抗体制备技术.ppt

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1、 抗体制备技术抗体制备技术1、多克隆抗体（、多克隆抗体（polyclonal antibody,pAb）：用）：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物。混合物。2、单克隆抗体（、单克隆抗体（monoclonal antibodies,mAb）：）：由一个识别一种抗原表位的由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同细胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少

2、或无源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。交叉反应性。Ab1Ab3Ab4单克隆抗体单克隆抗体抗原抗原Ab1抗血清抗血清Ab1Ab2Ab3Ab4Ab2Ab3Ab4普通抗血清（多克隆抗体）普通抗血清（多克隆抗体）脾脾B细细胞胞骨髓瘤小鼠骨髓瘤小鼠取腹水取腹水骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞HAT培养，培养，稀释稀释单单克克隆隆抗抗体体和和多多克克隆隆抗抗体体产产生生区区别别示示意意图图杂交瘤细胞杂交瘤细胞+PEG,融合融合Ab2 抗体制备技术抗体制备技术l一、多克隆抗体制备一、多克隆抗体制备l（一）免疫原的制备（一）免疫原的制备l（二）免疫动物（二）免疫动物l（三）免疫血清的纯化（三）免疫血清

3、的纯化l（四）免疫血清的鉴定（四）免疫血清的鉴定l（五）免疫血清的（五）免疫血清的l二、单克隆抗体制备二、单克隆抗体制备l（一）单克隆抗体制备原理（一）单克隆抗体制备原理 抗体制备技术抗体制备技术l（二）单克隆抗体制备的技术要点（二）单克隆抗体制备的技术要点l（三）影响杂交瘤技术的因素（三）影响杂交瘤技术的因素l（四）单克隆抗体的应用（四）单克隆抗体的应用l三、基因工程抗体技术三、基因工程抗体技术l（一）人源化抗体（一）人源化抗体l（二）小分子抗体（二）小分子抗体l（三）双特异性抗体（三）双特异性抗体l（四）抗体库技术（四）抗体库技术一、多克隆抗体制备一、多克隆抗体制备（一）免疫原的制备（一）

4、免疫原的制备免疫原（免疫原（immunogen）指能刺激机体免疫系）指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最重要的性质是免疫原性（重要的性质是免疫原性（immunogenicity）免疫原免疫原天然抗原、人工或合成抗原；天然抗原、人工或合成抗原；蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原；蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原；具体制备具体制备细胞性抗原、可溶性抗原、半抗细胞性抗原、可溶性抗原、半抗 原性抗原和免疫佐剂原性抗原和免疫佐剂 1、细胞性抗原制备：、细胞性抗原制备：绵羊红细胞（绵羊红细胞（SRBC）-溶血素；溶血素；细菌细菌-抗菌抗体（动物免疫血清）抗菌

5、抗体（动物免疫血清）2、可溶性抗原制备：、可溶性抗原制备：指蛋白质、多糖和脂类等。作为免疫原需指蛋白质、多糖和脂类等。作为免疫原需要由细胞的破碎、提取与纯化要由细胞的破碎、提取与纯化l1）细胞的破碎（物理法、化学法）细胞的破碎（物理法、化学法）l2）提取与纯化：）提取与纯化：超速离心分离超速离心分离是一种根据分离物质的比是一种根据分离物质的比重特点，通过差速或梯度密度离心，将分重特点，通过差速或梯度密度离心，将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法，只适子大小不同的抗原颗粒分开的方法，只适宜少数大分子物质的分离。宜少数大分子物质的分离。选择性沉淀选择性沉淀选择某抗原理化特性，采用选择某抗原理化特性，

6、采用相应沉淀剂或溶液环境例相应沉淀剂或溶液环境例50%50%饱和硫酸铵饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出学清球蛋；盐溶液可沉淀析出学清球蛋；8%8%12%PEG12%PEG 6000 6000可沉淀可沉淀IgGIgG。l 盐析法沉淀抗原的机理盐析法沉淀抗原的机理 超滤法超滤法利用孔径大小不同的特制薄膜对利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小的抗原物质进行滤筛不同分子大小的抗原物质进行滤筛层析法层析法包括凝胶过滤、离子交换、亲和包括凝胶过滤、离子交换、亲和层析等，用于抗原等物质的精提层析等，用于抗原等物质的精提电泳电泳（略）（略）3）鉴定：）鉴定：鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、鉴定纯化蛋白的含量

7、、相对分子的质量、纯度以及免疫学活性。纯度以及免疫学活性。凝胶过滤层析凝胶过滤层析(分子筛分子筛)的作用机理的作用机理 亲和层析的作用机理亲和层析的作用机理3）鉴定：）鉴定：鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、纯度以及免疫学活性。纯度以及免疫学活性。l蛋白的含量蛋白的含量定氮（紫外光定氮（紫外光280nm等）等）l分子的质量分子的质量电泳、质谱电泳、质谱l蛋白的纯度蛋白的纯度电泳、高效液相层析电泳、高效液相层析l免疫学活性免疫学活性免疫双扩散、免疫印迹免疫双扩散、免疫印迹 抗原性质分析结果抗原性质分析结果50 00075 000100 000 1 2 3 4

8、 5 Westernblot鉴定三株单抗的特异性鉴定三株单抗的特异性1.分分子子量量标标准准；2.阴阴性性对对照照:正正常常小小鼠鼠血血清清；3.纯纯化化后后的的B6与与病病毒毒上上清清反反应应；4.纯纯化化后后的的G12与与病病毒毒上上清清反反应应；5.纯纯化化后后的的2B12与病毒上清反应。与病毒上清反应。l3、半抗原性免疫原的制备、半抗原性免疫原的制备 半抗原（半抗原（hapten）蛋白质等载体（蛋白质等载体（carrier）连接连接物理法：即利用电荷和微孔吸附物理法：即利用电荷和微孔吸附 半抗原半抗原 化学法：利用某些功能基团把半化学法：利用某些功能基团把半 抗原连接到载体分子上抗原连

9、接到载体分子上l4、免疫佐剂（、免疫佐剂（immunoadjuvant），佐剂），佐剂 指某些物质，因为该类物质与抗原物质一指某些物质，因为该类物质与抗原物质一起或先于注入机体，可增强机体对该抗原起或先于注入机体，可增强机体对该抗原物质的特异性免疫应答或改变免疫应答类物质的特异性免疫应答或改变免疫应答类型。型。种类种类无机、生物性、人工合成、油剂和无机、生物性、人工合成、油剂和 纳米颗粒。纳米颗粒。用途用途抗原表面积增，构型改变；延长抗抗原表面积增，构型改变；延长抗 原的滞留时间；增强吞噬原的滞留时间；增强吞噬（二）免疫动物（二）免疫动物l1、免疫动物的选择：、免疫动物的选择：抗原来源与动物种

10、属的关系（越近越差）抗原来源与动物种属的关系（越近越差）动物个体的选择（年龄、体重与健康，）动物个体的选择（年龄、体重与健康，）抗原性质与动物种类抗原性质与动物种类l2、免疫的方法：、免疫的方法：免疫原的剂量免疫原的剂量 免疫的途径与其间隔时间免疫的途径与其间隔时间 免疫动物采血免疫动物采血（对实验成功与否至关重要）（对实验成功与否至关重要）（三）免疫血清的纯化（三）免疫血清的纯化l1、特异性抗体的纯化、特异性抗体的纯化l1）亲和层析）亲和层析l2）吸附）吸附l2、IgG类抗体的纯化类抗体的纯化l1）盐析）盐析l2）凝胶过滤）凝胶过滤l3）离子交换）离子交换l4）亲和层析）亲和层析 在凝胶过滤

11、柱（在凝胶过滤柱（sephadex G-200）上血清蛋白的层析示意）上血清蛋白的层析示意(M=IgM,G=IgG,A=IgA)在在DEAE-纤维素上人血清蛋白的层析纤维素上人血清蛋白的层析示意图示意图(M=IgM,G=IgG,A=IgA)亲和层析纯化亲和层析纯化IgG基本过程示意图基本过程示意图 (四四)免疫血清的鉴定免疫血清的鉴定1、抗体效价的测定（凝集、扩散、抗体效价的测定（凝集、扩散、ELISA）2、特异性的鉴定（免疫印迹、双扩散）、特异性的鉴定（免疫印迹、双扩散）3、纯度的鉴定（、纯度的鉴定（SDS-PEAG）4、亲和力的鉴定、亲和力的鉴定affnity指抗体与抗原结合指抗体与抗原结

12、合 的牢固程度，以亲和常数表示。的牢固程度，以亲和常数表示。测定方法有平衡透析、测定方法有平衡透析、ELISA、竞争（非、竞争（非 竞争）结合等。竞争）结合等。l单抗亲合常数的测定单抗亲合常数的测定：l单抗亲合常数测定采用非竞争酶免疫试验法：单抗亲合常数测定采用非竞争酶免疫试验法：l1）先确定在某一抗原浓度时抗体可以达到饱和；）先确定在某一抗原浓度时抗体可以达到饱和；l2）以该抗原浓度为实验条件，饱和时的）以该抗原浓度为实验条件，饱和时的OD值作值作为为OD-100，找出，找出OD-50时的抗体浓度和相应的时的抗体浓度和相应的pp65抗原浓度；抗原浓度；l3)根据公式根据公式Ka=n-1 计算

13、计算McAb的的Ka值。值。l 2(nAbt-Ab t)lt代表测定时的温度；代表测定时的温度；ln=Abt/Abt；lAbt表示抗原浓度较高的表示抗原浓度较高的Amax的一半；的一半；lAbt表示抗原浓度较低的表示抗原浓度较低的Amax的一半。的一半。l对于单克隆抗体，一般亲合力要求对于单克隆抗体，一般亲合力要求107L/mol，好的单抗多大于好的单抗多大于109 L/mol。（五）免疫血清的保存（五）免疫血清的保存l1 1、44保存（保存（6 6个月）个月）l2 2、低温保存（、低温保存（-70 -70 -20 -20 ，5 5年）年）l3 3、真空干燥保存（、真空干燥保存（5 5 101

14、0年）年）注意点：保存前需经除菌注意点：保存前需经除菌 保存液含防腐剂保存液含防腐剂 避免反复冻融（分装）避免反复冻融（分装）二、单克隆抗体制备二、单克隆抗体制备l单克隆抗体（单克隆抗体（monoclone antibody，McAb）是由抗原致敏的）是由抗原致敏的B淋巴细胞和骨髓淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，经克隆化培瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，经克隆化培养后由一个细胞克隆所分泌的只识别单一养后由一个细胞克隆所分泌的只识别单一抗原决定簇的纯的抗体。抗原决定簇的纯的抗体。l其理化性状高度均一，生物活性单一，高其理化性状高度均一，生物活性单一，高度特异及高效价特性，用于临床实验室诊度特异

15、及高效价特性，用于临床实验室诊断与临床疾病治疗。断与临床疾病治疗。克隆选择学说的模式图克隆选择学说的模式图 单抗制备的流程图单抗制备的流程图（一）单克隆抗体制备的原理（一）单克隆抗体制备的原理l利用杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性利用杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性 即致敏即致敏B淋巴细胞分泌特异性抗体能力与骨髓瘤细胞具淋巴细胞分泌特异性抗体能力与骨髓瘤细胞具无限繁殖能力，从杂交瘤中经克隆化后成为单个无限繁殖能力，从杂交瘤中经克隆化后成为单个细胞克隆并分泌抗体，称为单克隆抗体。细胞克隆并分泌抗体，称为单克隆抗体。l制备过程制备过程致敏致敏B淋巴细胞（免疫动物）淋巴细胞（免疫动物）杂交细胞瘤制备

16、、筛选杂交细胞瘤制备、筛选 杂交瘤细胞分泌抗体的确认杂交瘤细胞分泌抗体的确认 分泌抗体的杂交瘤细胞克隆分泌抗体的杂交瘤细胞克隆 单克隆抗体的批量生产单克隆抗体的批量生产（二）单克隆抗体制备的技术要点（二）单克隆抗体制备的技术要点l1、免疫动物选择纯系、免疫动物选择纯系Balb/c小鼠小鼠l2、骨髓瘤细胞用以融合前应经过筛选、骨髓瘤细胞用以融合前应经过筛选l3、细胞融合、细胞融合l4、阳性克隆的筛选、阳性克隆的筛选l5、克隆化、克隆化l6、单克隆抗体的制备、单克隆抗体的制备l7、单克隆抗体的纯化和鉴定、单克隆抗体的纯化和鉴定l8、单克隆抗体的保存、单克隆抗体的保存（三）影响杂交瘤技术的因素（三）

17、影响杂交瘤技术的因素l1、试剂与器材、试剂与器材 用前必须经严格的筛选，尤其血清、融合剂用前必须经严格的筛选，尤其血清、融合剂l2、培养技术、培养技术 防止污染，细胞培养的娴熟技能防止污染，细胞培养的娴熟技能l3、早期克隆化、早期克隆化 避免无关细胞克隆的过度生长，但又应避免避免无关细胞克隆的过度生长，但又应避免 克隆细胞的丢失。克隆细胞的丢失。（四）单克隆抗体的应用（四）单克隆抗体的应用l1、医学检验诊断试剂、医学检验诊断试剂 利用单抗具有的特质利用单抗具有的特质-特异性与纯度高，理特异性与纯度高，理化性均一化性均一l2、蛋白质的提纯、蛋白质的提纯 将其作为亲和层析中的重要配体将其作为亲和层

18、析中的重要配体l3、肿瘤的导向治疗协助示踪、肿瘤的导向治疗协助示踪 三、基因工程抗体技术三、基因工程抗体技术l基因工程抗体（基因工程抗体（genetic engineering antibody）又称重组抗体，指应用）又称重组抗体，指应用DNA重重组及蛋白工程技术对编码抗体的基因按不组及蛋白工程技术对编码抗体的基因按不同需求进行改造和装配，经导入适宜的受同需求进行改造和装配，经导入适宜的受体细胞后重新表达的抗体。体细胞后重新表达的抗体。l包括包括：（一）人源化、小分子、双价特异：（一）人源化、小分子、双价特异 及抗体融合蛋白等。及抗体融合蛋白等。（二）抗体库技术（二）抗体库技术（一）人源化抗体

19、（一）人源化抗体（humanized antibody）l人源化抗体指将鼠源性单抗，通过基因克隆和人源化抗体指将鼠源性单抗，通过基因克隆和DNA重组及蛋白质工程学等技术，用人源氨基重组及蛋白质工程学等技术，用人源氨基酸序列取代鼠的使其保留亲本鼠单抗的亲和性酸序列取代鼠的使其保留亲本鼠单抗的亲和性与特异性，但降低鼠单抗的异源性利于人体内与特异性，但降低鼠单抗的异源性利于人体内使用。使用。l1、嵌合抗体（、嵌合抗体（chimeric antibody）l2、改形抗体（、改形抗体（reshaped antibody）（二）小分子抗体（二）小分子抗体l小分子抗体指相对分子质量比较小但具有小分子抗体指相

20、对分子质量比较小但具有抗原结合功能的分子片段。抗原结合功能的分子片段。l小分子抗体：抗原结合片段（小分子抗体：抗原结合片段（Fab）、可变）、可变 区片段（区片段（Fv）等）等l优点：分子小，通透性强优点：分子小，通透性强 原核细胞表达，成本低原核细胞表达，成本低 不含不含Fc段，不与带段，不与带Fc段受体反应段受体反应 半衰期短，利于及时清除半衰期短，利于及时清除 （三）双特异性抗体（三）双特异性抗体l双特异性抗体双特异性抗体(bispecific antibody)又称又称双功能抗体。他具有针对两个不同抗原位双功能抗体。他具有针对两个不同抗原位点结合的特性，可同时与两种不同抗原发点结合的特

21、性，可同时与两种不同抗原发生结合，不同于天然抗体。生结合，不同于天然抗体。l1、化学交联、化学交联l2、细胞工程、细胞工程l3、基因工程、基因工程（四）抗体库技术（四）抗体库技术l抗体库技术是指用细菌克隆代替抗体库技术是指用细菌克隆代替B细胞克隆细胞克隆来表达制备各种抗体（抗体谱）。来表达制备各种抗体（抗体谱）。噬噬菌菌体体展展示示(phage display)，即即用用分分子子克克隆隆的的方方法法将将外外源源基基因因片片段段插插入入噬噬菌菌体体壳壳蛋蛋白白的的非非必必需需区区，该该基基因因的的表表达达产产物物与与壳壳蛋蛋白白一一起起以以融融合合蛋蛋白白的的形形式式展展示示于于噬噬菌菌体体颗颗粒的表面。粒的表面。（四）抗体库技术（四）抗体库技术l主要特点：主要特点：l简单快速（无须细胞融合）简单快速（无须细胞融合）l选择范围广选择范围广l可模拟体内免疫系统反应可模拟体内免疫系统反应l可直接获得特异性人抗体可直接获得特异性人抗体l规模生产方便规模生产方便