肿瘤基因治疗--aa资料.ppt

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1、肿瘤基因治疗-aa引起肿瘤的原因很多：引起肿瘤的原因很多：物理因素物理因素物理因素物理因素化学因素化学因素化学因素化学因素病毒感染病毒感染病毒感染病毒感染任何原因引起的细胞癌变都是直接或任何原因引起的细胞癌变都是直接或间接引起宿主细胞基因功能的改变所间接引起宿主细胞基因功能的改变所致，因此，肿瘤是一种基因病。致，因此，肿瘤是一种基因病。与肿瘤有关的两类基因：与肿瘤有关的两类基因：癌基因（癌基因（Ontogeny,oncOntogeny,onc）抑癌基因（抑癌基因（Tumor suppressor geneTumor suppressor gene）癌基因（癌基因（癌基因（癌基因（oncogen

2、e,onconcogene,onc）是指细胞内控制细胞正）是指细胞内控制细胞正）是指细胞内控制细胞正）是指细胞内控制细胞正常生长的基因常生长的基因常生长的基因常生长的基因(原癌基因原癌基因原癌基因原癌基因)，在异常表达时，这，在异常表达时，这，在异常表达时，这，在异常表达时，这些基因不受体内各种调节因素的影响，可持续些基因不受体内各种调节因素的影响，可持续些基因不受体内各种调节因素的影响，可持续些基因不受体内各种调节因素的影响，可持续表达，或高活性表达，其产物可使细胞持续增表达，或高活性表达，其产物可使细胞持续增表达，或高活性表达，其产物可使细胞持续增表达，或高活性表达，其产物可使细胞持续增殖

3、。殖。殖。殖。原癌基因原癌基因原癌基因原癌基因:（Proto-oncProto-onc）是一种正常的细胞基因，）是一种正常的细胞基因，）是一种正常的细胞基因，）是一种正常的细胞基因，在正常细胞中编码关键性调控蛋白，在细胞增在正常细胞中编码关键性调控蛋白，在细胞增在正常细胞中编码关键性调控蛋白，在细胞增在正常细胞中编码关键性调控蛋白，在细胞增殖和分化中起重要调控作用，当其突变或调控殖和分化中起重要调控作用，当其突变或调控殖和分化中起重要调控作用，当其突变或调控殖和分化中起重要调控作用，当其突变或调控失灵时可引起细胞癌变失灵时可引起细胞癌变失灵时可引起细胞癌变失灵时可引起细胞癌变 肿肿瘤瘤基基因因

4、治治疗疗已已成成为为肿肿瘤瘤生生物物治治疗疗最最引引人人瞩瞩目目的的研研究究领领域域，是是继继手手术术、放放疗疗、化化疗疗、免免疫疫治治疗疗之之后后的的第第五五种种模式模式,是肿瘤治疗的有益补充。是肿瘤治疗的有益补充。基基因因治治疗疗就就是是用用正正常常或或野野生生型型基基因因校校正或置换致病基因的一种治疗方法。正或置换致病基因的一种治疗方法。基因治疗的程序基因治疗的程序选择治疗基因选择治疗基因选择运输治疗基因的载体选择运输治疗基因的载体将治疗基因导入体内或靶细胞将治疗基因导入体内或靶细胞治疗基因在体内表达治疗基因在体内表达基因治疗的基本程序：基因治疗的基本程序：1.目的基因准备；目的基因准备

5、；2.受体细胞（靶细胞）培养；受体细胞（靶细胞）培养；3.载体的选择与克隆；载体的选择与克隆；4.将目的基因导入靶细胞；将目的基因导入靶细胞；5.转导细胞的选择和鉴定；转导细胞的选择和鉴定；6.基因治疗的安全性鉴别及疗效评价基因治疗的安全性鉴别及疗效评价。基因治疗的主要措施有：基因治疗的主要措施有：1.基因置换基因置换（genereplacement）将致病基因整个的换以正常基因，使致病基因永久的得到更正；2.基因修正基因修正（genecorrection）将基因的突变碱基序列纠正，而正常部分给予保留；3.基因修饰基因修饰（geneaugmentation）将目的基因导入病变细胞或其它细胞，目

6、的基因的表达产物修饰改变缺陷细胞的功能，或使原有的功能得到增强；4.基因失活基因失活（geneinactivation）应用反义核苷酸或核酶特异的封闭某些致病基因的表达；区别几个概念：区别几个概念：将目的基因导入细胞或细菌，针对目的基因叫做将目的基因导入细胞或细菌，针对目的基因叫做转移转移（transfer）针对宿主细胞叫做针对宿主细胞叫做转导（转导（transduction）而这一过程叫做而这一过程叫做转染（转染（transfection）目的基因导入细胞导致宿主细胞的基因组分级至性状的改变叫目的基因导入细胞导致宿主细胞的基因组分级至性状的改变叫做做转化（转化（transformation）

7、第一节第一节增强宿主抗肿瘤免疫增强宿主抗肿瘤免疫肿瘤疫苗的作用肿瘤疫苗的作用抗肿瘤免疫有关的转基因治疗是肿瘤基因治疗的最初方抗肿瘤免疫有关的转基因治疗是肿瘤基因治疗的最初方案。为增强机体免疫系统对肿瘤的识别，免疫基因治疗主要案。为增强机体免疫系统对肿瘤的识别，免疫基因治疗主要包括包括一、通过一、通过APC增强对肿瘤抗原的识别与呈递。增强对肿瘤抗原的识别与呈递。二、增加肿瘤细胞表达细胞因子。二、增加肿瘤细胞表达细胞因子。三、增强肿瘤细胞表达的共刺激分子。三、增强肿瘤细胞表达的共刺激分子。第二节第二节恢复和增强抑癌基因的功能恢复和增强抑癌基因的功能引入抑癌基因引入抑癌基因抑癌基因是抗肿瘤基因治疗中

8、一类极为重要抑癌基因是抗肿瘤基因治疗中一类极为重要的目的基因，将这类基因导入肿瘤细胞或非肿瘤的目的基因，将这类基因导入肿瘤细胞或非肿瘤细胞，其表达产物通过复杂的基因调节或活化代细胞，其表达产物通过复杂的基因调节或活化代谢机制，能抑制肿瘤的恶性生长，甚至可导致癌谢机制，能抑制肿瘤的恶性生长，甚至可导致癌细胞逆转。虽然肿瘤的发生发展是一个多基因参细胞逆转。虽然肿瘤的发生发展是一个多基因参与、多步骤形成的过程，但在这些过程中某种癌与、多步骤形成的过程，但在这些过程中某种癌基因的激活或抑癌基因的失活可能起到了关键性基因的激活或抑癌基因的失活可能起到了关键性的作用。的作用。第第三三节节阻阻断断癌癌基基因

9、因功功能能-反反义义核核酸酸RNA干干扰扰技技术术细胞中原癌基因的表达受到严格控制。细胞中原癌基因的表达受到严格控制。ras、myc、src这一类癌基因由于突变而使其功能处于这一类癌基因由于突变而使其功能处于异常活跃状态，不断地激活细胞内正性调控细胞异常活跃状态，不断地激活细胞内正性调控细胞生长和增殖的信号传递通路，促使细胞异常生长。生长和增殖的信号传递通路，促使细胞异常生长。因此基因治疗思路也可以将癌基因反义序列导入因此基因治疗思路也可以将癌基因反义序列导入癌细胞来拮抗癌基因；或引入非等位癌细胞来拮抗癌基因；或引入非等位rev等方法，等方法，阻止癌基因功能。阻止癌基因功能。反义核酸技术的基本

10、原理是根据核酸碱基反义核酸技术的基本原理是根据核酸碱基互补配对的规律设计出能与靶基因特定区域结互补配对的规律设计出能与靶基因特定区域结合的合的DNA或或RNA，以影响其靶基因的表达，抑，以影响其靶基因的表达，抑制其功能。制其功能。RNA干扰干扰(RNAinterference,RNAi)是由双链是由双链RNA分子介导的序列特异性转录后基因沉默过分子介导的序列特异性转录后基因沉默过程，为双链程，为双链RNA分子在分子在mRNA水平上关闭相关水平上关闭相关基因表达的过程基因表达的过程,是一项新兴的基因阻断技术。是一项新兴的基因阻断技术。RNAi是一种转录后基因沉默是一种转录后基因沉默(posttr

11、anscriptionalgenesilencing,PTGS)现象。现象。与与传传统统的的基基因因研研究究方方法法基基因因敲敲除除、定定点点突突变变、反反义义核核酸酸及及核核酶酶技技术术等等相相比比，RNAi具具有有以以下下五大特点：五大特点：基因序列特异性；基因序列特异性；dsRNA的稳定性；的稳定性；沉默信号传递性；沉默信号传递性；Knock-down高效性；高效性；RNAi效用浓度依赖性。效用浓度依赖性。第四第四节节核核酶酶用于基因治用于基因治疗疗1983年美国Cech和Altmann发现并鉴定了一类具有酶催化作用的核苷酸片断，称为核酶(Ribozyme)。这一发现使酶的概念从蛋白领域

12、扩展到核酸领域。核酶具有核苷酸内切酶的活性，它能在无核酶具有核苷酸内切酶的活性，它能在无蛋白质的条件下切割靶蛋白质的条件下切割靶RNA分子分子。核酶用于基因治疗的条件是核酶用于基因治疗的条件是找出肿瘤发生发展中关键性的蛋白质；找出肿瘤发生发展中关键性的蛋白质；这种蛋白的氨基酸序列（和编码基因序这种蛋白的氨基酸序列（和编码基因序列）必须是已知的，以便设计核酶的切列）必须是已知的，以便设计核酶的切割位点；割位点；所设计的核酶必须能够切割靶所设计的核酶必须能够切割靶RNA；肿瘤细胞必须能摄取这种核酶，肿瘤细胞必须能摄取这种核酶，并能在细胞内切割靶并能在细胞内切割靶RNA。反义治疗并不像刚开始人们所想

13、像的反义治疗并不像刚开始人们所想像的那么简单，目前还有许多关键性问题有那么简单，目前还有许多关键性问题有待去解决，如生物学稳定性，药物的释待去解决，如生物学稳定性，药物的释放系统，以及由序列特异性和非特异性放系统，以及由序列特异性和非特异性所引起的作用包括毒副作用等。应用反所引起的作用包括毒副作用等。应用反义技术进行肿瘤基因治疗最常用的靶基义技术进行肿瘤基因治疗最常用的靶基因有因有Ha-ras、c-myc、c-fos、c-jum、c-erbB2等癌基因以及编码端粒酶基因，等癌基因以及编码端粒酶基因，或端粒酶的或端粒酶的RNA部分。部分。第五第五节节抗抗肿肿瘤血管生成的基因治瘤血管生成的基因治疗

14、疗 肿瘤的生长、转移与新生血管的形成密切相肿瘤的生长、转移与新生血管的形成密切相关关,由于肿瘤的血管生成受到血管生长因子、血管由于肿瘤的血管生成受到血管生长因子、血管生长抑制因子以及其它的因子的共同调控生长抑制因子以及其它的因子的共同调控,因此通因此通过阻断促血管生长因子作用或者强化血管生长抑过阻断促血管生长因子作用或者强化血管生长抑制因子的表达均可达到治疗的目的。制因子的表达均可达到治疗的目的。一、阻断血管生一、阻断血管生长长因子的作用因子的作用 主要是采用反义主要是采用反义DNA、中和性抗体、受体酪、中和性抗体、受体酪氨酸激酶的抑制剂以及核酶等。氨酸激酶的抑制剂以及核酶等。用腺病毒载体介导

15、的用腺病毒载体介导的VEGF的拮抗物输入鼠卵巢的拮抗物输入鼠卵巢癌抑制癌抑制VEGF的活性的活性；利用含有利用含有VEGFcDNA的腺病毒载体转染乳腺癌的腺病毒载体转染乳腺癌细胞细胞,用以拮抗用以拮抗VEGF的促血管生成作用的促血管生成作用；用抗用抗VEGF的核酶抑制的核酶抑制VEGF的表达的表达,使卵巢癌使卵巢癌生长及血管生成减少的报告。生长及血管生成减少的报告。针对其它的血管生成因子的治疗针对其它的血管生成因子的治疗,如如bFGF,缺氧缺氧诱导因子诱导因子(HIF),EGF,PDGF,PDECGF,IGF,Ets-1,HGF等的因子的治疗。等的因子的治疗。二、上二、上调调血管生血管生长长抑

16、制因子抑制因子 用重组血管抑素用重组血管抑素cDNA输入消化道肿瘤输入消化道肿瘤可取得较好的治疗效果可取得较好的治疗效果,用编码内皮抑素的重组腺病毒载体可抑制用编码内皮抑素的重组腺病毒载体可抑制内皮细胞迁移和内皮细胞迁移和VEGF介导的血管生成介导的血管生成,病毒载体介导的重组编码病毒载体介导的重组编码PF4的反义基因显的反义基因显示出抗鳞癌血管生长的作用。示出抗鳞癌血管生长的作用。三三、抑抑制制细细胞胞外外基基质质和和基基膜膜降降解解以以及及抑抑制制内内皮皮细细胞特异性粘附分子的作用胞特异性粘附分子的作用 用腺病毒载体介导的用腺病毒载体介导的T1MP-1基因转染肿基因转染肿瘤细胞瘤细胞,瘤细

17、胞产生的瘤细胞产生的T1MP-1抑制了抑制了MMP-2,MMP-9的活性的活性,使内皮细胞的迁移受到抑制。使内皮细胞的迁移受到抑制。Gondi等采用双顺反子逆转录病毒载体介导的等采用双顺反子逆转录病毒载体介导的反义反义uPAR和和uPA治疗胶质瘤治疗胶质瘤,明显抑制了肿明显抑制了肿瘤的血管生成。瘤的血管生成。第五节第五节、加大肿瘤细胞与正常细胞的天然差别、加大肿瘤细胞与正常细胞的天然差别自杀基因治疗自杀基因治疗自杀基因（自杀基因（suicidegene）治疗思路就是人为地）治疗思路就是人为地改变肿瘤细胞的状态，将一些改变肿瘤细胞的状态，将一些“自杀基因自杀基因”(TK基因、基因、CD基因和较新

18、的细胞色素基因和较新的细胞色素p450-2B1基因基因)转导入肿瘤细胞中，这些基因所表达转导入肿瘤细胞中，这些基因所表达的产物能将原先对细胞无毒或相对低毒的物质的产物能将原先对细胞无毒或相对低毒的物质转变为细胞毒性物质，而引起到杀伤细胞的作转变为细胞毒性物质，而引起到杀伤细胞的作用。用。自杀基因治疗对免疫功能的激发作用自杀基因治疗对免疫功能的激发作用诱导炎症细胞浸润（诱导炎症细胞浸润（T细胞、单核细胞、细胞、单核细胞、中性粒细胞）；中性粒细胞）；诱导细胞因子的分泌（诱导细胞因子的分泌（IL-1、TNF-、IL-1、IL-6、mRNA在治疗后第在治疗后第2天开始表天开始表达达,而而IFN-、GM

19、-CSF在治疗后第在治疗后第2天开始天开始表达，到治疗后第表达，到治疗后第4天仍有表达，其中以天仍有表达，其中以TNF-表达升高最明显）。表达升高最明显）。第六节第六节提高化疗效应提高化疗效应耐药基因治疗耐药基因治疗 肿瘤化疗中最难处理的问题之一肿瘤化疗中最难处理的问题之一就是出现瘤就是出现瘤细胞对许多常用化疗药物产生抗药性和交叉抗药细胞对许多常用化疗药物产生抗药性和交叉抗药性，有些肿瘤开始敏感，但经过一段时间后出现性，有些肿瘤开始敏感，但经过一段时间后出现耐药性耐药性,这种耐药性常表现为这种耐药性常表现为肿瘤细胞对多种结肿瘤细胞对多种结构不同、作用靶位不同、作用方式不同的抗肿瘤构不同、作用靶

20、位不同、作用方式不同的抗肿瘤药物具有抵抗性药物具有抵抗性,称为多药耐药称为多药耐药(multidrugeresistance,MDR)。在肿瘤治疗中多在肿瘤治疗中多数抗癌药物是促进数抗癌药物是促进细胞凋亡的，而癌细胞凋亡的，而癌细胞的耐药是化疗细胞的耐药是化疗中最棘手的问题。中最棘手的问题。在报道中将在报道中将BCl-2转入癌细胞则癌细转入癌细胞则癌细胞变为耐药，目前胞变为耐药，目前从凋亡角度来研究从凋亡角度来研究肿瘤的耐药性，可肿瘤的耐药性，可能找到新的解决方能找到新的解决方法。法。第七第七节节肿肿瘤基因治瘤基因治疗疗研究面研究面临临的主要的主要问题问题基因治基因治疗疗是是21世世纪纪治治疗

21、恶疗恶性性肿肿瘤的重要手段。瘤的重要手段。一、基因一、基因导导入的入的载载体系体系统统 目前所采用的载体主要分为转染性和转导性载体。目前所采用的载体主要分为转染性和转导性载体。转染性载体是利用化学或物理方法增加细胞膜的通转染性载体是利用化学或物理方法增加细胞膜的通透性而将透性而将DNA转染入细胞内转染入细胞内,包括脂质体和基因枪等。包括脂质体和基因枪等。转导性载体则是利用病毒对细胞的天然亲和力把遗转导性载体则是利用病毒对细胞的天然亲和力把遗传物质引入宿主细胞。传物质引入宿主细胞。转染的方法相对简易转染的方法相对简易,抗原性弱但效率较低抗原性弱但效率较低,而且基而且基因表达的持久性不够。因此它在

22、肿瘤基因治疗中的使用因表达的持久性不够。因此它在肿瘤基因治疗中的使用受到限制。转导法则效率高受到限制。转导法则效率高,作用持久作用持久,但抗原性较强但抗原性较强,目目前大多数基因治疗程序仍以病毒介导。逆转录病毒是目前大多数基因治疗程序仍以病毒介导。逆转录病毒是目前最为成熟、运用最广的进行基因转移的载体系统。前最为成熟、运用最广的进行基因转移的载体系统。二、基因治二、基因治疗疗的靶向性策略的靶向性策略带带有有目目的的基基因因的的载载体体如如何何到到达达“靶靶细细胞胞”是是肿肿瘤瘤基基因因治治疗疗的的关关键键。只只有有提提高高基基因因转转导导的的靶靶向向性性,才才能能实实现现治治疗疗的的针针对对性

23、性和安全性。和安全性。目前解决基因的靶向目前解决基因的靶向转转移及表达有移及表达有3种策略种策略用用基基因因工工程程手手段段改改造造基基因因载载体体,如如改改造造逆逆转转录录病病毒毒包包装装细细胞胞中中的的原原病病毒毒env序序列列,使使所所包包装装的的重重组组病病毒毒特特异异地地识识别别位位于靶于靶细细胞表面的抗原或受体决定簇胞表面的抗原或受体决定簇;在在体体内内基基因因传传递递系系统统中中共共价价连连接接抗抗瘤瘤抗抗体体和和肿肿瘤瘤细细胞胞特特异异受受体体的的配配基基,使使基基因因在在类类似似“生生物物导导弹弹”作作用用下下被被送送到到肿肿瘤瘤细细胞表面胞表面;应用肿瘤细胞特异蛋白应用肿瘤

24、细胞特异蛋白“管家基因管家基因”的基因表面调控元的基因表面调控元件件,在转录水平调控目的基因在靶细胞中特异表达。国外已在转录水平调控目的基因在靶细胞中特异表达。国外已开始针对开始针对VEGF、VEGF-R1、VEGF-R2设计反义基因或调设计反义基因或调控控VEGF的基因作为目的基因的基因作为目的基因,这种思路很有发展前途这种思路很有发展前途。三、外源基因在体内表达的可控性三、外源基因在体内表达的可控性 外源基因导入后外源基因导入后,在体内的表达若能人为调控在体内的表达若能人为调控,将对将对恶性肿瘤及诸多疾病的基因治疗有所突破。目前已经发恶性肿瘤及诸多疾病的基因治疗有所突破。目前已经发现了一个

25、可诱导的调控系统现了一个可诱导的调控系统TAXI/UAS系统。该系统系统。该系统应用一个酵母应用一个酵母GAL4的顺式元件作为外源基因的上游的顺式元件作为外源基因的上游,另组建一个激素受体另组建一个激素受体(孕酮孕酮)及一段及一段GAL4的反调控基因的反调控基因子的嵌体子的嵌体,将两个载体共转染靶细胞后将两个载体共转染靶细胞后,只有当诱导物只有当诱导物(孕酮孕酮)或其拮抗物或其拮抗物(米非司酮米非司酮)存在时存在时,目的基因才能表目的基因才能表达。达。四、其他原因四、其他原因某某些些体体内内原原代代细细胞胞转转基基因因及及基基因因表表达达水水平平往往往不及体外建株往不及体外建株细细胞；胞；靶基

26、因在体内表达持靶基因在体内表达持续时间较续时间较短；短；在在处处理理多多系系统统基基因因紊紊乱乱过过程程中中基基因因治治疗疗的的作作用用远远未清楚；未清楚；基因治疗刚开始用于人体实验，其长期疗效基因治疗刚开始用于人体实验，其长期疗效和不良作用尚不清楚，有待于大量的实验研究和不良作用尚不清楚，有待于大量的实验研究问题问题与展望与展望肿肿瘤瘤基基因因治治疗疗的的研研究究进进展展很很快快，临临床床上上在在部部分分肿肿瘤瘤中中使使用用基基因因治治疗疗已已经经显显示示出出较较好好的的抗抗癌癌、抑抑癌癌作作用用与与较较轻轻微微的的副副作作用用，但但还还需需要要进进一一步步增增加加该该疗疗法法的的特特异异性

27、性与与基基因因转导转导靶癌靶癌细细胞的有效性研究。胞的有效性研究。目目前前使使用用最最多多的的是是病病毒毒载载体体，如如：逆逆转转录录病病毒毒、腺腺病病毒毒、腺腺相相关关病病毒毒和和疱疱疹疹病病毒毒。非非病病毒毒的的基基因因治治疗疗方方法法包包括括：脂脂质质体体、无无载载体体的的DNA（裸裸DNA）注注射射、蛋蛋白白DNA复复合合物物（基基因因枪枪）、磷磷酸酸钙钙试试剂剂、电电启启动动子子、细细胞胞内内微微量量注注射射DNA等。等。尽尽管管在在体体内内载载体体的的转转导导与与表表达达率率尚尚不不够够理理想想，临临床床上上还还没没有有较较全全面面的的成成功功经经验验，但但面面对对复复杂杂的基因治

28、的基因治疗疗，目前研究重点策略在于，目前研究重点策略在于增增强强对肿对肿瘤的免疫反瘤的免疫反应应。修修复复细细胞胞周周期期中中由由肿肿瘤瘤抑抑制制基基因因丧丧失失或或癌癌基因激活而造成的基因激活而造成的细细胞胞DNA损伤损伤。自自杀杀基基因因的的策策略略还还有有基基因因标标记记研研究究与与在在基基因治因治疗疗中中对对正常正常组织组织的保的保护护措施等。措施等。只只有有解解决决了了这这一一系系列列问问题题后后，基基因因治治疗疗才才能真正用于能真正用于临临床，造福于床，造福于肿肿瘤患者。瘤患者。此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢