免疫血清学检验技术精选PPT.ppt
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1、关于免疫血清学检验技术第1页,讲稿共105张,创作于星期一凝集反应:细菌、螺旋体、红细胞或细胞性抗原等颗粒性抗原,或可溶性抗原(或抗体)与载体颗粒结合成致敏颗粒后,它们与相应抗体(或抗原)发生特异性反应,在适当电解质存在下,形成肉眼可见的凝集现象。一、凝集反应及其特点第一节 凝集与沉淀反应第2页,讲稿共105张,创作于星期一凝集反应过程:抗原抗体的特异性结合出现肉眼可见的凝集现象凝集反应特点:IgM的作用比IgG大数百倍IgG与抗原结合后,常不出现凝集现象,称不完全抗体临床意义:进行细菌的抗原分析、鉴定及分型,也可应用已知细菌检查未知血清的抗体。第3页,讲稿共105张,创作于星期一多 克 隆
2、抗 体单 克 隆 抗 体肌红蛋白上清液第4页,讲稿共105张,创作于星期一肉眼可见的凝集现象第5页,讲稿共105张,创作于星期一直接凝集反应(direct agglutination):颗粒性抗原直接与抗体结合,在电解质的作用下,出现肉眼可见的凝集现象。二、直接凝集反应第6页,讲稿共105张,创作于星期一(一)玻片凝集试验+方法评价:定性试验简便和快速敏感度低临床应用:菌种鉴定血清学分型血型鉴定第7页,讲稿共105张,创作于星期一(二)试管凝集试验方法评价:半定量试验简便、快速敏感度低可有假阳性临床应用:肥达氏试验:伤寒副伤寒外裴二氏试验:斑疹伤寒Wright test:布鲁菌病交叉配血试验第
3、8页,讲稿共105张,创作于星期一间接凝集反应(indirect agglutination):将可溶性抗原或抗体吸附于颗粒性载体表面,然后与相应的抗体或抗原反应,在电解质的作用下,出现肉眼可见的凝集现象。载体种类:RBC(醛化);聚苯乙烯胶乳颗粒(羧化);金黄色葡萄球菌。三、间接凝集反应第9页,讲稿共105张,创作于星期一用抗原致敏载体-检测抗体(一)间接凝集反应的类型1、正向间接凝集试验第10页,讲稿共105张,创作于星期一用抗体致敏载体-检测抗原2、反向间接凝集试验第11页,讲稿共105张,创作于星期一用抗原致敏载体-检测抗原3、间接凝集抑制试验第12页,讲稿共105张,创作于星期一co
4、agglutination test:以金黄色葡萄球菌菌体为反应的载体。人及多种哺乳动物(猪、兔、豚鼠等)血清中IgG抗体的FC段与菌体表面的A蛋白(SPA)非特异性结合后,IgG的两个Fab段仍然暴露在菌体表面,保持着结合抗原的活性和特异性。当与特异性抗原相遇时,能出现特异的凝集现象。SPA-(Fc)IgG(Fab)-AbSPA:staphylococcal protein A4、协同凝集试验第13页,讲稿共105张,创作于星期一(二)正向间接血凝试验血凝试验强度第14页,讲稿共105张,创作于星期一1/21/21/41/41/81/81/161/161/321/321/641/641/12
5、81/1281/2561/2561/5121/5121/10241/1024Pos.Pos.Neg.Neg.TiterTiter64648 8512512290%-半衰期60.2d12.3y标记方法简单复杂标记设备低廉昂贵测量条件简单复杂第36页,讲稿共105张,创作于星期一一、放射免疫分析1、基本原理:Ab限量,Ag*定量,Ag*与Ag具有等同的与Ab结合能力,且两者的总量大于Ab结合位点,二者通过竞争方式与Ab结合;随着Ag增加,Ag*与Ab结合形成Ag*Ab复合物的放射量降低,二者变化成函数关系。第37页,讲稿共105张,创作于星期一第38页,讲稿共105张,创作于星期一以未结合的Ag*
6、为F,Ag*-Ab复合物为B,则B/F或B/T(BF)与Ag的量变存在着剂量-反应曲线。第39页,讲稿共105张,创作于星期一2、实验方法及测定Ag*Ag*AgAg平衡平衡非平衡非平衡一步法一步法二步法二步法AbAb体积温度时间pHAg*-标准;Ag-样品第40页,讲稿共105张,创作于星期一二抗体沉淀法二抗体沉淀法 PEG PEG 沉淀法沉淀法 PR PR 试剂法试剂法 活性炭吸附法活性炭吸附法 分离彻底,迅速分离试剂和过程不影响反应平衡效果不受反应介质影响 操作应简单、重复性好经济 结合与游离标记物的分离第41页,讲稿共105张,创作于星期一二、免疫放射分析1、基本原理:以过量125I标记
7、抗体与待测抗原进行非竞争性免疫结合反应,用固相免疫吸附剂对B或F进行分离,其灵敏度和可测范围均优于RIA操作也较RIA简单。第42页,讲稿共105张,创作于星期一2、单位点 IRMA先用过量标记抗体与待测抗原进行反应,形成抗原抗体复合物;用固相抗原结合游离的标记抗体并将其分离,测定上清液的放射量 第43页,讲稿共105张,创作于星期一3、双位点 IRMA先用固相抗体与抗原结合,再用过量的标记抗体与抗原的另一决定簇结合,形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物,洗弃剩余标记抗体,测固相上放射性。第44页,讲稿共105张,创作于星期一RIARIAIRMAIRMA标记物抗原抗体原理竞争性结合非竞争结合反应
8、体系Ag*、Ag、Ab固相Ab、Ab*、Ag反应动力学慢快灵敏度相对低高检测范围窄宽1-2数量级特异性差(PcAb)优(McAb)标准曲线结合率与测值成反比结合率与测值成正比待测抗原大小分子二抗原决定簇IRMA与RIA比较第45页,讲稿共105张,创作于星期一 将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合,用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度,对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。第三节 荧光免疫技术(一)荧光免疫分析的基本原理第46页,讲稿共105张,创作于星期一均相荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定荧光酶免疫测定非均相荧光免疫测定荧光偏振免疫测定荧光免疫技术荧光免疫技术的类型荧光免疫
9、测定液体样品测定荧光抗体技术固体样品测定直接法间接法双标记法第47页,讲稿共105张,创作于星期一荧光物质ex(nm)em(nm)应用异硫氰酸荧光素(FITC)490495520530(黄绿色)FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明(RB200)570575595600(橙红色)FITC的衬比染色或双标记FAT四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550620(橙红色)FITC的衬比染色或双标记FAT藻红蛋白(PE)490-560595(红色)双标记FAT、流式细胞术7-氨基-4-甲基香豆素354430(蓝色)双标记或多标记FATEu3+螯合物340613时间分辨荧光免疫测定荧光免疫测定中常用的荧光
10、物质 第48页,讲稿共105张,创作于星期一时间分辨检测原理示意图(二)时间分辨荧光免疫测定1、基本原理第49页,讲稿共105张,创作于星期一镧系元素铕(Eu3+)(最常用);钐(Sm3+);铽(Tb3+);钕(Nd3+);镝(Dy3+)荧光物质荧光寿命(ns)荧光物质荧光寿命(ns)非特异荧光背景110Sm3+-NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000球蛋白3.0Eu3+-NTA714000细胞色素C3.5Eu3+-PTA925000FITC4.5Tb3+-PTA96000丹黄酰氯14Dy3+-PTA10002、标记物常见荧光物质的荧光寿命第50页,讲稿共105张,创作于星
11、期一3、信号增强作用结合-二酮体Eu3+解离pH4荧光增强Eu3+标记的抗原-抗体复合物固相双抗体夹心法原理示意图第51页,讲稿共105张,创作于星期一固相抗体-待检抗原-Eu3+标记抗体复合物在酸性增强液下,Eu3+解离,340nm激发光下发射613nm荧光。4、双抗体夹心法第52页,讲稿共105张,创作于星期一待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合,温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度,荧光强度与待检抗原含量成反比。5、固相抗体竞争法第53页,讲稿共105张,创作于星期一待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体,温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度,荧光强
12、度与待检抗原含量成反比。6、固相抗原竞争法第54页,讲稿共105张,创作于星期一荧光偏振免疫测定原理示意图(三)荧光偏振免疫测定第55页,讲稿共105张,创作于星期一荧光酶免疫测定荧光物质产生示意图荧光酶免疫测定荧光物质产生示意图 酶标记抗体或抗原,与固相载体包被的抗原或抗体特异性结合。洗去游离的酶标物。加入底物,经酶分解后生成荧光产物。(四)荧光酶免疫测定第56页,讲稿共105张,创作于星期一标记酶底物荧光产物 ex(nm)em(nm)响应信号碱性磷酸酶4-MUP4-MU36045010-半乳糖苷酶4-MUG4-MU36045010辣根过氧化物酶HPA二聚体3174140.03荧光酶免疫测定
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