薄层层析分离方法讲稿.ppt
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1、关于薄层层析分离方法第一页,讲稿共八十八页哦Thin-layerchromatographyandcolumnchromatographyandaredifferenttypesofliquid chromatography.Themobile(moving)phaseisaliquid.Thestationaryphaseisusuallysilicaoralumina.Thisphaseisvery polar.Theprincipleofoperationisthesame!第二页,讲稿共八十八页哦ThinLayerChromatographyThe surface of the pla
2、te consists of a very thin layer of silica on a plastic or aluminum backing.The silica is very polar.This is the stationary phase.Spot the material at the origin(bottom)of the TLC plate.Place the plate into a glass jar with a small amount of a solvent in the glass jar.This solvent acts as the moving
3、 phase.Remove the plate from the bottle when the solvent is close to the top of the plate.Visualize the spots.Non-polar compounds will be less strongly attracted to the plate and will spend more time in the moving phase.This compound will move faster and will appear closer to the top of the plate.Po
4、lar compounds will be more strongly attracted to the plate and will spend less time in the moving phase and appear lower on the plate.第三页,讲稿共八十八页哦StationaryPhase:Silica(SiO2)第四页,讲稿共八十八页哦StationaryPhase:AluminaAcidic:-Al-OHNeutral:-Al-OH +-Al-O-Basic:-Al-O-第五页,讲稿共八十八页哦第六页,讲稿共八十八页哦Thin-LayerChromatogr
5、aphy:ATwo-ComponentMixtureMore polar!Less polar!solventfrontoriginmixturesolventfrontcomponentBcomponentAoriginsolventfrontcomponentBcomponentAoriginIncreasing Development Time第七页,讲稿共八十八页哦BesuretoremovetheTLCplatewhenitappearsthatthesolventfrontisntmoving!Reason:thesolventisevaporatingasitmovesupthe
6、plate.Results:Ifyoudontremovetheplateallofthespotswillappearnearthetopoftheplate!ThisisntaprettysightandmakesitdifficulttogetgoodRfvalues!Importanthint!第八页,讲稿共八十八页哦VisualizationMethodThepreviousslideshowscoloredspots.Mostofthetime,thespotswontshowunlesstheyarevisualized!Vizualizationisamethodthatisu
7、sedtorendertheTLCspotsvisible.Avisualizationmethodcanbe:UltravioletlightIodinevaporstostainspotsColoredreagentstostainspotsReagentsthatselectively stainspotswhileleavingothersunaffected.第九页,讲稿共八十八页哦Thin-LayerChromatography:DeterminationofRfValuesRfofcomponentA=dAdSRfofcomponentB=dBdSTheRfvalueisadec
8、imalfraction,generallyonlyreportedtotwodecimalplaces第十页,讲稿共八十八页哦Thin-LayerChromatography:QualitativeAnalysis第十一页,讲稿共八十八页哦1、薄层色谱:薄层色谱法,是将薄层色谱:薄层色谱法,是将适宜的固定相涂布于玻璃板上,成适宜的固定相涂布于玻璃板上,成一均匀薄层。等点样、展开后,与一均匀薄层。等点样、展开后,与适宜的对照物按同法所得的色谱图适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比,用以进行药品的鉴别,杂作对比,用以进行药品的鉴别,杂质检查或含量测定的方法。质检查或含量测定的方法。第十二页,讲稿
9、共八十八页哦2仪器与材料:仪器与材料:2.1玻板:除另有规定外,用玻板:除另有规定外,用5cm20cm,10cm20cm或或20cm20cm的规格,要求光滑,的规格,要求光滑,平整、洗净后的不附水珠,晾干。平整、洗净后的不附水珠,晾干。第十三页,讲稿共八十八页哦2.2固定相或载体:最常用的有硅胶固定相或载体:最常用的有硅胶G、硅胶、硅胶GF、硅胶硅胶H、硅胶、硅胶HF254,其次有硅藻土、硅藻土,其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素、微晶纤维素、微晶纤维素F254等。其颗粒大小,一般要求直径为等。其颗粒大小,一般要求直径为1040m。薄层涂布,一般可分
10、无粘合剂和含粘。薄层涂布,一般可分无粘合剂和含粘合剂两种;前者系将固定相直接涂布于玻璃板合剂两种;前者系将固定相直接涂布于玻璃板上,后者系在固定相中加入一定量的粘合剂,上,后者系在固定相中加入一定量的粘合剂,一般常用一般常用1015%煅石膏(煅石膏(CaSO42H2O在在140烘烘4小时),混匀后加水适量使用,或用小时),混匀后加水适量使用,或用羧甲基纤维素钠水溶液(羧甲基纤维素钠水溶液(0.50.7%)适量调成)适量调成糊状,均匀涂布于玻璃板上。也有含一定展开液糊状,均匀涂布于玻璃板上。也有含一定展开液或缓冲液的薄层。或缓冲液的薄层。第十四页,讲稿共八十八页哦2.3涂布器:应能使固定相或载体
11、在玻璃涂布器:应能使固定相或载体在玻璃板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。2.4点样器:常用具支架的微量注射器或点样器:常用具支架的微量注射器或定时毛细管,应能使点样位置正确集中。定时毛细管,应能使点样位置正确集中。2.5展开室:应使用适合薄层板大小的玻璃展开室:应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸,并有严密盖子,除另制薄层色谱展开缸,并有严密盖子,除另有规定外,底部应平整光滑,应便于观察。有规定外,底部应平整光滑,应便于观察。第十五页,讲稿共八十八页哦各种特制薄层各种特制薄层混合薄层混合薄层酸碱薄层和酸碱薄层和pH缓冲薄层缓冲薄层络合薄层络合薄层:用
12、用AgNO3。等无机试剂的水溶液代。等无机试剂的水溶液代替水调硅胶糊来铺制络合薄层替水调硅胶糊来铺制络合薄层 涂布固定液的薄层涂布固定液的薄层 高效薄层高效薄层:它是由粒度十分均匀,直径最小为它是由粒度十分均匀,直径最小为5 5 m m,般为般为1010 m m左右的硅左右的硅胶吸附剂,加上高度惰性的粘合剂,铺成质地十分致密、平滑的高效高层预胶吸附剂,加上高度惰性的粘合剂,铺成质地十分致密、平滑的高效高层预制板。这种预制板性能极稳定,层析展开后所得斑点仍保持圆形不拖尾,分制板。这种预制板性能极稳定,层析展开后所得斑点仍保持圆形不拖尾,分离清晰,分离效果极好。理论塔板高度最小可达离清晰,分离效果
13、极好。理论塔板高度最小可达1212 m m,一般在,一般在20203030 m m。展。展开开37cm37cm,理论塔板数可达数千,为一般薄层的十倍。,理论塔板数可达数千,为一般薄层的十倍。第十六页,讲稿共八十八页哦第十七页,讲稿共八十八页哦3操作方法:操作方法:3.1薄层板制备:除另有规定外,将薄层板制备:除另有规定外,将1份固份固定相和定相和3份水在研钵中向一方向研磨混合,份水在研钵中向一方向研磨混合,去除表面的泡后,倒入涂布器中,在玻璃去除表面的泡后,倒入涂布器中,在玻璃板上平稳地移动涂布器进行涂布(厚度为板上平稳地移动涂布器进行涂布(厚度为0.20.3mm),取下涂好薄层的玻璃板,),
14、取下涂好薄层的玻璃板,置水平台上于室温下晾干,后在置水平台上于室温下晾干,后在110烘烘30分钟。即置有干燥剂的干燥箱中备用。分钟。即置有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度(可通过透射光和反使用前检查其均匀度(可通过透射光和反射光检视)。射光检视)。第十八页,讲稿共八十八页哦3.2点样:除另有规定外,用点样器点样于薄层点样:除另有规定外,用点样器点样于薄层板上,一般为圆点,点样基线距底边板上,一般为圆点,点样基线距底边2.0cm,点,点样直径为样直径为24mm,点间距离约为,点间距离约为1.52.0cm,点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。,点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜
15、。点样时必须注意勿损伤薄层表面。点样时必须注意勿损伤薄层表面。第十九页,讲稿共八十八页哦3.3展开:展开室如需预先用展开剂饱和,可展开:展开室如需预先用展开剂饱和,可在室中加入足够量的展开剂,并在壁上贴二条在室中加入足够量的展开剂,并在壁上贴二条与室一样高、宽的滤纸条,一端浸入展开剂中,与室一样高、宽的滤纸条,一端浸入展开剂中,密封室顶的盖,使系统平衡或按正文规定操作。密封室顶的盖,使系统平衡或按正文规定操作。将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中,将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中,浸入展开剂的深度为距薄层板底边浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.51.0cm(切勿将样点浸入展开剂中),密
16、封室盖,等(切勿将样点浸入展开剂中),密封室盖,等展开至规定距离(一般为展开至规定距离(一般为1015cm),取出),取出薄层板,晾干,按各品种项下的规定检测,如薄层板,晾干,按各品种项下的规定检测,如需用薄层扫描仪对色谱斑点作扫描检出,或直需用薄层扫描仪对色谱斑点作扫描检出,或直接在薄层上对色谱斑点作扫描定量,则可用薄接在薄层上对色谱斑点作扫描定量,则可用薄层扫描法。层扫描法。第二十页,讲稿共八十八页哦 直线式展开直线式展开 直线式展开技术可以分为直线式展开技术可以分为近水平展开、上行展开、下行近水平展开、上行展开、下行展开、双向展开和水平展开五展开、双向展开和水平展开五种形式,薄层色谱分寓
17、一般样种形式,薄层色谱分寓一般样品多采用上行展开方法。品多采用上行展开方法。第二十一页,讲稿共八十八页哦1近水平展开近水平展开 将适量展开剂倾人长方形玻璃将适量展开剂倾人长方形玻璃展开槽中,点样后的薄层板浸入展开槽中,点样后的薄层板浸入溶剂溶剂0.5cm,薄层上端垫,薄层上端垫高使薄层与水平成高使薄层与水平成510角,展角,展开剂由下而上进行展开,这种方开剂由下而上进行展开,这种方法常用于不含粘合剂的软板法常用于不含粘合剂的软板展开展开 第二十二页,讲稿共八十八页哦2上行展开上行展开 流动相沿薄层固定相向上运动的流动相沿薄层固定相向上运动的展开方式。此时薄层板放置的角度展开方式。此时薄层板放置
18、的角度对流动相移动速率和对流动相移动速率和斑点形状有一定影响。薄层板水平斑点形状有一定影响。薄层板水平角度为角度为75时,对展开最为有利。时,对展开最为有利。这种展开方式适合于含有粘合剂的这种展开方式适合于含有粘合剂的硬板展开。硬板展开。第二十三页,讲稿共八十八页哦3下行展开下行展开在展开槽内薄层板上端放置一个盛展开在展开槽内薄层板上端放置一个盛展开剂的溶剂槽,用厚滤纸将溶剂引到薄层板的剂的溶剂槽,用厚滤纸将溶剂引到薄层板的上端,使展开剂自上而下流动。下行法中展上端,使展开剂自上而下流动。下行法中展开剂受重力和毛细管作用双重影响,因此展开剂受重力和毛细管作用双重影响,因此展开速度较快。由于这种
19、展开方式采用的装置开速度较快。由于这种展开方式采用的装置比较复杂,目前只有在葡聚糖凝胶板上展开比较复杂,目前只有在葡聚糖凝胶板上展开时或纸色谱中采用时或纸色谱中采用第二十四页,讲稿共八十八页哦4二维展开二维展开 在正方形薄层板上,在两个垂直的方向进在正方形薄层板上,在两个垂直的方向进行基于相同或不同机理的展开将样品点在薄行基于相同或不同机理的展开将样品点在薄层板的一个角上,第一方向展开适当距离后,层板的一个角上,第一方向展开适当距离后,取出薄层板,并使溶剂完全蒸发,再以与原点取出薄层板,并使溶剂完全蒸发,再以与原点成成90方向展开。第二方向展开可采用不同溶剂,方向展开。第二方向展开可采用不同溶
20、剂,也可将薄层板进行化学反应后,再行第二方向展也可将薄层板进行化学反应后,再行第二方向展开,通称双向展开开,通称双向展开.二维展开常用于复杂较多组分样品的展开,二维展开常用于复杂较多组分样品的展开,通过调节展开剂极性,增加展开距离,进一步提通过调节展开剂极性,增加展开距离,进一步提高分离能力这种方法多用于定性,很少用于定高分离能力这种方法多用于定性,很少用于定量。量。第二十五页,讲稿共八十八页哦5水平展开水平展开圆形离心式展开圆形离心式展开圆形向心式展开圆形向心式展开特殊展开技术特殊展开技术:多次展开多次展开、分步展、分步展开开、离心展开、离心展开、梯度洗脱展开、梯度洗脱展开、梯度薄层梯度薄层
21、、多维技术、多维技术、加压展开、加压展开、控温展开、控温展开、楔形技术、楔形技术 第二十六页,讲稿共八十八页哦薄层扫描的方法,除另有规定外,可根据各薄层扫描的方法,除另有规定外,可根据各种薄层扫描仪的结构特点及使用说明,结合具体种薄层扫描仪的结构特点及使用说明,结合具体情况,选择吸收法或荧光法,用双波长或单波长情况,选择吸收法或荧光法,用双波长或单波长扫描。由于影响薄层扫描结果的因素很多,故应扫描。由于影响薄层扫描结果的因素很多,故应在保证供试品的斑点在一定浓度范围内呈线性的在保证供试品的斑点在一定浓度范围内呈线性的情况下,将供试品与对照品在同一块薄层上展开情况下,将供试品与对照品在同一块薄层
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