常用分子生物学技术的原理及其应用课件.pptx

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1、常用分子生物学技术的原理及其应用第第 二十二十 章章第1页/共47页第一节分子杂交与印迹技术第2页/共47页n核酸分子杂交在在DNA复复性性过过程程中中，如如果果把把不不同同来来源源的的DNA单单链链分分子子放放在在同同一一溶溶液液中中，或或把把DNA单单链链与与RNA单单链链放放在在一一起起，只只要要在在DNA或或RNA的的单单链链分分子子之之间间有有一一定定的的碱碱基基配配对对关关系系，就就可可以以在在不同的分子之间形成杂化双链不同的分子之间形成杂化双链。一、分子杂交和印迹技术的原理3第3页/共47页复性复性RNADNA4第4页/共47页第5页/共47页用放射性核素、生物素或荧光染料标记其

2、用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针探针”，探针可以与固定在，探针可以与固定在NC膜上的核苷膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。（二）探针技术6第6页/共47页7分子杂交实验第7页/共47页8放射自显影照片第8页/共47页二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹(Southern blotting)（二）RNA印迹(Northern blotting)（三）蛋白质的印迹(Western blotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。、重

3、组质粒和噬菌体的分析。用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。9第9页/共47页10三种印迹技术的比较第10页/共47页n其他：斑点印迹斑点印迹(dot blotting)原位杂交原位杂交(in situ hybridization)DNA点阵点阵(DNA array)DNA芯片技术芯片技术(DNA chip)11第11页/共47页12DNA芯片技术第12页/共47页第二节PCR技术的原理与应用第13页/共47页5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 模板模板DNA一、

4、PCR技术的工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 14第14页/共47页Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。15第15页/共47页16PCR技术原理示意图 第16页/共47页n PCR的基本反应步骤变性变性9595 C C延伸延伸72C退火退火Tm-5C17第17页/共47页模板模板DNA特异性引物特异性引物耐热性耐热性DNA聚合酶（如聚合酶（如Taq DNA聚合酶）聚合酶）dNTPsMg2+n PCR体系基本组成成分18第18页/共47页利利用用特特异

5、异性性引引物物以以cDNA或或基基因因组组DNA为为模模板板获获得得已已知知目目的的基基因因片片段段,或或与与逆逆转转录录反反应应相相结结合合，直直接以组织和细胞的接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；为模板获得目的片段；利利用用简简并并引引物物从从cDNA文文库库或或基基因因组组文文库库中中获获得得序列相似的基因片段；序列相似的基因片段；利利用用随随机机引引物物从从cDNA文文库库或或基基因因组组文文库库中中克克隆隆基因。基因。二、PCR技术的主要用途19（一）目的基因的克隆第19页/共47页利利用用PCR技技术术可可以以随随意意设设计计引引物物在在体体外外对对目目的的基基因因片片段段

6、进进行行嵌嵌和和、缺缺失失、点点突突变等改造。变等改造。PCR技技术术高高度度敏敏感感，对对模模板板DNA的的量量要要求求很很低低，是是DNA和和RNA微微量量分分析析的的最好方法。最好方法。（三）DNA和RNA的微量分析（二）基因的体外突变20第20页/共47页将将PCR技技术术引引入入DNA序序列列测测定定，使使测测序序工作大为简化，也提高了测序的速度；工作大为简化，也提高了测序的速度；待待测测DNA片片段段既既可可克克隆隆到到特特定定的的载载体体后后进行序列测定，也可直接测定。进行序列测定，也可直接测定。PCR与与其其他他技技术术的的结结合合可可以以大大大大提提高高基基因突变检测的敏感性

7、因突变检测的敏感性。（四）DNA序列测定（五）基因突变分析21第21页/共47页逆转录逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将是将RNA的逆转录反应和的逆转录反应和PCR反反应联合应用的一种技术。应联合应用的一种技术。RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的因以及对已知序列的RNA进行定性及半定进行定性及半定量分析的最有效方法。量分析的最有效方法。（一）逆转录PCR技术三、几种重要的PCR衍生技术22第22页/共47页原原位位PCR是是在在组组织织切切片片或或细细胞胞涂涂片片上上的的单单个个细细胞胞内

8、内进进行行的的PCR反反应应，然然后后用用特特异异性性探探针针进进行行原原位位杂杂交交，即即可可检检出出待待测测DNA或或RNA是是否在该组织或细胞中存在。否在该组织或细胞中存在。原原位位PCR方方法法弥弥补补了了PCR技技术术和和原原位位杂杂交交技技术术的的不不足足，是是将将目目的的基基因因的的扩扩增增与与定定位位相相结结合的一种最佳方法。合的一种最佳方法。（二）原位PCR技术23第23页/共47页（三）实时PCR技术实实时时PCR(real-time PCR)技技术术通通过过动动态态监监测测反反应应过过程程中中的的产产物物量量，消消除除了了产产物物堆堆积积对定量分析的干扰，亦被称为定量对定

9、量分析的干扰，亦被称为定量PCR。24第24页/共47页QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物荧光标记引物荧光标记引物RQ 335525n 实时PCR技术原理第25页/共47页26TaqMan探针法实时PCR原理示意图第26页/共47页第三节基因文库第27页/共47页基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)cDNA文库文库(cDNA library)n基因文库(gene library)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNA序列序列的克隆群体。的克隆群体。28第28页/共47页一、基因组DNA文库基因组基因组DNA文库是指生物的文库是指

10、生物的基因组基因组DNA的信息（包括所有的编码区和非编码区）以的信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。片段形式贮存的克隆群体。用于构建基因组文库的载体有用于构建基因组文库的载体有 噬菌体、噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。粘粒和酵母人工染色体等。29第29页/共47页30基因组文库和cDNA文库的构建与筛选第30页/共47页第一轮筛选第一轮筛选第二轮筛选第二轮筛选第三轮筛选第三轮筛选31n基因组文库筛选结果举例第31页/共47页cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的经逆转录而合成的c

11、DNA序列序列的克隆群体，它以的克隆群体，它以cDNA片段的形片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。式贮存着该组织细胞的基因表达信息。二、cDNA文库32第32页/共47页第四节生物芯片技术第33页/共47页是指将许多特定的是指将许多特定的DNADNA片段有规律地紧密排片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出荧光信号做出检

12、测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列。微阵列。一、基因芯片34n基因芯片(gene chip)第34页/共47页35双色荧光标记探针基因芯片工作流程示意图第35页/共47页是是将将高高度度密密集集排排列列的的蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针点点阵阵固固定定在在固固相相支支持持物物上上，当当与与待待测测蛋蛋白白样样品品反反应应时时，可可捕捕获获样样品品中中的的靶靶蛋蛋白白，再再经经检检测测系系统统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片n蛋白质芯片(protein chip)n蛋

13、白质芯片作用原理36蛋白质分子间的亲和反应蛋白质分子间的亲和反应第36页/共47页第五节生物大分子相互作用研究技术第37页/共47页一、蛋白质相互作用研究技术酵母双杂交酵母双杂交各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）各种亲和分析（标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换效应分析荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选噬菌体显示系统筛选n常用蛋白质相互作用的研究技术38第38页/共47页标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要

14、用于证明两种蛋标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。合的未知分子。39第39页/共47页40标签融合蛋白沉淀实验流程示意图第40页/共47页（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途41第41页/共47页n酵母双杂交系统的应用证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。的生物信息学推测。分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相

15、互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。将拟研究的蛋白质的编码基因与将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成基因融合成为为“诱饵诱饵”表达质粒，可以筛选表达质粒，可以筛选AD基因融合的基因融合的“猎物猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。蛋白质。42第42页/共47页电电泳泳迁迁移移率率变变动动测测定定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或或称称凝凝胶胶迁迁移移变变动动实实验验(gel shift assay)最最初初用用于于研研究究DNA结结合合蛋蛋白白与与相相应应D

16、NA序序列列间间的的相相互互作作用用，可可用用于于定定性性和和定定量量分分析析，已已经经成成为为转转录录因因子子研研究究的的经经典典方方法法。目目前前这这一一技技术术也也被被用用于于研研究究RNA结结合合蛋蛋白白和和特特定定RNA序序列列间间的相互作用。的相互作用。二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定43第43页/共47页放放射射自自显显影影未结合探针未结合探针结合有蛋白的探针结合有蛋白的探针标记探针1X1X1X1X核蛋白提取物1X10X10X未标记探针10X44凝胶迁移率变动分析示意图第44页/共47页染染色色质质免免疫疫沉沉淀淀技技术术(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)是是目目前前可可以以研研究究体体内内DNA与与蛋蛋白白质质相相互互作作用的主要方法。用的主要方法。（二）染色质免疫沉淀技术45第45页/共47页46染色质免疫沉淀技术流程及结果示意图第46页/共47页47感谢您的观看。第47页/共47页