荧光分光光度法..教学文案.ppt
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1、荧光分光光度法.前言:前言:v1852年,斯托克斯(Stokes)发现萤石在暗处受到光的照射会发出一种蓝白色的光,他把这种光命名为“荧光”。v1868年,Goppelstroeder发表了利用Al-桑色素绿色荧光来分析微量Al的分析方法,可见荧光分析是一种历史悠久的分析方法。时至今日,荧光分析在方法上取得了极大的进展。促进了诸如:时间分辨、相分辨、荧光偏振、荧光免疫和同步荧光等荧光分析新方法的发展,同时促使各种各样新型荧光分析仪器的出现。在仪器化方面,微机控制的全自动荧光分析仪具有灵敏度高(比紫外-可见分光光度法高2-3个数量级)、选择性好、工作曲线线性范围宽且能提供激发光谱、发射光谱、发光强
2、度、发光寿命、量子产率、偏振和各向异性诸多信息等优点,已成为一种重要的痕量分析技术。在生物、医学、医药、环境和石油工业等诸多领域,荧光分析法都有广泛的应用。不仅能直接或间接地分析众多的有机化合物,而且利用与有机试剂间的反应还能进行许多无机元素的测定。随着科技的发展进步,荧光这种光致发光(photoluminescence)的本质进一步被揭开:v 物质除了受紫外-可见光照射后会发出紫外和可见(UV-Vis)荧光之外,受其它各种不同波长光的照射后,同样也有发光现象。例如:X-荧光、红外荧光等。v 除了吸收光能使分子激发而发光,根据起始激发形成的方式,可以将荧光同其它的发光类型(例如:生物发光、热发
3、光、化学发光和摩擦发光)区别开来。v 通过化学反应使分子受激而发光称为“化学发光”。利用化学发光进行分析工作叫“化学发光分析”。v 化学发光分析、荧光分析和磷光分析统称为“分子发光分析(molecular luminescence)”。v 荧光和磷光同属光致发光。通过测定发光的强度可以定量测定许多痕量的无机物和有机物。v 相对于磷光和化学发光而言,目前荧光法的应用较多。本章主要讨论荧光分析。3.1 分子荧光产生的本质分子荧光产生的本质(Molecular Fluorescence)图图3-1 吸收光谱和荧光光谱能级跃迁示意图吸收光谱和荧光光谱能级跃迁示意图1.产生荧光的原因 荧光物质的分子吸收
4、了特征频率的光能后,由基态跃迁到能级较高的第一电子激发态或第二电子激发态,然后通过无辐射跃迁返回到第一电子激发态的最低振动能级上,再从该能级降落至基态的各个不同的振动能级上,同时放出相应能量的分子荧光,最后以无辐射形式回到基态的最低振动能级。l 需要注意的是:(1)整个过程是在单线态之间进行的;(2)产生荧光的过程极快,约在10-8秒左右内完成;(3)荧光的产生是由第一电子激发态的最低振动能级开始,而与荧光分子被激发至哪一个能级无关。因此,荧光光谱的形状和激发光的波长无关。2.磷光(Phosphorescence)当某些物质分子被激发到较高的能级,并通过无辐射跃迁降落至第一电子激发态的最低振动
5、能级之后,尚不能继续直接降落至基态,而是通过另一次无辐射跃迁降至一个中间的亚稳态能级三重线态上,这些分子在三重线态上经短暂停留后,再降落至基态的各个不同的振动能级上,同时发出辐射光,称这种发出的辐射光为磷光。磷光与荧光的区别主要为:(1)产生磷光的过程稍长,约在10-50.1 秒,有时长达1秒以上;(2)在辐射停止几秒或更长一段时间后,仍能检测到磷光,而上述荧光现象在照射光一旦停止照射,荧光便立即消失。3.迟滞荧光(延迟荧光)某些分子在跃迁至三重线态之后,通过热激活作用,可以再回升至第一电子激发态的各振动能级上,然后再由第一电子激发态的最低振动能级(v=0)降落至基态的各个不同振动能级而发出荧
6、光,这种光叫做迟滞荧光(或延迟荧光)。.分子吸收光谱与分子荧光光谱的关系 分子吸收光谱和分子荧光光谱都是分子内部振动能级结构的反映,但是分子吸收光谱是反映电子激发态中各个振动能级结构情况。在大多数分子中,由于电子激发态和电子基态的各个振动能级结构相似,因此吸收光谱和荧光光谱往往呈现大致的镜像对称关系。3.2 荧光与物质分子结构之间的关系荧光与物质分子结构之间的关系.物质产生荧光的两个必须条件(1)物质分子必须具有能吸收一定频率光的特征结构;(2)物质分子在吸收了特征频率的辐射能之后,必须具有高的荧光率,即具有较高的荧光效率(fluorescence efficiency)。荧光效率荧光效率(又
7、称:量子产率,记为)=发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数 荧光效率愈大,荧光的发射强度愈大,无辐射跃迁几率就愈小。当荧光效率等于零时就意味着不能发射荧光。因此,荧光物质必须具有较大的荧光效率。.物质产生荧光与其分子结构的关系(1)有机化合物的结构与分子荧光的关系 a.碳原子骨架 一般含有共扼体系的分子可产生荧光。共扼度越大,则离域电子愈易被激发,愈易产生荧光。所以绝大多数荧光物质含有芳香环或杂环。b.分子的几何排布 物质的分子为平面型,且具有一定的刚性结构,这样的分子荧光强烈。对于顺反异构体,顺式分子的两个基团在同一侧,由于位阻原因不能共平面,而没有荧光。c.芳环上取代基的类型和位置(!)类
8、型v 有些取代基可增强荧光:如-OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等;v 有些取代基可减弱荧光:如-COOH、-C=O、-NO2、-Cl、-Br、-I等;v 有些取代基影响不明显:如-F、-SH、-SO3H等。(!)位置v 邻、对位取代,荧光增强;间位取代,荧光减弱。u 分子所处的环境,如溶剂、温度、pH等都可能会影响分子的结构或立体构象,当然也就会影响分子能否产生荧光。(2)无机化合物的荧光 除过渡元素的顺磁性原子会发生线状荧光光谱外,大多数无机盐类金属离子,在溶液中只能发生无辐射跃迁,因而不能产生荧光。但是,在某些情况下,金属螯合物却能产生很强的荧光,并可用于痕量金属离子的测定。不
9、少有机化合物虽然具有共轭双键,但由于不是刚性结构,分子处于非同一平面,因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物,随着分子的刚性增强,平面结构增大,常会发出荧光。例如:8-羟基喹啉本身有很弱的荧光,但其金属螯合物具有很强的荧光。这是由于刚性和其平面性增加所致。一般来说,能产生这类荧光的金属离子具有硬酸型结构,如:Be2+、Mg2+、Al3+等。螯合物中金属离子的发光机理,通常是螯合物首先通过配位体的*跃迁而被激发,接着配位体把能量转移给金属离子,导致d d*跃迁或f f*跃迁,最终发射的是d*d跃迁或f*f跃迁光谱。3.3 荧光分析的方法及影响因素荧光分析的方法及影响因素1.荧光参数荧光
10、参数(1)激激发光谱和发射光谱发光谱和发射光谱 荧光的激发光谱和发射光谱是用荧光法进行物质的定性、定量分析的基本参数和依据。a.激发光谱:选择并固定发射波长EM和狭缝宽度S,让激发单色器进行波长扫描,记录荧光强度(F)随激发波长的变化而变化的关系曲线,叫激发光谱。b.发射光谱:选择并固定激发波长EX和狭缝宽度S,让发射单色器进行波长扫描,记录荧光强度(F)随发射波长的变化而变化的关系曲线,叫发射光谱。注意:上述记录的激发和发射光谱均为“表观光谱”,它受仪器的光源特性、单色器的特性和检测器的特性等因素影响。对于同一试样,用不同的荧光仪记录的“表观光谱”需进行校正,经过校正的光谱称为“真实荧光光谱
11、”又叫“校正光谱”。现代化的仪器都具有自动记录校正光谱的功能。(2)荧光强度:荧光强度:荧光物质吸收辐射能后才发射荧光,因此溶液的荧光强度和该溶液的吸光程度以及溶液中荧光物质的荧光效率有关。设I0和I分别为照射在待测溶液上的入射光和透过光强度,c和l分别为待测溶液浓度和液层厚度,则被测溶液吸收的光强度为:Ia=I0-I 根据光的吸收定律,得:I=I010-cl 则:Ia=I0-I=I0-I010-cl=I0(1-e-2.303cl)(3-1)因为溶液的荧光发射强度F和它吸收的光能Ia成正比,并且与荧光物质的荧光效率有关。所以:F=Ia=I0(1-e-2.303cl)(3-2)式中:为荧光效率,
12、而其中e-2.303cl展开得 e-2.303cl=1-2.303cl+(-2.303cl)2/2!+(-2.303cl)3/3!+(3-3)v 若溶液浓度c很低,、l都是定值,则cl的值很小,当A=cl0.05时,上面级数展开式中第二项以后的各项可以忽略不计,因此:e-CL=1-2.303cl (3-4)将(3-4)代入(3-2)得:F=2.303 I0cl (3-5)当入射光强度I0一定时,F=Kc (3-6)注意:注意:上式在一定浓度范围内适用。荧光物质的最大浓度为Cmax 0.05/L左右。当浓度较大时,即它的吸光度大于0.05时,荧光强度与其浓度的线性关系将发生偏离。在浓度较高时,产
13、生这种偏离的原因可能是激发分子间互相碰撞而失去能量(自身猝灭),或者是荧光被未激发的分子所吸收(自身吸收)。(3)荧光总量:荧光总量:荧光发射谱的面积积分,称为荧光总量。(4)峰值波长和谱带宽度峰值波长和谱带宽度a.峰值波长在谱图(包括激发谱和发射谱)中具有最大荧光强度所对应的波长,称为峰值波长。b.谱带宽度常用“半宽”来表示,即荧光峰强度值的一半时所对应的波长宽度。或:荧光谱的半高宽称为谱带宽度。(5)量子产率(或称荧光效率)量子产率(或称荧光效率)=发出的光量子数/吸收的光量子数。(6)荧光偏振荧光偏振:在研究分子的结构变化时用。用来研究荧光的各向异性(荧光的偏振性)。它是在激发和发射光路
14、中引入两个偏正器。它可用偏振度(P)表示:P=(FII-F)/(FII+F)式中:FII表示与激发光振动方向平行振动的偏光成分;F表示与激发光振动方向垂直振动的偏光成分。(7)荧光寿命荧光寿命:它是研究分子结构时要求的参数。定义:荧光强度衰减到1/e所需的时间,用表示。任意时间(t)的荧光强度 If=If0e-t/=If0e-kt 式中:If移去激发光源后任一时间t时的荧光强度;If0激发时最大的荧光强度;K仪器衰减常数;激发态的平均寿命。(8)荧光分析的灵敏度荧光分析的灵敏度 对整个发射光谱而言;/H对部分发射光谱而言,即对所测到的不是整个荧光光谱,只是靠近荧光峰的一个狭窄的谱带(H为荧光峰
15、的半高宽/谱带宽度)。2.荧光分析方法荧光分析方法(1)定性方法)定性方法 不同分子结构的各种荧光物质,具有不同的激发光谱(即吸收光谱)和荧光光谱,这是分子荧光分析的定性依据。在定性分析时,一般是在一定实验条件下,用荧光分光光度计作试样和标样的激发光谱和荧光光谱,然后比较它们的光谱图,即可鉴定试样物质。有时需改变溶剂后再比较它们的光谱图,如二者一致,即为同一物质。(2)定量方法)定量方法 目前,荧光分析多数用于荧光物质的定量分析。常用的定量方法有直接比较法、工作曲线法和内标法。a.直接比较法 设CX、CS分别为试样和标样溶液的浓度,FX、FS和FX0、FS0分别为试样、标样荧光值和试样、标样的
16、本底荧光值,因为 FX-FX0=KCX、FS-FS0=KCS,所以:Cx/Cs=(FX-FX0)/(FS-FS0)或 Cx=Cs(FX-FX0)/(FS-FS0)直接比较法简单快速,它要求被测样品浓度与其相应的荧光值必须处于线性范围内。b.工作曲线法 先配一系列不同浓度的标准溶液并分别测定其荧光值,然后将减去试剂空白荧光值的标准溶液荧光值与其相应浓度作图,即得其工作曲线。根据试液及试液空白荧光值,在此曲线上即可找到试液的浓度。同时根据工作曲线的线性情况,可确定试液的最高浓度范围。c.内标法内标法 设C x、Cs分别为试样和标样浓度,F x、Fx0分别为试样和试样本底的荧光值;F s+x为试样加
17、标样的混合溶液的荧光值。则 C x/CS=(FX-FX0)/(F S+x F x)或 C x=CS(FX-FX0)/(F S+x F x)除了这种内标计算法外,也可采用类似工作曲线的内标曲线法来求批量试样的浓度。用内标法时,由于试样和标样的荧光值是在相同体系中测定的,因此可消除试样中某些杂质荧光的干扰。3.荧光分析中的主要影响因素荧光分析中的主要影响因素(1)溶液浓度:)溶液浓度:要求c0.05/L,当高浓度时,由于自熄灭和自吸收等原因,使荧光强度与分子浓度不呈线性关系。(2)溶剂的影响:)溶剂的影响:一般来说,随着溶剂介电常数的增大,荧光峰的波长越大,荧光效率也越大。在含有重原子的溶剂(如:
18、碘乙烷CH3CH2I 和四溴化碳CBr4)中,由于重原子效应,增加系间窜跃速度,会使荧光减弱、磷光则相应增强。溶剂中杂质的荧光光谱或溶剂的拉曼光谱可能干扰测定。若拉曼光处于荧光波长中,则产生干扰。消除干扰的方法有:(a)选用高分辨的仪器。(b)对纯溶剂的拉曼峰进行测定,然后在荧光光谱中进行校正。(3)温度的影响)温度的影响 大多数荧光物质都随其所在溶液的温度升高荧光效率下降,荧光强度减小。例如:荧光素钠的乙醇溶液在-80C时,其荧光效率可达100%,当温度每增加10C时,荧光效率约减小3%。显然随着溶液温度升高,会增加分子间碰撞的次数,促进分子内能的转化,从而导致荧光强度下降。为此在许多荧光计
19、的液槽上配有低温装置,以提高灵敏度。(4)pH的影响的影响 当荧光物质为弱酸或弱碱时,溶液pH的改变对溶液的荧光强度有很大的影响,这是因为它们的分子和它们的离子在电子构型上的差异。(5)荧光的熄灭荧光的熄灭荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光荧光熄灭熄灭。这些引起荧光强度降低的物质称为熄熄灭剂灭剂。引起溶液中荧光熄灭的原因很多,机理也很复杂。下面讨论几种导致荧光熄灭作用的主要类型主要类型。(a)碰撞熄灭)碰撞熄灭:碰撞熄灭是荧光熄灭的主要原因。它是指处于单重激发态的荧光分子M*与熄灭剂Q发生碰撞后,使激发态分子以无辐射跃迁方式回到基态,因而产生熄灭作用。碰撞
20、熄灭的定量方程:F0/F-1=k Q 上式称为Stern-Volmer方程式。式中:k为熄灭常数;Q为熄灭剂浓度,单位mol/L;F0、F分别为熄灭剂不存在时和存在时,溶液的荧光强度。)k与体系的粘度有关系,粘度越大,k越小;)k与体系的温度有关系,温度升高,k也升高;温度每升高1C,k值增加在2%以下;)熄灭剂的浓度Q不得大于10mol/L。(b)组成化合物的熄灭)组成化合物的熄灭有些荧光熄灭现象不能用碰撞熄灭理论来解释。例如:某些荧光物质溶液在加入一些熄灭剂之后,(*)溶液的吸收光谱有了显著的改变,(*)溶液的荧光强度显著降低。比如:吖啶黄溶液受核酸的熄灭便是一个例子。加少量的核酸将使吖啶
21、黄溶液的荧光熄灭,且溶液的吸收光谱也发生显著位移。又如:某些荧光物质的溶液在加入熄灭剂之后,它的荧光强度随着温度的升高而增强。以上几种情况都是因为组成化合物熄灭所致。上述情况可能是:络合 M(有荧光)+Q MQ(无荧光)分解T,MQ M+Q(荧光增强)如果MQ的形成是由于强大的力,则MQ将具有它自己的特征吸收,因此溶液的吸收光谱也发生了改变。(c)转入三重线态(级)的熄灭)转入三重线态(级)的熄灭含溴化合物、碘化合物、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物、羧基化合物及某些杂环化合物,容易转入三重线级,溶液中绝大部分转入三重线级的分子在一般温度下不发光,它们将多余的能量消耗于它们与其他分子的碰撞之
22、中,因而引起荧光熄灭。溶液中的溶解氧常对荧光产生熄灭作用。这可能是由于顺磁性的氧分子与处于单重激发态的荧光物质分子相作用,促进形成顺磁性的三重态荧光分子,即加速系间窜跃所致。实验证明:O2的熄灭作用,似乎是随溶剂的介电常数的减小而增加,所以O2在水溶液中熄灭作用较小,而在有机溶剂中熄灭作用较强。(d)发生电子转移反应的熄灭)发生电子转移反应的熄灭 某些熄灭剂分子与荧光物质的分子相互作用时,发生了电子转移的反应,即氧化-还原反应,因而引起荧光的熄灭。例:甲基兰荧光溶液被Fe2+熄灭D*+Fe2+D-+Fe3+有荧光 无荧光 发生电子转移反应的熄灭剂并不限于金属离子,I-,Br-,S2O32-等易
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