全能性 C C.取材十分方便取材十分方便 D D分裂增殖的能力强分裂

13、增殖的能力强D 4.4.动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于-（）A.A.培养基不同；培养基不同；B.B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；C.C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；D.D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培 养成植株。养成植株。D二、克隆技术二、克隆技术1、概念：克隆就是、概念：克隆就是无性繁殖无性繁殖，具体地说，是，具体地说，是指一个共同的祖先，通过无性繁殖的方法产生指一个共同的祖先，通过无性繁殖的方法产生出来

14、的一群遗传特性相同的出来的一群遗传特性相同的DNA分子、细胞分子、细胞或个体或个体。a.分子水平上：分子水平上：一般指一般指DNA克隆。克隆。b.细胞水平上：细胞水平上：指一个单一的细胞分裂所形指一个单一的细胞分裂所形成的成的细胞群体细胞群体。c.个体水平上：个体水平上：指基因型完全相同的两个或指基因型完全相同的两个或一个群体。一个群体。2、克隆的条件：、克隆的条件：a.具有包含五种完整基因组的细胞核的活细胞具有包含五种完整基因组的细胞核的活细胞（乳腺上壁细胞乳腺上壁细胞）b.能有效调控细胞核发育的细胞质物质（能有效调控细胞核发育的细胞质物质（去核的去核的卵细胞质卵细胞质）。）。c.完成胚胎发

15、育的必要的环境条件（完成胚胎发育的必要的环境条件（诱导核诱导核-质重组质重组细胞生长、分化的实验条件和怀胎母体的子宫环境细胞生长、分化的实验条件和怀胎母体的子宫环境）。）。3、技术基础：、技术基础：1.植物克隆的技术基础是植物克隆的技术基础是组织培养组织培养2.动物克隆的技术基础是动物克隆的技术基础是动物细胞培养动物细胞培养 动物细胞特点？动物细胞特点？分化潜能变窄分化潜能变窄：随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能变窄，这是指整体细胞而言。细胞核仍具有全能性细胞核仍具有全能性：细胞核，它含有保持物种遗传性所需的全套基因，而且并没有因细胞分化而丢失基因，因此高度分化细胞的细胞核仍具有全

16、能性 根据动物细胞核仍具有全能根据动物细胞核仍具有全能性的特点性的特点,怎样将动物细胞的全能怎样将动物细胞的全能性表达性表达?利用动物体细胞核移植技术利用动物体细胞核移植技术 1.概念：概念：将动物的一个细胞的细胞核，移入将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的一个已经去掉细胞核的卵母细胞卵母细胞中，使其重中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。终发育成动物个体。核移植核移植（难度高）（难度高）受体细胞：受体细胞：M期的期的卵母细胞卵母细胞三、动物体细胞核移植技术三、动物体细胞核移植技术胚胎细胞核移植：胚胎细胞核移植：体

17、细胞核移植：体细胞核移植：细胞分化程度低，细胞分化程度低，恢复全能性容易恢复全能性容易用核移植的方法得到的动物用核移植的方法得到的动物称为克隆动物称为克隆动物1.核移植的受体核移植的受体细胞是什么？胞是什么？处在什么在什么时期？期？2.通通过什么手段激活受体什么手段激活受体细胞，胞，构建重构建重组胚胎？胚胎？细胞核细胞核移植移植早期胚胎早期胚胎卵裂卵裂C母绵羊子宫母绵羊子宫胚胎移植胚胎移植多莉羊多莉羊分娩分娩妊娠妊娠融合后的卵母细胞融合后的卵母细胞电脉冲刺电脉冲刺激激卵母细胞卵母细胞黑面母绵羊黑面母绵羊白面母绵羊白面母绵羊乳腺细胞乳腺细胞细胞质细胞质细胞核细胞核供体细胞供体细胞（供核）（供核）

18、细胞培养细胞培养体细胞体细胞卵巢卵母细胞卵巢卵母细胞（M中期：供质）中期：供质）去核去核无核卵母细胞无核卵母细胞注入注入细胞融合细胞融合重重组组细细胞胞构建重组构建重组胚胎胚胎胚胎移植胚胎移植代孕母体代孕母体生出与生出与供体供体奶奶牛遗传物质基牛遗传物质基本相同的犊牛本相同的犊牛归纳归纳:1.共分成两大阶段：共分成两大阶段：核移植和胚胎移植核移植和胚胎移植2.取卵母细胞作受体细胞的取卵母细胞作受体细胞的原因原因是是:它是最大的细胞它是最大的细胞,易操作；含有易操作；含有激发细胞核全能性的物质激发细胞核全能性的物质3.严格来说新个体有卵母细胞的细胞质所以有严格来说新个体有卵母细胞的细胞质所以有两

19、个亲本的性状两个亲本的性状2.体细胞核移植过程体细胞核移植过程（M卵母细胞）卵母细胞）减数第二次分裂中期减数第二次分裂中期去核的卵母细胞去核的卵母细胞供体细胞注入供体细胞注入去核卵母细胞去核卵母细胞受体细胞激活，受体细胞激活，完成减数分裂、完成减数分裂、发育发育胚胎移植胚胎移植核移植核移植图片图片多多莉莉与与“母母亲亲”(1)(1)遗遗传传素素质质完完全全一一致致的的克克隆隆动动物物将将更更有有利利于于开开展展对对动物动物(人人)生长、发育、衰老和健康等机理的研究；生长、发育、衰老和健康等机理的研究；(2)2)有利于大量培养品质优良的家畜有利于大量培养品质优良的家畜;(3 3)经经转转基基因因

20、的的克克隆隆哺哺乳乳动动物物，将将能能为为人人类类提提供供源源源源不不断断的的廉廉价价的的药药品品、保保健健品品以以及及较较易易被被人人体体接接受受的的移移植植器官；器官；(4)4)科学家将很快地从目前的同种克隆技术推进到异科学家将很快地从目前的同种克隆技术推进到异种克隆种克隆,即借腹怀胎的新领域即借腹怀胎的新领域,这无疑将大大促进对濒临这无疑将大大促进对濒临灭种的哺乳动物的保护工作。灭种的哺乳动物的保护工作。克隆技克隆技术将将对21世世纪产生的重大影响生的重大影响四、体细胞核移植技术的应用前景四、体细胞核移植技术的应用前景 1、加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育、加速家畜遗传改良进程，促

21、进优良畜群繁育2、保护濒危物种，增加存活数量、保护濒危物种，增加存活数量3、克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白、克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白4、可以作为异种移植的供体，可以用于组织、可以作为异种移植的供体，可以用于组织器官的移植器官的移植五、体细胞核移植技术存在的问题五、体细胞核移植技术存在的问题胚胎移植动物幼体产出胚胎移植动物幼体产出 概率概率10克隆动物存在着健康问题克隆动物存在着健康问题克隆动物的食品安全性问题存在争议克隆动物的食品安全性问题存在争议知识点小结知识点小结动物体细胞核移植技术和克隆动物动物体细胞核移植技术和克隆动物1.克隆动物的概念克隆动物的概念2.体细胞核移植技

22、术的过程体细胞核移植技术的过程3.体细胞核移植技术的应用前景体细胞核移植技术的应用前景4.体细胞核移植技术存在的问题体细胞核移植技术存在的问题1.动物细胞培养要经过脱分化吗？为什么？动物细胞培养要经过脱分化吗？为什么？2.体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了动物进行了100%的复制吗？为什么？的复制吗？为什么？课后习题课后习题3.胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白质外，胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白质外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有长时间的作

23、用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。间。5.什么叫单层细胞培养什么叫单层细胞培养 1957年，科学家采用胰蛋白酶消化处理和应用年，科学家采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法，获得了单层细胞培养。单层培液体培养基的方法，获得了单层细胞培养。单层培养法的出现，对细胞培养的发展起了很大的推动作养法的出现，对细胞培养的发展起了很大的推动作用。用。4.为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中

24、蛋白质为白蛋白和球蛋白；氨基酸有多种，是其中蛋白质为白蛋白和球蛋白；氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，有些动物细胞不能合细胞合成蛋白质的基本成分，有些动物细胞不能合成，必须由培养液提供；激素有胰岛素、生长激素成，必须由培养液提供；激素有胰岛素、生长激素等促进细胞的生长、增殖、贴附。因此，细胞培养等促进细胞的生长、增殖、贴附。因此，细胞培养要保证细胞能顺利生长和繁殖，一般要添加要保证细胞能顺利生长和繁殖，一般要添加10%-20%的血清。的血清。6.去核的方法有哪些？去核的方法有哪些？目前核移植技术中普遍使用的去核方法是目前核移植技术中普遍使用的去核方法是显微操作去核法显微操作去核法。还有人采用其他方法，如梯。还有人采用其他方法，如梯度离心、紫外光短时间照射、化学物质处理等。度离心、紫外光短时间照射、化学物质处理等。这些方法是在没有刺破透明带或卵母细胞质膜这些方法是在没有刺破透明带或卵母细胞质膜的情况下，去除细胞核或使卵细胞核的情况下，去除细胞核或使卵细胞核DNA变变性，从而达到去核目的。性，从而达到去核目的。