荧光光谱分析法-课件培训资料.ppt

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1、荧光光谱分析法-课件2用荧光抗体染色之用荧光抗体染色之原生动物原生动物澳大利亚科学家最新发现，澳大利亚科学家最新发现，一种叫一种叫“螳螂虾螳螂虾”的海里的海里动物通过发出色彩鲜艳的动物通过发出色彩鲜艳的荧光来恐吓警告敌对者或荧光来恐吓警告敌对者或者吸引性配偶，者吸引性配偶，3K.Brejc et.al.,PNAS 94(1997)23061 nmgreen-fluorescent protein(GFP)4第五章第五章 荧光分析法荧光分析法第一节第一节 荧光分析法的基本原理荧光分析法的基本原理荧光分析法的基本原理荧光分析法的基本原理第二节第二节 荧光定量分析方法荧光定量分析方法第三节第三节 荧

2、光分光光度计荧光分光光度计5 某些物质受到光照射，除吸收某种波长的光之外，发射出某些物质受到光照射，除吸收某种波长的光之外，发射出比原来所吸收光的波长更长的光比原来所吸收光的波长更长的光光致发光光致发光（二级光）。（二级光）。光致发光光致发光荧光荧光fluorescence磷光磷光phosphorescence 荧光分析法是根据物质的荧光分析法是根据物质的荧光谱线的位置荧光谱线的位置及其及其强度强度进进行物质鉴定和含量测定的仪器方法。行物质鉴定和含量测定的仪器方法。6分子荧光分析的特点：分子荧光分析的特点：1.灵敏度灵敏度高：高：一般紫外一可见分光光度法的检出限一般紫外一可见分光光度法的检出限

3、约为约为10-7g/ml，而荧光分析法的检出限可达到而荧光分析法的检出限可达到10-10甚至甚至10-12g/ml。2.选择性选择性好好3.线性范围线性范围宽宽4.应用范围应用范围窄窄7第一节第一节 荧光分析法的基本原理荧光分析法的基本原理1.分子荧光的产生分子荧光的产生一、分子荧光一、分子荧光molecularfluorescence分子能级比原子能级复杂分子能级比原子能级复杂在分子体系中，每个电子能级上都存在振动、转动能级在分子体系中，每个电子能级上都存在振动、转动能级室温下大多数分子处于基态的最低振动能层室温下大多数分子处于基态的最低振动能层在基态时，含有偶数个电子的分子，电子的在基态时

4、，含有偶数个电子的分子，电子的ms为为+1/2和和-1/2,s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为则该分子所处的电子能态称为基态单重态基态单重态,用符号用符号S0表示表示8分子吸收辐射后分子吸收辐射后电子被激发且不发生自旋方向的改变电子被激发且不发生自旋方向的改变ms为为+1/2和和-1/2,s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为则该分子所处的电子能态称为激发单重态激发单重态,用符号用符号S表示。表示。（S1S2S3）电子被激发且伴随着自旋方向的改变电子被激发且伴随着自旋方向的改变ms为为+1/2和和+1/2,s=1，M=3。则该分子所处的电子能态称为则该分子所处的电子能态称为激发三重

5、态激发三重态,用符号用符号T表示。（表示。（T1T2T3）S09小结：分子能级与跃迁小结：分子能级与跃迁基基态态(S0)激激发发态态：吸吸收收特特定定频频率率的的辐辐射射；量量子子化化；跃跃迁迁一次到位；一次到位；激激发发态态基基态态：多多种种途途径径和和方方式式(见见能能级级图图)；速速度度最最快快、激发态寿命最短的途径占优势，发生的几率大；激发态寿命最短的途径占优势，发生的几率大；第一、第二、第一、第二、电子激发单重态电子激发单重态S1、S2；第一、第二、第一、第二、电子激发三重态电子激发三重态T1、T2；电子能级的多重性电子能级的多重性M=2S+1 平平行行自自旋旋比比成成对对自自旋旋稳

6、稳定定(洪洪特特规规则则)，三三重重态态能能级级比比相相应应单重态能级低；单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；大多数有机分子的基态处于单重态；10S0S1、S2允许跃迁；允许跃迁；S0T1、T2禁阻跃迁；通过其他途径进入禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图见能级图)；进入的几率小；进入的几率小；小结：激发单重态与激发三重态的不同小结：激发单重态与激发三重态的不同激激发发单单重重态态分分子子中中没没有有净净电电子子自自旋旋，因因而而具具有有反反磁磁性性；激激发三重态有发三重态有2个自旋平行电子，是顺磁性的个自旋平行电子，是顺磁性的激激发发单单重重态态分分子子平平均均寿寿命命短短（10-

7、810-6s），而而激激发发三三重重态态的长（的长（10-410s）基基态态单单重重态态到到激激发发单单重重态态的的激激发发，不不涉涉及及电电子子自自旋旋方方向向的的改改变变而而容容易易发发生生，属属于于允允许许跃跃迁迁；而而到到激激发发三三重重态态属属于于禁禁阻阻跃迁跃迁11S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量 2 1 4外转换 3 3T2内转换振动弛豫12激发态激发态基态的能量传递途径基态的能量传递途径 电电子子处处于于激激发发态态是是不不稳稳定定状状态态，返返回回基基态态时时，通通过过辐辐射射跃迁跃迁(发光发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；和

8、无辐射跃迁等方式失去能量；荧光延迟荧光磷光辐射跃迁辐射跃迁无辐射跃迁无辐射跃迁传递途径传递途径内转移外转移系间跨越振动弛豫荧光荧光：10-710-9s，第一激发第一激发单重态单重态的最低振动能级的最低振动能级基态基态磷光磷光：10-410s；第一激发第一激发三重态三重态的最低振动能级的最低振动能级基态基态13辐射和非辐射能量传递过程辐射和非辐射能量传递过程振动弛豫振动弛豫：同一电子能级中，以：同一电子能级中，以热能量交换形式由高振动能热能量交换形式由高振动能层至低相邻振动能层间的跃迁层至低相邻振动能层间的跃迁。发生振动弛豫的时间。发生振动弛豫的时间1010-12-12s s内转换：内转换：相同

9、多重态的电子能级间的相同多重态的电子能级间的等能级的无辐射跃迁等能级的无辐射跃迁。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。发生内转换的时间发单重态的最低振动能级。发生内转换的时间10-13s。荧光发射：荧光发射：电子由电子由第一激发单重态的最低振动能层第一激发单重态的最低振动能层基态基态(荧光多为荧光多为S1S0跃迁跃迁)，发射波长为发射波长为 3的荧光，的荧光，10-710-9s。发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长：发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长：3 2 1；14系间跨越：系间跨越：激发态的电

10、子发生自旋反转而使分子的多重性发激发态的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的生变化的非辐射跃迁非辐射跃迁。禁阻跃迁，但当能层有较大重叠时禁阻跃迁，但当能层有较大重叠时S1T1就可发生系间就可发生系间跨越，通过自旋跨越，通过自旋轨道耦合进行。轨道耦合进行。10-6s外转换：外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质分子之间碰撞引起的激发态分子与溶剂或其他溶质分子之间碰撞引起的转移能量的转移能量的非辐射跃迁非辐射跃迁。常发生在。常发生在S1或或T1S0外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。磷光发射：磷光发射：电子电子由第一激发三重态的最低振动能级由第一激发三重态的最低振动能级

11、基态基态(T1S0跃迁跃迁)；发光速度很发光速度很慢慢：10-4100s、磷光的磷光的能量比荧光小能量比荧光小电子由电子由S0进入进入T1的过程：（的过程：（S0T1禁阻跃迁）禁阻跃迁）S0激发激发振动弛豫振动弛豫内转移内转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫T1光照停止后，可持续一段时间光照停止后，可持续一段时间152.荧光的激发光谱与荧光光谱荧光的激发光谱与荧光光谱excitationspectrumandfluorescencespectrum（1 1）荧光的激发光谱）荧光的激发光谱 激发光谱：激发光谱：表示表示不同激发波长不同激发波长下所引起物质下所引起物质发射某一波长荧光发射某一波长荧

12、光的的相对效率。相对效率。绘制激发光谱：绘制激发光谱：固定发射波长固定发射波长(选选最最大大发发射射波波长长),),然然后后以以不不同同波波长长的的入入射射光光激激发发荧荧光光物物质质，以以荧荧光光强强度度F对对激发波长激发波长 作图作图，即为激发光谱。，即为激发光谱。荧光分子都具有两个特征光谱：荧光分子都具有两个特征光谱：激发光谱激发光谱和和发射光谱（荧光光发射光谱（荧光光谱）谱）。16激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大，称为度最大，称为最大激发波长最大激发波长 ex（2）荧光的发射光谱（荧光光谱）荧光的发射光谱（荧光光

13、谱）荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。绘制发射光谱时，度。绘制发射光谱时，使激发光波长使激发光波长固定在固定在 ex处处，然后对发，然后对发射光谱扫描，测定各种波长下相应的荧光强度，射光谱扫描，测定各种波长下相应的荧光强度，以以荧光强度荧光强度F 对发射波长对发射波长 作图作图，得发射光谱图（即荧光光谱）。，得发射光谱图（即荧光光谱）。发射光谱（荧光光谱）的位置？发射光谱（荧光光谱）的位置？磷光光谱的位置？磷光光谱的位置？1718激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系a.Stokes位移位移荧荧光光光光谱谱总总是是位位

14、于于物物质质激激发发光光谱谱的的长长波波一一侧侧，即即荧荧光光波波长大于激发光波长的现象。长大于激发光波长的现象。激发光谱与发射光谱之间的波长差值激发光谱与发射光谱之间的波长差值：振动弛豫、外转换等无辐射跃迁损失了部分能量。振动弛豫、外转换等无辐射跃迁损失了部分能量。b.荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱的形状与激发波长无关电子可以跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量电子可以跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图如能级图 2、1)，产生不同吸收带，但荧光光谱却只有一，产生不同吸收带，但荧光光谱却只有一个发射态，如个发射态，如 3。为什么？为什么？19c c.镜像规则镜像规则

15、由于电子基态的振动能级分布与激发态相似，由于电子基态的振动能级分布与激发态相似，故通常故通常荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。荧光光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。各小峰波长各小峰波长递减值与递减值与振振动能级差动能级差有有关，各小峰关，各小峰的高度与的高度与跃跃迁几率迁几率有关。有关。20 基基态态上上的的各各振振动动能能级级分分布布与与第第一一激激发发态态上上的的各各振振动动能级分布类似能级分布类似；基基态态上上的的某某振振动动能能级级若若跃跃迁迁到到第第一一激激发发态态的的某某振振动动能能级的几率较大的话，级的几率较大的话，相反跃迁也如此相反跃迁也如此。21二、荧光的产生与分子结构的

16、关系二、荧光的产生与分子结构的关系relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure1.分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（荧光量子产率（）：）：物质的荧光量子产率范围一般是多少?如果一个分子将吸收的光子全部释放，则其量子产率为如果一个分子将吸收的光子全部释放，则其量子产率为100%100%。222.有机化合物的分子结构与荧光的关系有机化合物的分子结构与荧光的关系（1）跃迁类型：*的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利

17、于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（4）取代基效应：芳环上有供电子基，使荧光增强。（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。2324三、影响荧光强度的因素三、影响荧光强度的因素relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure影响荧光强度的影响荧光强度的外部因素外部因素1.溶剂的影响溶剂的影响同一物质在不同溶剂中，其荧光光谱的形状和强度都有差别。同一物质在不同溶剂中，其荧光光谱的形状和强度都有差别。一般情况下，荧光波长随着溶

18、剂极性的增大而长移，荧光强度也有一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增大而长移，荧光强度也有所增强。这是因为在极性溶剂中，所增强。这是因为在极性溶剂中，*跃迁所需的能量差跃迁所需的能量差E小，小，而且跃迁几率增加，从而使紫外吸收波长和荧光波长均长移，强度而且跃迁几率增加，从而使紫外吸收波长和荧光波长均长移，强度也增强。也增强。溶剂溶剂粘度粘度减小时，可以增加分子间碰撞机会，使无辐射跃迁增减小时，可以增加分子间碰撞机会，使无辐射跃迁增加而荧光减弱。故荧光强度随溶剂粘度的减小而减弱。由于温度对加而荧光减弱。故荧光强度随溶剂粘度的减小而减弱。由于温度对溶剂的粘度有影响，一般是温度上升，溶剂粘度变小，因

19、此温度上溶剂的粘度有影响，一般是温度上升，溶剂粘度变小，因此温度上升，荧光强度下降。升，荧光强度下降。252.温度的影响温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，分子运动速度加快，荧光强度对温度变化敏感，温度增加，分子运动速度加快，分子间碰撞的几率增加，外转换去活的几率增加，荧光效率分子间碰撞的几率增加，外转换去活的几率增加，荧光效率降低。例如荧光素钠的乙醇溶液，在降低。例如荧光素钠的乙醇溶液，在0以下，温度每降低以下，温度每降低10，f增加增加3，在，在 80时，时，f为为1。26当荧光物质本身是当荧光物质本身是弱酸或弱碱弱酸或弱碱时，溶液的时，溶液的pH值对该荧光物质的值对该荧光物质的荧

20、光强度有较大影响，这主要是因为在不同酸度中分子和离子间的荧光强度有较大影响，这主要是因为在不同酸度中分子和离子间的平衡改变，离子结构发生变化，因此荧光强度也有差异。每一种荧平衡改变，离子结构发生变化，因此荧光强度也有差异。每一种荧光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式，也就是有它最适宜的光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式，也就是有它最适宜的pH值范围。例如苯胺在不同值范围。例如苯胺在不同pH值下有下列平衡关系：值下有下列平衡关系：苯胺在苯胺在pH712的溶液中主要以分子形式存在，由于的溶液中主要以分子形式存在，由于 NH2为为提高荧提高荧光效率光效率的取代基，故苯胺分子会发生蓝色荧光。但在

21、的取代基，故苯胺分子会发生蓝色荧光。但在pH2和和pH13的溶液中均以苯胺离子形式存在，故不能发射荧光。的溶液中均以苯胺离子形式存在，故不能发射荧光。3.溶液溶液pH 对酸碱化合物，溶液对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；的影响较大，需要严格控制；274.内滤光作用和自吸现象内滤光作用和自吸现象 自吸现象自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发 射的荧光，

22、如色胺酸中的重铬酸钾；射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；285.荧光熄灭剂荧光熄灭剂荧荧光光熄熄灭灭是是指指荧荧光光物物质质分分子子与与溶溶剂剂分分子子或或溶溶质质分分子子相相互互作作用用引引起起荧荧光光强强度度降降低低的的现现象象。引引起起荧荧光光熄熄灭灭的的物物质质称称为为荧荧光光熄熄灭灭剂剂(quenchingmedium)。如如卤卤素素离离子子、重重金金属属离离子子、氧氧分分子子以以及及硝硝基基化化合合物物、重重氮氮化化合合物物、羰羰基基和和羧羧基基化化合合物物均均为常见的荧光熄灭剂。为常见的荧光熄灭剂。296、散射光、散射光 小部分光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生小部分光子和

23、物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射。改变而向不同角度散射。瑞利光：瑞利光：光子和物质发生弹性碰撞，不发生能量交换，只光子和物质发生弹性碰撞，不发生能量交换，只是光子运动方向发生改变。其波长与入射光波长相同。是光子运动方向发生改变。其波长与入射光波长相同。拉曼光：拉曼光：光子和物质发生弹性碰撞，发生能量交换，光子光子和物质发生弹性碰撞，发生能量交换，光子把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量。从把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量。从而发射出比入射光稍长或稍短的光。而发射出比入射光稍长或稍短的光。散射光对荧光测定有干扰，散射光对荧光测定有干扰，尤其是波

24、长比入射光波长更长尤其是波长比入射光波长更长的拉曼光的拉曼光，与荧光波长接近，对测定的干扰大，必须采取，与荧光波长接近，对测定的干扰大，必须采取措施消除。措施消除。拉曼光的干扰主要来拉曼光的干扰主要来自溶剂自溶剂，当溶剂的拉曼光，当溶剂的拉曼光与被测物质的荧光光谱相重叠时，应更换溶剂或改变激发与被测物质的荧光光谱相重叠时，应更换溶剂或改变激发光波长光波长30选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰a:320nm或350nm为激发光，荧光峰总是在448nm。b:将空白溶剂分别在320nm及350nm激发光照射下测定荧光，激发光波长为320nm时，拉曼光波长是360

25、nm，360nm的拉曼光对荧光无影响；当激发光波长为350nm时，拉曼光波长是400nm，400nm的拉曼光对荧光有干扰，因而影响测定结果。硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱31四、荧光试剂四、荧光试剂 荧光试剂荧光试剂是一种可以使非荧光物质或弱荧光物质与其反是一种可以使非荧光物质或弱荧光物质与其反应之后，得到强荧光性产物的标记物，从而可扩大荧光分析应之后，得到强荧光性产物的标记物，从而可扩大荧光分析法的使用范围法的使用范围1.1.有机化合物的荧光分析有机化合物的荧光分析 脂脂肪肪族族化化合合物物能能产产生生荧荧光光的的为为数数不不多多。芳芳香香族

26、族及及具具有有芳芳香香结结构构的的化化合合物物，因因存存在在共共轭轭体体系系而而容容易易吸吸收收光光能能，在在紫紫外外光光照照射射下下很很多多能能发发射射荧荧光光。有有时时为为了了提提高高测测定定的的灵灵敏敏度度和和选选择择性性，常常使使弱弱荧荧光光性性物物质质与与某某些些荧荧光光试试剂剂作作用用，以以得得到到强强荧荧光光性性产产物物(衍生化衍生化)。因此，荧光分析法在有机物测定方面的应用很广。因此，荧光分析法在有机物测定方面的应用很广。32能能用用荧荧光光分分析析法法测测定定的的有有机机物物包包括括多多环环胺胺类类、萘萘酚酚类类、嘌嘌呤呤类类、吲吲哚哚类类、多多环环芳芳烃烃类类、具具有有芳芳

27、环环或或芳芳杂杂环环结结构构的的氨氨基基酸酸类类及及蛋蛋白白质质等等；药药物物中中的的生生物物碱碱类类如如麦麦角角碱碱、蛇蛇根根碱碱、麻麻黄黄碱碱、吗吗啡啡、喹喹啉啉类类及及异异喹喹啉啉类类生生物物碱碱等等；甾甾体体类类如如皮皮质质激激素素及及雌雌醇醇等等；抗抗生生素素类类如如青青霉霉素素、四四环环素素等等；维维生生素素类类如如维维生生素素A、B1、B2、B6、B12、E、抗抗坏坏血血酸酸、叶叶酸酸及及烟烟酰酰胺胺等等。此此外外，中中草草药药中中的的许许多多有有效效成成分分，不不少少是是属属于于芳芳香香性性结结构构的的大大分分子子杂杂环环类类，都都能能产产生生荧荧光光，可可用用荧荧光光分分析析

28、法法作作初初步步鉴鉴别别及及含含量量测测定定。荧荧光光分分析析法法的的灵灵敏敏度度高高，选选择择性性较较好好，取取样样量量少少，方方法法快快速速，已已成成为为医医药药学学、生生物物学学、农农业业和和工工业业等等领领域域进行科学研究工作的重要手段之一。以下是几个重要的荧光试剂：进行科学研究工作的重要手段之一。以下是几个重要的荧光试剂：331荧荧光光胺胺(fluorescamine)：能能与与脂脂肪肪族族或或芳芳香香族族伯伯胺胺类类形形成成高高度度荧光衍生物，典型反应如下：荧光衍生物，典型反应如下：荧荧光光胺胺及及其其水水解解产产物物不不显显荧荧光光。100mg荧荧光光胺胺溶溶于于100ml无无水

29、水丙丙酮酮中中，放放置置24小小时时后后即即可可使使用用。取取相相当当于于10mg药药物物的的甲甲醇醇或或水水溶溶液液0.lml，加加适适宜宜pH值值的的磷磷酸酸缓缓冲冲溶溶液液5ml，加加荧荧光光胺胺试试剂剂0.lml，混混合合，放放置置15分分钟钟后后测测定定荧荧光光强强度度。荧荧光光条条件件为为：ex=275、390nm，em=480nm。342邻苯二甲醛邻苯二甲醛(OPA)在在2 巯巯基基乙乙醇醇存存在在下下，pH910的的缓缓冲冲溶溶液液中中OPA能能与与伯伯胺胺类类、特特别别是是除除半半胱胱氨氨酸酸、脯脯氨氨酸酸及及羟羟脯脯氨氨酸酸外外的的a 氨氨基基酸酸生生成成灵灵敏敏的的荧荧光

30、光产产物物。取取OPA500mg溶溶于于10ml乙乙醇醇中中，加加200ml2 巯巯基基乙乙醇醇，将将此此混混合合液液加加至至1L3的的硼硼酸酸溶溶液液中中，再再用用KOH调调节节至至pH10，即即为为常常用用试试剂剂溶溶液。荧光条件为：液。荧光条件为：ex=340nm，em=455nm。3531 二甲氨基二甲氨基 5 氯化磺酰萘氯化磺酰萘(Dansyl-Cl，丹酰氯丹酰氯)能能与与伯伯胺胺、仲仲胺胺及及酚酚基基的的生生物物碱碱类类反反应应生生成成荧荧光光性性产产物物。取取50mg或或100mg试试剂剂，溶溶解解于于500ml无无水水丙丙酮酮中中即即可可使使用用。与与丹丹酰酰氯氯类类似似的的一

31、一个个试试剂剂是是丹丹酰酰肼肼(DansylNHNH2)，它它能能与与可可的的松松的的羰羰基基缩缩合合，产产生生强强烈烈荧荧光光。荧荧光光条条件件为为：ex=365nm，em=500nm左右。左右。丹丹酰酰氯氯试试剂剂不不稳稳定定，其其水水解解产产物物Dansyl OH呈呈蓝蓝色色荧荧光光，必须必须暗处保存暗处保存，每周重，每周重新配新配制。制。362.2.生物与有机化合物的分析生物与有机化合物的分析37 无机离子一般不显荧光，与有机试剂形成有荧光的配无机离子一般不显荧光，与有机试剂形成有荧光的配合物后，可测量约合物后，可测量约6060种元素及离子种元素及离子 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土铍、

32、铝、硼、镓、硒、镁、稀土采用荧光分析法采用荧光分析法 氟、硫、铁、银、钴、镍氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定采用荧光熄灭法测定 铜、铁、钴、锇及过氧化氢铜、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定采用催化荧光法测定 铬、铌、铀、碲铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定采用低温荧光法测定 铈、铕、锑、钒、铀铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定采用固体荧光法测定2.无机化合物的分析无机化合物的分析38第二节第二节 荧光定量分析方法荧光定量分析方法一、荧光强度与物质浓度的关系一、荧光强度与物质浓度的关系当一束强度为当一束强度为I0的紫外的紫外/可见光照射一浓度为可见光照射一浓度为c、液层液层厚度为厚

33、度为d的液槽时，可在溶液的的液槽时，可在溶液的各个方向各个方向观察到荧光，其观察到荧光，其 由于能产生荧光的物质占被分析物的数量相当有限，由于能产生荧光的物质占被分析物的数量相当有限，且就这少量的荧光物质几乎在同一波长段产生光致发光，且就这少量的荧光物质几乎在同一波长段产生光致发光，所以荧光法所以荧光法很少用来定性分析很少用来定性分析 吸收光强度为吸收光强度为Ia透过光强度为透过光强度为It荧光强度为荧光强度为FI0It IaF垂直方向垂直方向39（=I0-It）荧光强度正比于被荧光物质吸收的光强度荧光强度正比于被荧光物质吸收的光强度IaF=K(I0It)K K：取决于荧光效率取决于荧光效率

34、f f根据根据BeerLaw=10-clItI0F=K(I0-I0 10-c l)=KI0(1-10-c l)=KI0(1-e2.303 c l)由于由于ex=1+x+x2/2!+x3/3!+xn/n!所以所以e-2.3 c l=1-2.3 cl+(-2.3 cl)2/2!+(-2.3 cl)3/3!+e-2.3 c l=1-2.3 cl40e-2.3 cl=1-2.3 cl 代入代入F=KI0(1-e2.303 cl)F=KI0(1-1+2.3 c l)=2.3K I0 l c 当荧光效率当荧光效率 f f、入射光强度、入射光强度I0、物质的摩尔吸收系数物质的摩尔吸收系数、液层厚度液层厚度b

35、 均固定不变时，均固定不变时，荧光强度正比于该溶液的浓度荧光强度正比于该溶液的浓度F=K c 荧光定量分荧光定量分析的依据析的依据荧光强度可以在很弱的背景下被检测，荧光强度可以在很弱的背景下被检测，这完全取决于检测器的灵敏度，也是荧光分这完全取决于检测器的灵敏度，也是荧光分析方法灵敏度高的原因析方法灵敏度高的原因41二、定量分析方法二、定量分析方法1.1.标准曲线法标准曲线法 配配制制一一系系列列标标准准浓浓度度试试样样，测测定定荧荧光光强强度度，绘绘制制F-c的的标标准准校校正正曲曲线线，再再在在相相同同条条件件下下测测量量未未知知试试样样的的荧荧光光强强度度，在在标准曲线上求出试样的浓度标

36、准曲线上求出试样的浓度2.比较法比较法在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较之在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较之空白调空白调0，标品调，标品调100%或或50%42第三节第三节 荧光分光光度计荧光分光光度计四个部分四个部分激发光源、样品池、双单色器系统、检测器激发光源、样品池、双单色器系统、检测器特殊点特殊点有有两个单色器两个单色器，光源与检测器通常成，光源与检测器通常成直角直角单单色色器器：选选择择激激发发光光波波长长的的第第一一单单色色器器和和选选择择发发射射光光(测测量量)波长的第二单色器波长的第二单色器光光源源：氙氙灯灯、高高压压汞汞灯灯、激激光器光器(可见与紫外区可

37、见与紫外区)检测器检测器：光电倍增管光电倍增管43荧光光谱（荧光光谱（fluorecencespectrum）：）：固定激发光固定激发光波长为最大激发波长波长为最大激发波长，而让荧光物质发射的荧，而让荧光物质发射的荧光通过发射单色器分光扫描并检测不同波长下光通过发射单色器分光扫描并检测不同波长下的荧光强度，以发射波长为横坐标，荧光强度的荧光强度，以发射波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，得到物质的荧光光谱。为纵坐标作图，得到物质的荧光光谱。荧光物质的最大激发波长（荧光物质的最大激发波长（ex）和最大发）和最大发射波长射波长（em）是鉴定物质的根据；也是定量是鉴定物质的根据；也是定量测定最为灵敏

38、的条件。测定最为灵敏的条件。4445荧光光谱的普遍特性荧光光谱的普遍特性1.斯托克斯位移斯托克斯位移(Stokesshift):激发光谱与发射光谱之间的波长差值激发光谱与发射光谱之间的波长差值；荧光发；荧光发射波长总是大于激发光谱波长。射波长总是大于激发光谱波长。室温下菲的乙醇溶液荧光光谱室温下菲的乙醇溶液荧光光谱462.荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，从而荧光重态的最低振动能

39、级再跃迁回到基态，从而荧光发射光谱只有一个发射带，而且荧光光谱的形状发射光谱只有一个发射带，而且荧光光谱的形状与激发波长无关。与激发波长无关。3.荧光光谱与激发光谱的镜像关系荧光光谱与激发光谱的镜像关系荧光光谱的普遍特性荧光光谱的普遍特性激发光谱与荧光光谱成对称镜像关系。激发光谱与荧光光谱成对称镜像关系。47nm200280360440520020406080100Fab4b3b2b1b0c0c1c2c3c4蒽的激发光谱（虚线）蒽的激发光谱（虚线）荧光光谱（实线）荧光光谱（实线）蒽的能级跃迁蒽的能级跃迁V=0V=1V=2V=3V=4V=0V=1V=2V=3V=4b4b3b2b1b0c0c1c2

40、c3c4E4E3E2E1E4E3E2E148二、荧光与分子结构二、荧光与分子结构（一）荧光寿命和荧光效率（一）荧光寿命和荧光效率荧光寿命荧光寿命(fluorescencelifttime)：当除去激发光当除去激发光源后，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的源后，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间，用所需的时间，用表示。表示。以以对对t t作图，斜率即为作图，斜率即为49荧光效率荧光效率（fluorescenceefficiency):指激发态分指激发态分子发射荧光的分子数与基态分子吸收激发光子发射荧光的分子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，常用的光子数之比，常用表示。表示。荧光

41、效率与物质的分子结构和所处的化学环境荧光效率与物质的分子结构和所处的化学环境条件有关。条件有关。50（二）有机化合物分子结构与荧光的关系（二）有机化合物分子结构与荧光的关系物质产生荧光必须具备的条件：物质产生荧光必须具备的条件：（1）物质的）物质的分子必须具有能够吸收紫外和较短分子必须具有能够吸收紫外和较短波长可见光的结构波长可见光的结构（2）物质）物质必须具有较大的荧光效率必须具有较大的荧光效率511.1.长共轭结构（芳香族化合物）长共轭结构（芳香族化合物）共轭度越大，荧光效率越大，荧光波长长移共轭度越大，荧光效率越大，荧光波长长移205nm278nm286nm321nm356nm404nm

42、0.110.290.36522.2.分子的刚性分子的刚性分子刚性越强，分子振动少，与其它分子碰分子刚性越强，分子振动少，与其它分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高，荧撞失活的机率下降，荧光量子效率提高，荧光长移。光长移。533.3.取代基取代基给电子基团使荧光增强；荧光波长长移。给电子基团使荧光增强；荧光波长长移。吸电子基团会减弱甚至破坏荧光。吸电子基团会减弱甚至破坏荧光。同同 电子体系相互作用小的取代基对荧光影响电子体系相互作用小的取代基对荧光影响不明显。不明显。54（三）荧光试剂（三）荧光试剂1.1.荧光胺荧光胺2.2.邻苯二甲醛邻苯二甲醛(OPA)3.1-3.1-二甲氨基二甲氨基5

43、5氯化磺酰萘氯化磺酰萘4.4.测定无机离子的荧光试剂测定无机离子的荧光试剂55三、影响荧光强度的外部因素三、影响荧光强度的外部因素温度增加，荧光效率和荧光强度下降。温度增加，荧光效率和荧光强度下降。1.温度温度2.溶剂溶剂随着溶剂的极性的增加，荧光物质的随着溶剂的极性的增加，荧光物质的随着溶剂的极性的增加，荧光物质的随着溶剂的极性的增加，荧光物质的*跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也跃迁几率增加，荧光强度将增强，荧光波长也发生红移；溶剂粘度降低，荧光强度降低。发生红移；溶剂粘度降低，荧光强度降低。563.酸度酸度具酸或碱性基团的荧光物质，在不同具酸或碱性基团的荧光物质，在不同具酸或碱性基

44、团的荧光物质，在不同具酸或碱性基团的荧光物质，在不同pHpH值时，其值时，其值时，其值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变。结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变。结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变。结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变。NH3+OH-H+NH2NH-OH-H+利用金属离子与有机试剂生成配合物进行测定金利用金属离子与有机试剂生成配合物进行测定金利用金属离子与有机试剂生成配合物进行测定金利用金属离子与有机试剂生成配合物进行测定金属离子时，配合物的稳定性和组成受溶液属离子时，配合物的稳定性和组成受溶液属离子时，配合物的稳定性和组成受溶液属离子时，配合物的稳定性

45、和组成受溶液pHpH值影响值影响值影响值影响较大，从而影响到它们的荧光性质。较大，从而影响到它们的荧光性质。较大，从而影响到它们的荧光性质。较大，从而影响到它们的荧光性质。pH34GaGa3+3+邻二羟基偶氮苯邻二羟基偶氮苯邻二羟基偶氮苯邻二羟基偶氮苯1:11:11:11:1配合物配合物配合物配合物(产生荧光产生荧光产生荧光产生荧光)pH67GaGa3+3+邻二羟基偶氮苯邻二羟基偶氮苯邻二羟基偶氮苯邻二羟基偶氮苯1:21:21:21:2配合物配合物配合物配合物(不产生荧光不产生荧光不产生荧光不产生荧光)蓝色荧光蓝色荧光蓝色荧光蓝色荧光无荧光无荧光无荧光无荧光无荧光无荧光无荧光无荧光57荧光猝灭

46、：荧光猝灭：荧光物质分子与溶剂分子或其他荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。象称为荧光猝灭。荧光熄灭剂：荧光熄灭剂：能引起荧光强度降低的物质。能引起荧光强度降低的物质。4.荧光熄灭剂荧光熄灭剂碰撞猝灭碰撞猝灭 M+hvM*,M*+QM+热热静态猝灭静态猝灭 M+QMQ 非荧光物非荧光物质质转入三重态的猝灭转入三重态的猝灭 三重态三重态荧光物质的自猝灭荧光物质的自猝灭 荧光物质浓度较高荧光物质浓度较高导致荧光熄灭的原因：导致荧光熄灭的原因：58荧光熄灭法荧光熄灭法:荧光物质加入某些猝灭剂后，其荧荧光物质加入某些猝

47、灭剂后，其荧光强度的减少与荧光猝灭剂的浓度呈线性关系，光强度的减少与荧光猝灭剂的浓度呈线性关系，可用于测定猝灭剂的含量，这种方法称为荧光熄可用于测定猝灭剂的含量，这种方法称为荧光熄灭法。灭法。5.5.散射光散射光瑞利光：瑞利光：光子与物质分子发生弹性碰撞，不发生光子与物质分子发生弹性碰撞，不发生能量交换，运动方向改变；能量交换，运动方向改变；瑞利光瑞利光入射光入射光拉曼光：拉曼光：光子与物质分子发生非弹性碰撞，发生光子与物质分子发生非弹性碰撞，发生能量交换，运动方向改变；能量交换，运动方向改变；拉曼光拉曼光入射光入射光59320360448激发激发 320nm硫酸奎宁硫酸奎宁350448激发激

48、发 350nm硫酸奎宁硫酸奎宁320360激发激发 320nm0.1mol/L硫酸硫酸350400激发激发 350nm0.1mol/L硫酸硫酸a.强度强度b.强度强度硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光（硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光（a）与拉曼光谱（）与拉曼光谱（b）60溶剂溶剂激发光激发光(nm)248 313 365 405 436水水乙乙 醇醇环己烷环己烷CCl4CHCl3271 350 416 469 511267 344 409 459 500267 344 408 458 499 320 375 418 450 346 410 461 502在不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长在不同

49、波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长(nm)61第二节第二节 荧光定量分析方法荧光定量分析方法一、荧光强度与物质浓度的关系一、荧光强度与物质浓度的关系I0IF62(荧光定量分析法的依据荧光定量分析法的依据)结论：结论：荧光强度和溶液浓度呈线性关系，只限荧光强度和溶液浓度呈线性关系，只限于极稀的溶液于极稀的溶液(A0.05(A0.05)。对于较浓溶液，会产生。对于较浓溶液，会产生自熄灭现象。自熄灭现象。63二、定量分析方法二、定量分析方法 优点优点 1.灵敏度高灵敏度高 比紫外比紫外-可见分光光度法高可见分光光度法高24个数量级；个数量级；检测下限：检测下限：0.10.001 g/mL 2.选择性强

50、选择性强 既可依据发射光谱特征，又可根据激发光谱特征；既可依据发射光谱特征，又可根据激发光谱特征；3.试样量少和方法简单试样量少和方法简单 缺点缺点应用范围小应用范围小641.1.校正曲线法校正曲线法CF校正曲线校正曲线CXFX步骤：步骤：1.1.配制不同浓度的标准配制不同浓度的标准溶液溶液2.2.做做F FC C关系曲线关系曲线3.3.求得浓度求得浓度注意：固定仪器和测定条件；注意：固定仪器和测定条件；试样浓度在线性范围内试样浓度在线性范围内652.2.比例法比例法注意：样品与标样溶液浓度接近，在线性范围内注意：样品与标样溶液浓度接近，在线性范围内步骤：步骤：1.1.配制标准溶液和试样溶液配