生物药物分析与检验-基因工程药物检验讲课稿.ppt

《生物药物分析与检验-基因工程药物检验讲课稿.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物药物分析与检验-基因工程药物检验讲课稿.ppt（41页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、生物药物分析与检验-基因工程药物检验基因工程药物与一般药物比较：基因工程药物与一般药物比较：n n它它是是利利用用活活的的细细胞胞作作为为表表达达系系统统，所所获获得得蛋蛋白白质质产产品品往往往往相相对对分分子子质质量量较较大大，并并具具有有复杂的结构；复杂的结构；n n许许多多基基因因工工程程药药物物是是参参与与人人体体一一些些生生理理功功能能精精密密调调节节所所必必需需的的蛋蛋白白质质，极极微微量量就就可可产产生显著效应。生显著效应。n n宿宿主主细细胞胞中中表表达达的的外外源源基基因因，在在转转录录或或翻翻译、工艺放大等过程中，都有可能发生变化。译、工艺放大等过程中，都有可能发生变化。一

2、、基因工程药物质量要求一、基因工程药物质量要求n n(1)要要求求提提供供关关于于表表达达体体系系的的详详细细资资料料，以以及及工工程程菌菌(或或工工程程细细胞胞)的的特特征征、纯纯度度(是是否否污染外来因子污染外来因子)和遗传稳定性等资料。和遗传稳定性等资料。n n(2)提提供供培培养养方方法法和和产产量量稳稳定定性性、纯纯化化方方法法以以及及各各步步中中间间产产品品的的收收率率和和纯纯度度、除除去去微微量量的的外外来来抗抗原原、核核酸酸、病病毒毒或或微微生生物物等等方方法。法。n n(3)要要求求进进行行理理化化鉴鉴定定，包包括括产产品品的的特特征征、纯纯度度及及与与天天然然产产品品的的一

3、一致致性性。一一般般纯纯度度应在应在95%以上。以上。n n(4)要要求求进进行行外外源源核核酸酸和和抗抗原原检检测测，规规定定每每剂剂量量DNA含含量量不不超超过过l00pg，细细胞胞培培养养产产品品中中小小牛牛血血清清含含量量须须合合格格。成成品品中中不不应应含含有有纯纯化化过过程程中中使使用用的的试试剂剂，包包括括层层析柱试剂和亲和层析用的鼠析柱试剂和亲和层析用的鼠IgG。n n(5)生生物物活活性性或或效效力力试试验验结结果果应应与与天天然然产产品品进进行比较。行比较。n n(6)基基因因工工程程产产品品的的理理化化和和生生物物学学性性质质与与天天然然产产品品完完全全相相同同者者一一般

4、般不不需需重重复复所所有有动动物物毒毒性性试试验验，与与天天然然产产品品略略有有不不同同者者需需做做较较多多试试验验，与与天天然然产产品品有有很很大大不不同同者者则则须须做做更更多多试试验验，包括致癌、致畸和对生育力的影响等。包括致癌、致畸和对生育力的影响等。n n(7)所所有有基基因因工工程程产产品品都都必必须须经经过过临临床床试试验验，以评价其安全性和有效性。以评价其安全性和有效性。二、基因工程药物的质控要点二、基因工程药物的质控要点n n(一一)原材料的控制原材料的控制n n(二二)生产的控制生产的控制n n(三三)最终产品的质量控制最终产品的质量控制1、表达载体和宿主细胞、表达载体和宿

5、主细胞 应提供有关表达载体详细资料，包括基因应提供有关表达载体详细资料，包括基因的来源、克隆和鉴定、表达载体的构建、的来源、克隆和鉴定、表达载体的构建、结构和遗传特性。结构和遗传特性。(一一)原材料的控制原材料的控制2、克隆基因的序列、克隆基因的序列 应应提提供供插插入入基基因因和和表表达达载载体体两两侧侧端端控控制制区区的的核核苷苷酸酸序序列列。所所有有与与表表达达有有关关的的序序列列均均应详细叙述。应详细叙述。3.表达表达 应详细叙述在生产过程中，启动和控制克应详细叙述在生产过程中，启动和控制克隆基因在宿主细胞中的表达所采用的方法及隆基因在宿主细胞中的表达所采用的方法及表达水平。表达水平。

6、(二二)生产的控制生产的控制 在工程菌的贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在工程菌的贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在工程菌的贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在工程菌的贮存中，要求种子克隆纯而稳定；在培养过程中，要求在培养过程中，要求在培养过程中，要求在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，工程菌所含的质粒稳定，工程菌所含的质粒稳定，工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；始终无突变；始终无突变；始终无突变；在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；始终能排除外源微生物污染。始终能排除外源微生物污染。始终能排除外源

7、微生物污染。始终能排除外源微生物污染。1、原始细胞库、原始细胞库 应详细记述种子材料的来源、方式、保存应详细记述种子材料的来源、方式、保存及预计使用寿命；应提供在保存和复苏条件及预计使用寿命；应提供在保存和复苏条件下宿主载体表达系统的稳定性证据；采用新下宿主载体表达系统的稳定性证据；采用新的种子批时，应重新作全面检定。的种子批时，应重新作全面检定。2、有限代次的生产、有限代次的生产 提提供供培培养养生生产产浓浓度度与与产产量量恒恒定定性性的的数数据据；依依据据宿宿主主细细胞胞-载载体体系系统统稳稳定定性性，确确定定最最高高允允许许传传种种代代数数和和细细胞胞倍倍增增数数，并并应应提提供供最最适

8、适培养条件的详细资料。培养条件的详细资料。3、连续培养生产、连续培养生产 应应提提供供经经长长期期培培养养后后所所表表达达基基因因的的分分子子完完整整性性资资料料，以以及及宿宿主主细细胞胞的的表表型型和和基基因因型特征。型特征。4、纯化、纯化 对于收获、分离和纯化的方法应详细记对于收获、分离和纯化的方法应详细记述，应特别注意污染病毒、核酸以及有害抗述，应特别注意污染病毒、核酸以及有害抗原性物质的去除。原性物质的去除。对整个纯化工艺应进行全面研究，包括对整个纯化工艺应进行全面研究，包括能够去除宿主细胞蛋白、核酸、糖、病毒或能够去除宿主细胞蛋白、核酸、糖、病毒或其它杂质以及在纯化过程中加入的有害的

9、化其它杂质以及在纯化过程中加入的有害的化学物质等。学物质等。(三三)最终产品的质量控制最终产品的质量控制n n 应应建建立立有有关关产产品品的的鉴鉴别别、纯纯度度、稳定性和活性稳定性和活性等方面的试验方法。等方面的试验方法。(三)最终产品的质量控制1.产品的鉴定产品的鉴定电泳方法电泳方法免疫学分析方法免疫学分析方法受体结合试验受体结合试验高效液相色谱法高效液相色谱法肽图分析法肽图分析法Edman N末端序列分析法末端序列分析法圆二色谱法圆二色谱法核磁共振法核磁共振法 (1)氨基酸成分分析氨基酸成分分析 氨基酸成分分析可为目的产物的纯度检定氨基酸成分分析可为目的产物的纯度检定提供信息。提供信息。

10、完整的氨基酸成份分析结果，应包括甲硫完整的氨基酸成份分析结果，应包括甲硫氨酸、半胱氨酸及色氨酸的准确值。氨基酸氨酸、半胱氨酸及色氨酸的准确值。氨基酸成份分析结果应为三次分别水解样品测定后成份分析结果应为三次分别水解样品测定后的平均值。的平均值。(2)肽图分析肽图分析n n肽肽图图分分析析（Peptide Mapping）：肽肽图图分分析析是是根根据据蛋蛋白白质质、多多肽肽的的分分子子量量大大小小以以及及氨氨基基酸酸组组成成特特点点，使使用用专专一一性性较较强强的的蛋蛋白白水水解解酶酶作作用用于于特特殊殊的的肽肽链链位位点点将将多多肽肽裂裂解解成成小小片片断断，通通过过一一定定的的分分离离检检测

11、测手手段段形形成成特特征性指纹图谱。征性指纹图谱。n n 肽肽图图分分析析可可作作为为与与天天然然产产品品或或参参考考品品作作精精密密比比较较的的手手段段。与与氨氨基基酸酸成成分分和和序序列列分分析结果合并，可作为蛋白质的精确鉴别。析结果合并，可作为蛋白质的精确鉴别。(3)重组蛋白质的浓度测定和相对分子质量测定重组蛋白质的浓度测定和相对分子质量测定 蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质浓浓浓浓度度度度测测测测定定定定方方方方法法法法主主主主要要要要有有有有凯凯凯凯氏氏氏氏定定定定氮氮氮氮法法法法、双双双双缩缩缩缩脲脲脲脲法法法法、染料结合比色法、福林染料结合比色法、福林染料结合比色法、福林染料结合比色法、

12、福林-酚法和紫外光谱法等。酚法和紫外光谱法等。酚法和紫外光谱法等。酚法和紫外光谱法等。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质相相相相对对对对分分分分子子子子质质质质量量量量测测测测定定定定最最最最常常常常用用用用的的的的方方方方法法法法有有有有凝凝凝凝胶胶胶胶过过过过滤滤滤滤法法法法和和和和SDS-PAGE法。法。法。法。(4)蛋白质二硫键分析蛋白质二硫键分析 测定方法有测定方法有:对氯汞苯甲酸法等对氯汞苯甲酸法等 5，5-二硫基双二硫基双-2-硝基苯甲酸法硝基苯甲酸法2、纯度分析纯度分析n n(1)目的蛋白质含量测定目的蛋白质含量测定n n(2)产物杂质检测产物杂质检测(1)目的蛋白质含量测定目的蛋白质含

13、量测定 测测定定蛋蛋白白质质含含量量的的方方法法可可根根据据目目的的蛋蛋白白质质的理化性质和生物学特性来设计。的理化性质和生物学特性来设计。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳高效液相色谱高效液相色谱(2)产物杂质检测产物杂质检测 基基因因工工程程产产物物的的杂杂质质包包括括蛋蛋白白质质和和非非蛋蛋白质两类。白质两类。蛋蛋白白类类杂杂质质：残残留留宿宿主主细细胞胞蛋蛋白白 采采用用免免疫分析的方法疫分析的方法非蛋白质类杂质：非蛋白质类杂质：病毒污染检查病毒污染检查无菌试验无菌试验热原质试验热原质试验残余细胞残余细胞DNA测定。测定。抗原性物质检查抗原性物质检查其他外源性物质其他外源性物质常用检

14、测方法：常用检测方法：常用检测方法：常用检测方法：杂质和污染物杂质和污染物杂质和污染物杂质和污染物杂质和污染物杂质和污染物 检检检检检检 测测测测测测 方方方方方方 法法法法法法内毒素内毒素内毒素内毒素内毒素内毒素 鲎试剂、家兔热原法鲎试剂、家兔热原法鲎试剂、家兔热原法鲎试剂、家兔热原法鲎试剂、家兔热原法鲎试剂、家兔热原法宿主细胞蛋白宿主细胞蛋白宿主细胞蛋白宿主细胞蛋白宿主细胞蛋白宿主细胞蛋白 免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析、SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE、CECECECECECE其它蛋白杂质其它蛋白

15、杂质其它蛋白杂质其它蛋白杂质其它蛋白杂质其它蛋白杂质 免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析、免疫分析、SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE、HPLCHPLCHPLCHPLCHPLCHPLC、CECECECECECE残余残余残余残余残余残余DNA DNADNA DNADNA DNADNA DNADNA DNADNA DNA杂交、紫外光谱、蛋白结合杂交、紫外光谱、蛋白结合杂交、紫外光谱、蛋白结合杂交、紫外光谱、蛋白结合杂交、紫外光谱、蛋白结合杂交、紫外光谱、蛋白结合蛋白变异蛋白变异蛋白变异蛋白变异蛋白变异蛋白变异 肽谱、肽谱、

16、肽谱、肽谱、肽谱、肽谱、HPLCHPLCHPLCHPLCHPLCHPLC、IEFIEFIEFIEFIEFIEF、CECECECECECE 3.生物活性生物活性(效价效价)测定测定n n 生物活性测定是保证基因工程药物产品生物活性测定是保证基因工程药物产品有效性的重要手段，往往需要进行动物体内有效性的重要手段，往往需要进行动物体内试验和通过细胞培养进行体外效价测定。试验和通过细胞培养进行体外效价测定。4.稳定性考察稳定性考察n n 药品的稳定性是评价药品有效性和安药品的稳定性是评价药品有效性和安全性的重要指标之一，也是确定药品贮全性的重要指标之一，也是确定药品贮藏条件和使用期限的主要依据。藏条件

17、和使用期限的主要依据。5、产品一致性的保证产品一致性的保证n n 只有对从原料、生产到产品的每一步只有对从原料、生产到产品的每一步骤都进行严格的控制和质量检定，才能骤都进行严格的控制和质量检定，才能确保各批最终产品都是安全有效、含量确保各批最终产品都是安全有效、含量和杂质限度一致并符合标准。和杂质限度一致并符合标准。第三节第三节 基因工程药物的检验基因工程药物的检验一、基因工程药物常用几种检验方法一、基因工程药物常用几种检验方法n n(一一)化学检定法化学检定法n n1.Lowry1.Lowry法则定蛋白质含量法则定蛋白质含量法则定蛋白质含量法则定蛋白质含量n n2.2.用电泳法用电泳法用电泳

18、法用电泳法(非还原型非还原型非还原型非还原型SDS-PAGESDS-PAGE法法法法)测定纯度测定纯度测定纯度测定纯度n n3.3.用高效液相色谱用高效液相色谱用高效液相色谱用高效液相色谱(HPLC)(HPLC)法测定纯度法测定纯度法测定纯度法测定纯度n n4.4.用电泳法用电泳法用电泳法用电泳法(还原型还原型还原型还原型SDS-PAGESDS-PAGE法法法法)测定相对分子质量测定相对分子质量测定相对分子质量测定相对分子质量n n5.5.用等电聚焦电泳法测等电点用等电聚焦电泳法测等电点用等电聚焦电泳法测等电点用等电聚焦电泳法测等电点(二二)肽图分析法肽图分析法n n肽图分析肽图分析肽图分析肽

19、图分析（Peptide MappingPeptide Mapping）：肽图分析是根据蛋）：肽图分析是根据蛋）：肽图分析是根据蛋）：肽图分析是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶（一般为肽链内切酶）用专一性较强的蛋白水解酶（一般为肽链内切酶）用专一性较强的蛋白水解酶（一般为肽链内切酶）用专一性较强的蛋白水解酶（一般为肽链内切酶）作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断，通过作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断，通过作用于特殊的

20、肽链位点将多肽裂解成小片断，通过作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断，通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱。一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱。一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱。一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱。n n 肽图谱分析是基因工程多肽药物质量控制的重要手肽图谱分析是基因工程多肽药物质量控制的重要手肽图谱分析是基因工程多肽药物质量控制的重要手肽图谱分析是基因工程多肽药物质量控制的重要手段。肽图谱对每一种蛋白质来说是特征的、专一的。段。肽图谱对每一种蛋白质来说是特征的、专一的。段。肽图谱对每一种蛋白质来说是特征的、专一的。段。肽图谱对每一种蛋白质来说是特征的、专一的。通过

21、肽图分析可以鉴别蛋白质，预测其一级结构特通过肽图分析可以鉴别蛋白质，预测其一级结构特通过肽图分析可以鉴别蛋白质，预测其一级结构特通过肽图分析可以鉴别蛋白质，预测其一级结构特征。征。征。征。(三三)外源性外源性DNA残留量的测定残留量的测定n n 检测残留检测残留DNA的方法可采用杂交分析技的方法可采用杂交分析技术、顺序单独分析技术或其他灵敏的分析技术、顺序单独分析技术或其他灵敏的分析技术。术。(四四)宿主细胞蛋白杂质的检测宿主细胞蛋白杂质的检测n n 宿宿主主蛋蛋白白是是基基因因工工程程药药物物特特有有的的杂杂质质，其其含含量量是是质质量量控控制制的的一一项项重重要要指指标标。目目前前采采用用

22、点点-免疫免疫结合法测定。结合法测定。(五五)无菌试验无菌试验 基基因因工工程程药药物物和和其其他他生生物物制制品品不不得得含含有有杂杂菌菌，灭灭活活疫疫苗苗不不得得含含有有活活的的本本菌菌、本本毒毒。在在制制造造过过程程中中应应由由制制造造部部门门按按各各制制品品制制造造及及检检定定规规程程规规定定进进行行无无菌菌试试验验，分分装装后后的的制制品品须须经质量检定部门做最后检定。经质量检定部门做最后检定。(六六)内毒素试验内毒素试验 n n基基因因工工程程药药物物内内毒毒素素的的检检定定按按照照中中国国生生物制品规程物制品规程2000年版的规定进行。年版的规定进行。n n(七七)异常毒性试验异

23、常毒性试验n n异常毒性试验是指各制品的特异性毒性异常毒性试验是指各制品的特异性毒性试验以外的一般安全试验。目的是通过试验以外的一般安全试验。目的是通过动物试验检查制品中外源性毒性物质的动物试验检查制品中外源性毒性物质的污染情况以及是否存在意外的不安全因污染情况以及是否存在意外的不安全因素，以保证人体使用安全。素，以保证人体使用安全。n(八八)热原质试验热原质试验 n n基基因因工工程程药药物物热热原原质质的的检检定定按按照照中中国国生生物制品规程物制品规程2000年版的规定进行。年版的规定进行。n(九九)生物学活性生物学活性(效价效价)检定检定 n n 各各种种基基因因工工程程药药物物活活性性(效效价价)的的检检定定按按照照中中国国生生物物制制品品规规程程2000年年版版的的规定进行。规定进行。此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢