乙型肝炎病毒标志物的检测.ppt

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1、实验十二实验十二乙型肝炎病毒标志物的检测乙型肝炎病毒标志物的检测实验目的和要求实验目的和要求1 1 1 1、熟悉、熟悉、熟悉、熟悉ELISAELISAELISAELISA（enzyme-linkedimmunosorbentassay）的原理及操作方法）的原理及操作方法）的原理及操作方法）的原理及操作方法2 2 2 2、掌握乙型病毒标志物的临床意义、掌握乙型病毒标志物的临床意义、掌握乙型病毒标志物的临床意义、掌握乙型病毒标志物的临床意义 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活

2、性。使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其或抗体既保留其或抗体既保留其或抗体既保留其免疫活性免疫活性免疫活性免疫活性，又保留，又保留，又保留，又保留酶的活性酶的活性酶的活性酶的活性。在测定时，把。在测定时，把。在测定时，把。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不受检标本（测定

3、其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的

4、量成一定的后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。应的深浅进行定性或定量分析。应的深浅进行定

5、性或定量分析。应的深浅进行定性或定量分析。（一）基本原理（一）基本原理（一）基本原理（一）基本原理用用洗涤洗涤的方法使固相载体上形成的的方法使固相载体上形成的抗原抗体抗原抗体复合物与其他物质分开复合物与其他物质分开，最后结合在固相载，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进颜色反应的深浅进行定性或定量分析行定性或定量分析。（二）实验试

6、剂（二）实验试剂ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有在这种测定方法中有3种必要的试剂：种必要的试剂：固相的抗原或抗体，固相的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物。酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。1、双抗体夹心法、双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤双抗体夹心法是检测

7、抗原最常用的方法，操作步骤如下：如下：如下：如下：（1 1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。洗涤除去未结合的抗体及杂质。洗涤除去未结合的抗体及杂质。洗涤除去未结合的抗体及杂质。（2 2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形间，让标本中的抗原与固相载体上的抗

8、体结合，形间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。（三）实验方法（三）实验方法（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。受检物质的量正相关。（4）加底物：夹心式复合物中的

9、酶催化底物）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。抗原的定性或定量。2、间接法测抗体、间接法测抗体间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：（1 1）将）将特异性抗原与固相载体连接特异性抗原与固相载体连接，形成固，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。（2 2）加稀释的受检血清：）加

10、稀释的受检血清：其中的特异抗体与其中的特异抗体与抗原结合抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，涤后，固相载体上只留下特异性抗体固相载体上只留下特异性抗体。其他。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。抗原结合，在洗涤过程中被洗去。（3）加酶标）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体抗抗体：与固相复合物中的抗体结合结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用

11、酶量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人标羊抗人IgG抗体。抗体。（4）加底物显色加底物显色：颜色深度代表标本中受检：颜色深度代表标本中受检抗体的量。抗体的量。本法只要更换不同的固相抗原，可以用本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。间接法间接法测抗体测抗体步骤一步骤一将抗原将抗原HBsAg吸附于载体表面（厂家吸附于载体表面（厂家已经完成）已经完成）步骤二步骤二原理：将待测血清加入，原理：将待测血清加入，温育，血清中如有温育，血清中如有HBsAb，则抗原抗体结合，则抗原抗体结合操作：操作：阳性血清，阴性血清，待阳

12、性血清，阴性血清，待检血清各加检血清各加1孔，每孔孔，每孔50ul(1滴滴)步骤三步骤三原理：加入酶复合物，原理：加入酶复合物，(HBsAg-HRP),酶复合物酶复合物与表面抗体结合与表面抗体结合操作：操作：加酶复合物加酶复合物1滴滴,混匀混匀,置置37温育温育30分钟分钟倒出液体倒出液体,洗涤洗涤5次，拍次，拍干。干。步骤四步骤四加入酶的底物，酶与加入酶的底物，酶与底物反应，显色底物反应，显色操作：操作：每孔加显色液每孔加显色液A液液,B液，各液，各1滴，滴，37温温育育15分钟，使充分显分钟，使充分显色。色。终止反应：每孔加终止液终止反应：每孔加终止液50l（一滴）（一滴）肉眼观察或上机比

13、色肉眼观察或上机比色步骤五步骤五1、乙肝病毒的形态结构、乙肝病毒的形态结构（四）应用（四）应用乙肝病毒标志物的检测乙肝病毒标志物的检测大球形颗粒大球形颗粒（Dane颗粒，有感染性的完整颗粒）颗粒，有感染性的完整颗粒）HBsAg（外衣壳蛋白）（外衣壳蛋白）HBcAg（内衣壳蛋白）（内衣壳蛋白）HBV DNADNAP小球形颗粒小球形颗粒过剩的衣壳过剩的衣壳（HBsAg）管形颗粒管形颗粒2、HBV的抗原组成的抗原组成表面抗原表面抗原表面抗原表面抗原HBsAgHBsAgHBsAgHBsAg：外衣壳：外衣壳：外衣壳：外衣壳核心抗原核心抗原核心抗原核心抗原HBcAgHBcAgHBcAgHBcAg：内衣壳，

14、仅感染的肝细胞核内：内衣壳，仅感染的肝细胞核内：内衣壳，仅感染的肝细胞核内：内衣壳，仅感染的肝细胞核内 e e e e抗原抗原抗原抗原HBeAgHBeAgHBeAgHBeAg：自肝细胞分泌而存在于血清中：自肝细胞分泌而存在于血清中：自肝细胞分泌而存在于血清中：自肝细胞分泌而存在于血清中（1 1）表面抗原（）表面抗原（）表面抗原（）表面抗原（HBsAgHBsAg）与表面抗体（抗）与表面抗体（抗）与表面抗体（抗）与表面抗体（抗-HBs-HBs）存在于三型颗粒中存在于三型颗粒中是是HBV感染的主要标志，感染的主要标志，感染的主要标志，感染的主要标志，见于急性、慢性、见于急性、慢性、携带者携带者抗抗-

15、HBs，保护性抗体（中和抗体），标志，保护性抗体（中和抗体），标志着着机体对机体对机体对机体对HBVHBVHBVHBV有免疫力有免疫力有免疫力有免疫力，见于恢复期、既往感，见于恢复期、既往感染者或接种疫苗后染者或接种疫苗后3、HBV的抗原的抗原抗体系统抗体系统（2）核心抗原（）核心抗原（HBcAg）与核心抗体（抗）与核心抗体（抗HBc）内衣壳，仅存在于感染的肝细胞核内，内衣壳，仅存在于感染的肝细胞核内，不不易在血液中检出易在血液中检出抗原性强，刺激机体先产生抗原性强，刺激机体先产生IgM，后产生，后产生IgG，后者可在血清中存在多年，后者可在血清中存在多年抗抗HBc无中和作用，高效价抗无中和作

16、用，高效价抗HBc IgM提示提示病毒在体内复制增殖病毒在体内复制增殖。（3）e抗原（抗原（HBeAg）与）与e抗体（抗抗体（抗-HBe）可溶性蛋白，游离存在于血液中可溶性蛋白，游离存在于血液中它的消长与它的消长与DNA聚合酶及聚合酶及Dane颗粒出现的时颗粒出现的时间一致，为间一致，为病毒复制和血清有强传染性病毒复制和血清有强传染性病毒复制和血清有强传染性病毒复制和血清有强传染性的标志。的标志。抗抗-HBe有一定保护作用，是有一定保护作用，是传染性低传染性低传染性低传染性低、预后好预后好预后好预后好的征象的征象的征象的征象。HBsAg:HBsAg:HBsAg:HBsAg:感染的主要标志感染的

17、主要标志感染的主要标志感染的主要标志抗抗抗抗-HBs-HBs-HBs-HBs：对对对对HBVHBV有免疫力有免疫力有免疫力有免疫力HBcAgHBcAgHBcAgHBcAg：一般血清学方法检测不到一般血清学方法检测不到一般血清学方法检测不到一般血清学方法检测不到抗抗抗抗HBcHBcHBcHBc：提示病毒在体内复制增殖。提示病毒在体内复制增殖。提示病毒在体内复制增殖。提示病毒在体内复制增殖。HBeAgHBeAgHBeAgHBeAg：病毒复制和血清有传染性的标志病毒复制和血清有传染性的标志病毒复制和血清有传染性的标志病毒复制和血清有传染性的标志抗抗抗抗-HBe-HBe-HBe-HBe：传染性低、预后

18、好的征象。传染性低、预后好的征象。传染性低、预后好的征象。传染性低、预后好的征象。HBV DNAHBV DNAHBV DNAHBV DNA：病毒复制和有传染性最直接的证据病毒复制和有传染性最直接的证据病毒复制和有传染性最直接的证据病毒复制和有传染性最直接的证据乙肝五项的临床意义乙肝五项的临床意义 结果分析结果分析HBsAgHBeAg抗抗-HBs抗抗-HBe抗抗-HBc结结果分析果分析+-肝功能正常肝功能正常为为无症状携无症状携带带者者肝功能异常肝功能异常为为乙肝患者乙肝患者+-同上，同上，传传染性染性强强+-+急性或慢性乙型肝炎（急性或慢性乙型肝炎（传传染染性性强强，“大三阳大三阳”）-+-/+乙肝恢复期乙肝恢复期-+感染感染过过HBV或或“窗口期窗口期”+-+急性感染急性感染趋趋向恢复（向恢复（“小三小三阳阳”）-+-既往感染或接种既往感染或接种过过疫苗疫苗