目的基因的获取.pptx

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1、第四章第四章 目的基因的获取目的基因的获取目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。第1页/共57页第一节 基因组DNA片断化一、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。酶切第2页/共57页由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。1.优点2.缺点目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！BamH IBamH IBamH Igene第3页/共57页二、随机片断化1.限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度。（1 1）限制性内切酶的选用原则）限制性内

2、切酶的选用原则第4页/共57页1）4bp的内切酶平均每46（4096）bp一个切点。2）6bp的内切酶平均每44（256）bp一个切点。随机程度高。如Hae、AluI、Sau3A。内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。（Sau3ABamH I）第5页/共57页2.机械切割法（1）超声波超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。（2）高速搅拌1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。第6页/共57页1976年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。第二节 化学合成目

3、的基因一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化合成法。第7页/共57页 保护dNTP的5端P 或3端-OH 用酸或碱的脱保护（1）原理1.磷酸二酯法 带保护的单核苷酸连接保证合成反应的定向进行。带5保护的单核苷酸与带3保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。第8页/共57页（2）合成过程下一个5端保护的单核苷酸又可以同3端保护的二核苷酸聚合。第9页/共57页原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在3端磷酸和5-OH上都先连接了一个保护基团。2.磷酸三酯法第10页/共57页 将第一个核苷酸的3-OH端固定在固相支持物上。固相磷酸三酯合成法是目前通用的合

4、成方法。15合成的二核苷酸连接处有三个酯键！第11页/共57页固相磷酸三酯合成过程固相支持物结果是全保护的DNA：5 DMT,3固相支持物,核苷酸之间对氯苯。最后脱保护固相支持物固相支持物C第12页/共57页化学合成的DNA片断一般在200bp以内。二、化学合成DNA片断的组装用T4多核苷酸激酶使各个片段的5端带上磷酸。1.互补连接法预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。（2）5端磷酸化（1）互补配对（合成的DNA单链的5端是-OH）第13页/共57页T4 DNA连接酶T4多核苷酸激酶使5-OH磷酸化完整的DNA双链（3 3）连接酶连成完整双链第14

5、页/共57页2.互补延伸连接法预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。355353T4DNA连接酶Klenow片段引物第15页/共57页1.直接合成基因三、寡聚核苷酸化学合成的优点2.合成引物（20mer左右）（1）mRNA的含量很低，很难作cDNA3.合成探针序列4.定点突变合成合成带有定点突变的基因片断。（2）有些基因比较短，化学合成费用较低第16页/共57页DNA合成仪5.合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或衔接物（Linker）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor第17页/共57页 将

6、某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。一、基因文库的构建1.基因文库（gene library）第三节 目的基因的保存和扩增第18页/共57页（2）目前常用的载体 2.构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。（1）对载体的要求载体系列：容量为 24 kpcosmid载体：容量为 50 kb YAC：容量为 1 MbBAC:容量为 3

7、00 kb第19页/共57页断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。（1）染色体DNA大片段的制备3.基因文库构建的一般步骤超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。物理切割法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。酶切法：第20页/共57页（2）载体与基因组DNA大片段的连接 粘性末端直接连接载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A与BamHI的酶切末端。直接连接、人工接头或同聚物加尾。人工接头法（adapter）人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。第21页/共57页各种酶的接头可以向公司定做或购买。接上人工接头

8、粘性末端CCCCCC末端转移酶粘性末端 同聚物加尾第22页/共57页第23页/共57页4.基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）f:插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因 组DNA的百分数N：所需的重组载体数（克隆数）第24页/共57页例如：人的基因组是 3109 bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7104 bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61GfN=4.61GfG：Genome大小；f：fragment大小N=4.61Gf=4.61

9、31091.7104=8.1105第25页/共57页1.cDNA以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。2.cDNA library二、cDNA文库的构建mRNAcDNA3355反转录酶引物利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。第26页/共57页（1 1）不含内含子序列不含内含子序列。（2 2）可以在细菌中直接表达。）可以在细菌中直接表达。（3 3）包含了所有）包含了所有编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因。（4 4）比）比DNADNA文库小文库小的多，容易构建。的多，容易构建。4.构建cDNA文库的一般步骤（1）总RN

10、A（total RNA）提取3.cDNA文库的特点提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。第27页/共57页分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-2%。（2）mRNA的分离纯化 原理 mRNA的分离纯化Column（柱）第28页/共57页第29页/共57页反转录酶（3）cDNA的合成 cDNA第一链合成逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。mRNAcDNA355AAAAAAATTTTTTTOligo dT引

11、物第30页/共57页用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3355反转录酶引物mRNAcDNA第一链3355引物cDNA第一链35引物 降解mRNA模板或RNaseH碱第31页/共57页剩下的cDNA单链的3末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。cDNA第一链5cDNA第二链合成DNA聚合酶cDNA第一链cDNA第二链53 cDNA第二链合成第32页/共57页去掉发卡结构核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA第一链cDN

12、A第二链53cDNA第一链cDNA第二链5353第33页/共57页第34页/共57页这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。妙用RNaseH小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。DNA Pol I除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。第35页/共57页mRNAcDNA35反转录酶引物mRNAcDNA第一链35引物mRNAcDNA第一链35mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二链cDNA第一链35RNaseHDNA ligase去引物第36页/共57页第37页/共57页在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，

13、转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3端分别加上几个C或G，成为粘性末端。5.5.cDNA与载体连接：接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶第38页/共57页第39页/共57页6.cDNA文库的大小一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文库包含了完整mRNA的概率（99%）:某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例N：所需的重组载体数（克隆数）1n1n第40页/共57页三、文库的查询（screening）用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southern blot杂交。文库载体探针电泳后杂交放射自显

14、影测序分析第41页/共57页第四节 目的基因的分离和扩增一、目的基因的分离1.探针柱分离特异mRNA根据已知的基因序列合成探针，结合到纤维素柱上，用来分离纯化该基因的mRNA。富集特定基因的mRNA或cDNA模板。第42页/共57页纤维柱探针DNA探针DNA探针DNA探针DNATotal mRNA纤维柱探针DNA探针DNA探针DNA探针DNA过柱与探针碱基互补的mRNA结合到柱上，其它mRNA流走。特异mRNA洗脱RT-PCR第43页/共57页2.mRNA消解杂交原理：羟基磷灰石柱结合单链DNA-RNA或DNA-DNA双链，不结合单链DNA。（Hydroxylapatite column）第4

15、4页/共57页从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取和分离总mRNA。将表达A蛋白的mRNA合成cDNA第一链。再同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因的cDNA单链。用羟磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。第45页/共57页AAA组织B组织总mRNA（A）总mRNA（B）含蛋白A的mRNA不含蛋白A的mRNA总cDNA第一链A杂交内含蛋白A 的cDNA羟磷灰石柱过柱吸收RNA-DNA单链滤过羟磷灰石柱BAPCR16cDNA文库第46页/共57页3.mRNA差异显示PCR（DD RT-PCR）mRNA

16、 differential display RT-PCR（1）3端的锚定引物Oligo(dT)引物的3端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA35NM TTTTTTTTM：A、G or CN:A、G、T or C53第47页/共57页（2）12种锚定引物AG TTTTTTTT53CG TTTTTTTT53GG TTTTTTTT53TG TTTTTTTT53AA TTTTTTTT53CA TTTTTTTT53GA TTTTTTTT53TA TTTTTTTT53AC TTTTTTTT53CC TTTTTTTT53GC TTTTTTTT53TC TTTTTTTT

17、53第48页/共57页（3）5端的随即引物10 mer AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA35NM TTTTTTTT53扩增cDNA第一链。RTNM TTTTTTTT5cDNA3NNNNNNNNNN53NNNNNNNNNN53cDNA第二链，并PCR第49页/共57页（4）随机引物与锚定引物成对扩增12种锚定引物，若与20种随机引物，可组成240组引物。引物组合：240组在能分出20000多条带！实验结果：如果每条带相当于一种mRNA，20000 mRNA基本上反映了一种特定细胞中全部的mRNA。在测序胶上，每组扩出50-100条长度为100-500bp的带。第50页/共57页（5）随机

18、-锚定引物PCR的产物电泳比较不同组织的240组引物组合PCR产物在测序胶中电泳。选择有差异的带，进一步PCR作探针。筛选文库，找到差别基因的全长序列。第51页/共57页二、PCR扩增获得目的基因1.直接从基因组中扩增（1）提取基因组DNA作模板（2）根据目的基因序列设计引物（3）PCR扩增真核生物基因组含有内含子！适合扩增原核生物基因。第52页/共57页原核基因组部分原核细胞提取基因组DNAPCR扩增第53页/共57页（1）提取基因组 total RNA（2）反转录合成总cDNA作模板（4）PCR扩增（3）根据目的基因序列设计引物2.从mRNA中扩增:RT-PCR原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。适合扩增真核生物基因。第54页/共57页目的基因的引物1反转录成目的基因cDNA第一链目的基因的引物2目的 基因cDNA第二链PCRmRNA第55页/共57页克隆外源基因第56页/共57页感谢您的观看！第57页/共57页