重组DNA技术和基因工程PPT课件.ppt

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1、关于重组关于重组关于重组关于重组DNADNA技术与基技术与基技术与基技术与基因工程因工程因工程因工程第一张，PPT共五十六页，创作于2022年6月A 酵母作为表达外源基因受体的特征6 6 外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达 酵母（酵母（YeastYeast）是一群以是一群以芽 殖芽 殖或或裂 殖裂 殖方式进行方式进行无性繁殖无性繁殖的单细胞的单细胞半知菌类半知菌类（半知酵母半知酵母），共由），共由5656个属、个属、500500多个种组成。如果说大肠多个种组成。如果说大肠杆 菌 是 外 源 基 因 最 成 熟 的 原 核 生 物 表 达 系 统，则 酵 母 菌 是 最 成 熟 的 真

2、杆 菌 是 外 源 基 因 最 成 熟 的 原 核 生 物 表 达 系 统，则 酵 母 菌 是 最 成 熟 的 真核生物表达系统。核生物表达系统。酵母的分类学特征酵母的分类学特征真 核 生 物真 核 生 物，分 属 于，分 属 于子 囊 菌 纲子 囊 菌 纲（子囊酵母）、（子囊酵母）、担 子 菌 纲担 子 菌 纲（担子酵母（担子酵母）、）、第二张，PPT共五十六页，创作于2022年6月A 酵母作为表达外源基因受体的特征6 6 外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达酵母表达外源基因的优势酵母表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便全基因组测序，基因表达调控机理

3、比较清楚，遗传操作简便能将外源基因表达产物分泌至培养基中能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDAFDA认定为安全的认定为安全的基因工程受体系统（基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRASGenerally Recognized As Safe GRAS）酵母菌是最简单的真核模式生物酵母菌是最简单的真核

4、模式生物第三张，PPT共五十六页，创作于2022年6月B 酵母的宿主系统6 6 外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达提高重组蛋白表达产率的突变宿主提高重组蛋白表达产率的突变宿主抑制超糖基化作用的突变宿主抑制超糖基化作用的突变宿主减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主广泛用于外源基因表达的酵母宿主广泛用于外源基因表达的酵母宿主第四张，PPT共五十六页，创作于2022年6月广泛用于外源基因表达的酵母宿主广泛用于外源基因表达的酵母宿主目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母包括：目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母包括：酵母属酵母属 如如酿酒酵母酿酒酵母（S

5、accharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae）克鲁维酵母属克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母（如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactisKluyveromyces lactis）毕赤酵母属毕赤酵母属 如如巴斯德毕赤酵母巴斯德毕赤酵母（Pichia pastorisPichia pastoris）裂殖酵母属裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母（如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombeSchizosaccharomyces pombe）汉逊酵母属汉逊酵母属 如多态汉逊酵母（如多态汉逊酵母（Hansenula poly

6、morphaHansenula polymorpha）其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想。表达外源基因最理想。第五张，PPT共五十六页，创作于2022年6月提高重组蛋白表达产率的突变宿主提高重组蛋白表达产率的突变宿主能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型：能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型：sscssc1 1sscssc2 2rgrrgr1 1oseose1 1sscssc1111 rhorho-突变类型突变类型生物效应生物效应作用位点作用位点改善重组蛋白

7、分泌改善重组蛋白分泌钙离子依赖型的钙离子依赖型的ATPATP酶酶提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达转录后加工转录后加工转录水平转录水平提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达转录水平转录水平提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达改善重组蛋白分泌改善重组蛋白分泌羧肽酶羧肽酶YY转录水平转录水平提高重组蛋白表达提高重组蛋白表达第六张，PPT共五十六页，创作于2022年6月抑制超糖基化作用的突变宿主抑制超糖基化作用的突变宿主能抑制超糖基化的突变类型能抑制超糖基化的突变类型mnnmnnalgalgochoch突变类型突变类型生物效应生物效应 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们许多真核生物的蛋白

8、质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心糖基核心和和外侧糖链外侧糖链两部分两部分组成。组成。酵母菌普遍拥有蛋白酵母菌普遍拥有蛋白质的糖基化系统，但野生质的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷株非常重要。基化缺陷株非常重要。甘露糖生物合成缺陷型甘露糖生物合成缺陷型天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型外侧糖链添加缺陷型外侧糖链添加缺陷型第七张，PPT共五十六页，创作于2022年6

9、月减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主泛素介导的蛋白质降解作用泛素介导的蛋白质降解作用蛋白酶体蛋白酶体LysLysHOOCUbiquitin 76 aaUbiquitin 76 aa ubiquitin ligase E3ubiquitin ligase E3 LysLysubiquitin ligase E3ubiquitin ligase E3 LysLys靶蛋白靶蛋白靶蛋白第八张，PPT共五十六页，创作于2022年6月减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌泛素依赖型蛋白降解系

10、统的编码基因酵母菌共有四个泛素编码基因：酵母菌共有四个泛素编码基因：UBI UBI 1 1 编码泛素编码泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白5252（CEP52CEP52）对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭UBI UBI 2 2 编码泛素编码泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白5252（CEP52CEP52）对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭UBI UBI 3 3 编码泛素编码泛素-羧基延伸蛋白羧基延伸蛋白7676（CEP76CEP76）对数生长期表达对数生长期表达 稳定期关闭稳定期关闭UBI UBI 4 4 编码泛素五聚体编码泛素五聚体 对数生长期关闭对数生长期关闭 稳定

11、期表达稳定期表达酵母菌共有七个泛素连接酶基因：酵母菌共有七个泛素连接酶基因：UBC UBC 11、UBC UBC 22、UBC UBC 33、UBC UBC 44、UBC UBC 55、UBC UBC 66、UBC UBC 77第九张，PPT共五十六页，创作于2022年6月减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主泛素降解途径衰减的酿酒酵母泛素降解途径衰减的酿酒酵母在酿酒酵母菌中，泛素主要由在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI UBI 4 4基因表达，基因表达，UBI UBI 4 4-突变株能突变株能UBI UBI 4 4缺陷型：缺陷型：正常生长，但细胞内游离泛素分子

12、的浓度比野生株要低得多，正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，因此因此UBI UBI 4 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体。缺陷突变株是外源基因表达理想的受体。UBA UBA 1 1缺陷型：缺陷型：UBAUBA1 1编码泛素激活酶编码泛素激活酶E1E1，UBAUBA1 1突变株是致死性的，但其等位突变株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解。基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解。Ubc4 Ubc4-ubc5 ubc5 双突变型：双突变型：七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降

13、解作用同样有效。第十张，PPT共五十六页，创作于2022年6月C 酵母的载体系统6 6 外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达酵母克隆表达质粒的构建酵母克隆表达质粒的构建酵母中的野生型质粒酵母中的野生型质粒第十一张，PPT共五十六页，创作于2022年6月酵母中的野生型质粒酵母中的野生型质粒酿酒酵母中的酿酒酵母中的2 2m m环状质粒环状质粒几乎所有的酿酒酵母中都含有几乎所有的酿酒酵母中都含有22mm双链双链同源重组同源重组REP1REP1RAFRAFSTBSTBorioriREP2REP2FLPFLPIRIRIRIRAABB环状质粒，拷贝数达环状质粒，拷贝数达5050至至100100个。

14、个。IRs IRs 反向重复序列，反向重复序列，600 600 bpbp，重组重组FLPFLP 编码产物驱动编码产物驱动IRsIRs的同源重组的同源重组REPREP 编码产物控制质粒的稳定性编码产物控制质粒的稳定性STBSTB REPREP的结合位点的结合位点接合酵母属中的接合酵母属中的pSR1pSR1和和pSB1pSB1，以及以及克鲁维酵母属中的克鲁维酵母属中的pKD1pKD1等均与等均与22mm质质粒类似。粒类似。第十二张，PPT共五十六页，创作于2022年6月酵母克隆表达质粒的构建酵母克隆表达质粒的构建含有含有ARSARS的的YRpYRp质粒的构建质粒的构建 ARSARS为酵母菌中的自主

15、复制序列，为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.50.8-1.5kbkb，染色体上每染色体上每30-4030-40kbkb就有一个就有一个ARSARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNADNA。以以ARSARS为复制子的质粒称为为复制子的质粒称为YRpYRp 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200200个，但培养几代个，但培养几代 以以2 2m m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为质粒上的复制元件为复制子的质粒

16、称为YEpYEp后，质粒的丢失率高达后，质粒的丢失率高达50%-70%50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。，主要是由于分配不均匀所致。第十三张，PPT共五十六页，创作于2022年6月酵母克隆表达质粒的构建酵母克隆表达质粒的构建含有含有CENCEN的的YCpYCp质粒的构建质粒的构建 CENCEN为酵母菌染色体为酵母菌染色体DNADNA上与染色体均匀分配有关的序列上与染色体均匀分配有关的序列 将将CEN CEN DNADNA插入含插入含ARSARS的质粒中，获得的新载体称为的质粒中，获得的新载体称为YCpYCp YCp YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有质粒具有较高的有丝分裂

17、稳定性，但拷贝数只有1-51-5个个含有含有TELTEL的的YACYAC质粒的构建质粒的构建第十四张，PPT共五十六页，创作于2022年6月酵母克隆表达质粒的构建酵母克隆表达质粒的构建含有酵母菌染色体含有酵母菌染色体DNADNA同源序列的同源序列的YIpYIp质粒的构建质粒的构建 在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNADNA特定序列和标记基因，构特定序列和标记基因，构建 出 来 的 质 粒 称 为建 出 来 的 质 粒 称 为YipYip。目 的 基 因 表 达 盒 通 常 插 在 染 色 体目 的 基 因 表 达 盒 通 常 插 在 染 色 体D N AD N

18、 A特 定 序 列特 定 序 列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNADNA区域。区域。第十五张，PPT共五十六页，创作于2022年6月D 酵母的转化系统6 6 外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达转化质粒在酵母细胞中的命运转化质粒在酵母细胞中的命运酵母菌的转化程序酵母菌的转化程序用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因第十六张，PPT共五十六页，创作于2022年6月酵母的转化程序酵母的转化程序酵母原生质体转化法酵母原生质体转化法 早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化法早期酵母菌的转化都采用在等渗

19、缓冲液中稳定的原生质体转化法在在CaCa2+2+和和PEGPEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1-2%1-2%。但该程。但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳多原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25-33%25-33%。第十七张，PPT共五十六页，创作于2022年6月酵母的转化程序酵母的转化程序碱金属离子

20、介导的酵母完整细胞的转化碱金属离子介导的酵母完整细胞的转化 酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如LiLi+等）、等）、PEGPEG、热 休 克 处热 休 克 处理后，也可高效吸收质粒理后，也可高效吸收质粒DNADNA，而且具有下列特性：而且具有下列特性：吸收线型吸收线型DNADNA的能力明显大于环状的能力明显大于环状DNADNA，两者相差两者相差8080倍倍共转化现象极为罕见共转化现象极为罕见第十八张，PPT共五十六页，创作于2022年6月酵母的转化程序酵母的转化程序酵母电击转化法酵母电击转化法 酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒酵母菌原生质体和完

21、整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNADNA，但但在 此 过 程 中 应 避 免 使 用在 此 过 程 中 应 避 免 使 用P E GP E G，它 对 受 电 击 的 细 胞 具 有 较 很 大 的 负 作 用它 对 受 电 击 的 细 胞 具 有 较 很 大 的 负 作 用电 击 转 化 的 优 点 是 不 依 赖 于 受 体 细 胞 的 遗 传 特 征 及 培 养 条 件 适 用 范 围电 击 转 化 的 优 点 是 不 依 赖 于 受 体 细 胞 的 遗 传 特 征 及 培 养 条 件 适 用 范 围广，而且转化率可高达广，而且转化率可高达10105 5/m mg DNAg DNA。第

22、十九张，PPT共五十六页，创作于2022年6月转化质粒在酵母细胞中的命运转化质粒在酵母细胞中的命运单双链单双链DNADNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10-3010-30倍；倍；含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制；含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制；不 含 复 制 子 的 单 链 质 粒 进 入 细 胞 后，能 高 效 地 同 源 整 合 入 染 色 体不 含 复 制 子 的 单 链 质 粒 进 入 细 胞 后，能 高 效 地 同 源 整 合 入 染 色 体这对于体内定点突变酵母基因组极为有利；这对于体

23、内定点突变酵母基因组极为有利；克 隆 在克 隆 在YIpYIp整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体D N AD N A的 同 源 序 列，会 发 生 高 频 同 源 整 合，整 合 子 占 转 化 子 总 数 的的 同 源 序 列，会 发 生 高 频 同 源 整 合，整 合 子 占 转 化 子 总 数 的50-80%50-80%。第二十张，PPT共五十六页，创作于2022年6月用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因 用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有有营 养 缺 陷 型营 养 缺 陷 型互

24、 补 基 因 和互 补 基 因 和显性基因显性基因两大类：两大类：营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：LEULEU、TRPTRP、HISHIS、LYSLYS、URAURA、ADEADE 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难。但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难。营养缺陷型的互补基因营养缺陷型的互补基因第二十一张，PPT共五十六页，创作于2022年6月用于转化子筛选的标记基因用于转化子筛选的标记基因 显性标记基因显性标记基因 显性标记基因的编码产物大都是毒性物质的抗性蛋白显性标记基因的编码产物

25、大都是毒性物质的抗性蛋白 aph aph 氨基糖苷转移酶氨基糖苷转移酶 抗抗G418G418 cat cat 氯霉素乙酰转移酶氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素抗氯霉素 dhfr dhfr 二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺抗氨甲喋呤和磺胺 cup1 cup1 铜离子螯合物铜离子螯合物 耐受铜离子耐受铜离子 suc2 suc2 蔗糖转化酶蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖耐受高浓度蔗糖 ilv2 ilv2 乙酰乳糖合成酶乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂抗硫酰脲除草剂标记基因标记基因编码产物编码产物遗传表型遗传表型第二十二张，PPT共五十六页，创作于2022年6月E 酵母的表达系统6 6 外源基因在酵

26、母中的表达外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母菌中表达的限制因素外源基因在酵母菌中表达的限制因素酵母菌启动子的可控性酵母菌启动子的可控性酵母菌表达系统的选择酵母菌表达系统的选择第二十三张，PPT共五十六页，创作于2022年6月酵母启动子的可控性酵母启动子的可控性 温度控制型启动子温度控制型启动子a a-a a a a 型启动子：型启动子：酿酒酵母有酿酒酵母有aa和和a aa a两种单倍体，分两种单倍体，分别由别由M A TM A Taa和和M A TM A Ta aa aa a 型启动子型启动子hmlhmla aa a2-102 2-102 MATaMATaa1a1Sir3-8Sir3-8TS

27、TS 型启动子型启动子 受体细胞基因组受体细胞基因组 重组质粒重组质粒a a 型启动子型启动子hmlhmla aa a2-102 2-102 MATaMATaa1a1Sir3-8Sir3-8TSTS 型启动子型启动子a aa a22a aa a1125253535两个等位基因决定。两个等位基因决定。a aa a11因子决定因子决定a aa a细胞特征表达细胞特征表达a aa a22因子阻遏因子阻遏aa细胞细胞特征表达特征表达a1-a2a1-a2阻遏阻遏a aa a细 胞 特 征 表 达细 胞 特 征 表 达编 码编 码a aa a22因 子 的 基 因 突 变 型因 子 的 基 因 突 变 型

28、hmlhmla aa a2-1022-102能产生能产生a aa a22变体，它变体，它能 灭 活能 灭 活a 1a 1，同 时 阻 遏同 时 阻 遏aa型型第二十四张，PPT共五十六页，创作于2022年6月酵母启动子的可控性酵母启动子的可控性酿 酒 酵 母酿 酒 酵 母超诱导型启动子超诱导型启动子GAL1GAL1GAL7GAL7GAL10GAL10UASUASGAL4GAL4GAL80GAL80半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达GAL1GAL1GAL7GAL7GAL10GAL10UASUASGAL4GAL4GAL80GAL80半乳糖诱导时，半乳糖诱导

29、时，GAL4GAL4高效表达，高效表达，GAL1GAL1、GAL1GAL1、GAL10GAL10超高效表达超高效表达GAL10GAL10PromoterPromoter的 半 乳 糖的 半 乳 糖利 用 酶 系利 用 酶 系由由G A L 1G A L 1 G A L 7G A L 7和和 G A L 1 0G A L 1 0基 因 编 码基 因 编 码第二十五张，PPT共五十六页，创作于2022年6月外源基因在酵母中表达的限制因素外源基因在酵母中表达的限制因素外源基因稳态外源基因稳态mRNAmRNA的浓度的浓度外源基因外源基因mRNAmRNA的翻译活性的翻译活性酵母菌对密码子的偏爱性酵母菌对

30、密码子的偏爱性在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛-3-3-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶GAPDHGAPDH、磷酸甘油激酶磷酸甘油激酶PKGPKG、乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶ADHADH）中中96%96%以上的氨基酸是由以上的氨基酸是由2525个密码子编码的。个密码子编码的。第二十六张，PPT共五十六页，创作于2022年6月酵母表达系统的选择酵母表达系统的选择 酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油醛醛-3-3-磷酸脱氢酶基因磷酸脱氢酶基因GAPDHGAPDH、磷酸甘油激酶基因磷酸甘油激酶基因PKG

31、PKG、乙醇脱氢乙醇脱氢酿酒酵母表达系统酿酒酵母表达系统酶基因酶基因ADHADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。酿酒酵母表达系统的最大问题在于其酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化超糖基化能力，往往使得能力，往往使得有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。第二十七张，PPT共五十六页，创作于2022年6月酵母表达系统的选择酵母表达系统的选择 乳 酸 克 鲁

32、维 酵 母 的 双 链 环 状 质 粒乳 酸 克 鲁 维 酵 母 的 双 链 环 状 质 粒pKD1pKD1已 被 广 泛 用 作 重 组 异 源已 被 广 泛 用 作 重 组 异 源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也乳酸克鲁维酵母表达系统乳酸克鲁维酵母表达系统能稳定遗传能稳定遗传4040代以上。代以上。乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。于酿酒酵母表达系统。第二十八张，PPT共五十六页，创作于2022年6月酵母表达系统的

33、选择酵母表达系统的选择 巴 斯 德 毕 赤 酵 母 是 一 种巴 斯 德 毕 赤 酵 母 是 一 种甲 基 营 养 菌甲 基 营 养 菌，能在低廉的含甲醇培养基中生，能在低廉的含甲醇培养基中生巴斯德毕赤酵母表达系统巴斯德毕赤酵母表达系统长，长，甲 醇甲 醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长迅可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇氧化酶基因速、乙醇氧化酶基因AOXAOX1 1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。但甲醇赤酵母表达系统的三大优势。但甲醇易挥发易挥发，操作条件差。，操作条件差。由

34、于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因的由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因的表达序列一般表达序列一般整 合整 合入受体的染色体入受体的染色体DNADNA上。在此情况下，外源基因的上。在此情况下，外源基因的有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。高效表达在很大程度上取决于整合高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数拷贝数的多寡。目前已有的多寡。目前已有5050余种具余种具第二十九张，PPT共五十六页，创作于2022年6月酵母表达系统的选择酵母表达系统的选择 多型汉逊酵母也是一种多型汉逊酵母也

35、是一种甲基营养菌甲基营养菌。其自主复制序列。其自主复制序列HARSHARS已被克已被克多型汉逊酵母表达系统多型汉逊酵母表达系统隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载体在隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是，受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是，HARSHARS质 粒质 粒能高频能高频自发地整合在受体的染色体自发地整合在受体的染色体DNADNA上，甚至可以连续整合上，甚至可以连续整合100100多 个 拷 贝，多 个 拷 贝，目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获得目前，包括乙型肝

36、炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获得因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。成功表达。成功表达。第三十张，PPT共五十六页，创作于2022年6月F 利用重组酵母生产乙肝疫苗6 6 外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达 由由乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒（HBVHBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重的传染病，每年约有的传染病，每年约有200200万万病人死亡，并有病人死亡，并有3 3亿亿人 成 为人 成 为HBVHBV携带者，其携带者，其中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒中

37、相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其广泛应用提供了可靠的保证。广泛应用提供了可靠的保证。第三十一张，PPT共五十六页，创作于2022年6月乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的结构与性质 乙 肝 病 毒乙 肝 病 毒是一种蛋白包裹型的是一种蛋白包裹型的双 链双 链DNADNA病 毒病 毒，具有感染力的病毒颗，具有感染力的病毒颗乙型肝炎病

38、毒的结构乙型肝炎病毒的结构粒呈球面状，直径为粒呈球面状，直径为42 42 n mn m，基 因 组 仅 为基 因 组 仅 为3.2 3.2 kbkb。病毒颗粒的主要结构病毒颗粒的主要结构蛋白是病毒的蛋白是病毒的表面抗原多肽表面抗原多肽（HBsAgHBsAg）或）或S S多肽多肽，它具有糖基化和非糖，它具有糖基化和非糖基化两种形式。颗粒内的蛋白成份包括基化两种形式。颗粒内的蛋白成份包括核心抗原核心抗原（HBcAgHBcAg）、病毒）、病毒DNADNA 除 此 之 外，被 乙 肝 病 毒 感 染 的 人 的 肝 脏 还 能 合 成 并 释 放 大 量 的除 此 之 外，被 乙 肝 病 毒 感 染

39、的 人 的 肝 脏 还 能 合 成 并 释 放 大 量 的2 22 2聚合酶、微量病毒蛋白。聚合酶、微量病毒蛋白。n mn m的 空 壳 亚 病 毒 颗 粒，其 免 疫 原 性 是 未 装 配 的 各 种 包 装 蛋 白 组 份 的的 空 壳 亚 病 毒 颗 粒，其 免 疫 原 性 是 未 装 配 的 各 种 包 装 蛋 白 组 份 的10001000倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：S S、MM、L L多肽。多肽。第三十二张，PPT共五十六页，创作于2022年6月乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因乙型肝炎病毒的包装蛋白

40、编码基因ATGATGATGATGATGATGTAATAA108 aa108 aa55 aa55 aa226 aa226 aapreS1preS1preS2preS2SSS S 多肽多肽226 aa226 aaM M 多肽多肽281 aa281 aaL L 多肽多肽399 aa399 aa第三十三张，PPT共五十六页，创作于2022年6月乙型肝炎病毒的结构与性质乙型肝炎病毒的结构与性质 乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫传统乙肝疫苗的制备传统乙肝疫苗的制备苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的苗是

41、从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。第三十四张，PPT共五十六页，创作于2022年6月产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 20 20世纪世纪8080年代开始选择年代开始选择酿酒酵母酿酒酵母表达重组表达重组HBsAgHBsAg，主要工作包括主要工作包括将将S S多肽的编码置于多肽的编码置于ADH1ADH1启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，

42、平性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平均颗粒直径为均颗粒直径为2222nmnm，其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中的病毒颗粒相同。的病毒颗粒相同。目前，由酿酒酵母生产的重组目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAgHBsAg颗粒已作为乙肝疫苗商品化颗粒已作为乙肝疫苗商品化重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的1%-2%1%-2%。进一步的研究表明，进一步的研究表明，MM多肽和多肽和L L多肽对多肽对S S型疫苗具有显著的增效作型疫苗具有显著的增效作用，由三者（或两者）构成的复合型乙肝疫苗还可以诱导

43、那些对用，由三者（或两者）构成的复合型乙肝疫苗还可以诱导那些对S S抗抗原缺乏响应的人群的免疫反应。原缺乏响应的人群的免疫反应。第三十五张，PPT共五十六页，创作于2022年6月产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建PARS2PARS2Bgl IIBgl II5 AOX15 AOX1HBsAgHBsAgPHIS4PHIS43 AOX13 AOX1Bgl IIBgl IIpBSAG151pBSAG15111 kb11 kbBgl IIBgl II5 AOX15 AOX1HBsAgHBsAgPHIS4PHIS

44、43 AOX13 AOX1hishis+的转化子的转化子重组分子重组分子转化转化hishis-的受体细胞的受体细胞染色体染色体DNADNA第三十六张，PPT共五十六页，创作于2022年6月产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母重组巴斯德毕赤酵母的性能重组巴斯德毕赤酵母的性能 由于巴斯德毕赤酵母染色体由于巴斯德毕赤酵母染色体DNADNA上还拥有第二个乙醇氧化酶基因上还拥有第二个乙醇氧化酶基因AOX2AOX2，所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。重 组 菌 首 先 在 含 有 甘 油 的 培 养 基 中 培 养，

45、待 甘 油 耗 尽 后，加 入 甲重 组 菌 首 先 在 含 有 甘 油 的 培 养 基 中 培 养，待 甘 油 耗 尽 后，加 入 甲醇 诱 导醇 诱 导HBsAgHBsAg表达，最终表达，最终S S蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的3%3%在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个240240L L的发酵罐的发酵罐中培养，最终可获得中培养，最终可获得9090克克2222nmnm的的HBsAgHBsAg颗粒，足够制成颗粒，足够制成900900万份乙肝万份乙肝疫苗。疫苗。第三十七张，PPT共五十六页，创作于

46、2022年6月G 酵母糖蛋白生产的人源化改造6 6 外源基因在酵母中的表达外源基因在酵母中的表达 除抗体外，哺乳动物绝大多数糖蛋白的半衰期和功能依赖于糖链末端的除抗体外，哺乳动物绝大多数糖蛋白的半衰期和功能依赖于糖链末端的唾液唾液酸酸，其它裸露的末端糖（如甘露糖、，其它裸露的末端糖（如甘露糖、N-N-乙酰葡糖胺、半乳糖等）会被糖特异性的乙酰葡糖胺、半乳糖等）会被糖特异性的受体或凝集素清除。由于不少药用糖蛋白需要唾液酸化，因此其生产目前只能受体或凝集素清除。由于不少药用糖蛋白需要唾液酸化，因此其生产目前只能依靠哺乳动物受体，因为后者能进行人样化的依靠哺乳动物受体，因为后者能进行人样化的N-N-糖

47、基化糖基化反应，包括在末端加唾液反应，包括在末端加唾液酸的能力。酵母和丝状真菌作为重组蛋白表达系统，与哺乳动物细胞相比，具有较高酸的能力。酵母和丝状真菌作为重组蛋白表达系统，与哺乳动物细胞相比，具有较高的重组蛋白表达率、较短的发酵周期、能在化学成分确定的培养基中生长等很多优势。的重组蛋白表达率、较短的发酵周期、能在化学成分确定的培养基中生长等很多优势。然而，野生型酵母往往将高甘露糖型的多糖链加在蛋白质上，直接影响表达产然而，野生型酵母往往将高甘露糖型的多糖链加在蛋白质上，直接影响表达产物在人体内的稳定性与功效。物在人体内的稳定性与功效。第三十八张，PPT共五十六页，创作于2022年6月ERER

48、ERER两种多糖合成途径的比较两种多糖合成途径的比较人类糖蛋白侧链多聚糖的成熟，涉及下列人类糖蛋白侧链多聚糖的成熟，涉及下列基因编码的酶系：基因编码的酶系：MnsIMnsI：-1,2-1,2-甘露糖苷酶甘露糖苷酶 IIMnsIIMnsII：-1,2-1,2-甘露糖苷酶甘露糖苷酶 IIIIGnTIGnTI：-1,2-1,2-NN-乙酰葡糖胺转移酶乙酰葡糖胺转移酶 IIGnTIIGnTII：-1,2-1,2-NN-乙酰葡糖胺转移酶乙酰葡糖胺转移酶 IIIIGalTGalT：-1,-1,44-半乳糖苷转移酶半乳糖苷转移酶SiaTSiaT：-2,6-2,6-唾液酸苷转移酶唾液酸苷转移酶巴斯德毕赤酵母细

49、胞中不存在上述酶巴斯德毕赤酵母细胞中不存在上述酶系。系。第三十九张，PPT共五十六页，创作于2022年6月巴斯德毕赤酵母糖链合成的人源化改造巴斯德毕赤酵母糖链合成的人源化改造JC308 WTJC308 WTRDP750RDP750YSH557YSH557YSH597YSH597Y11430 WTY11430 WTYSH551YSH551Stephen R.Hamilton Stephen R.Hamilton et alet al.ScienceScience 313313.1441.2006.1441.2006敲除敲除44个基因，摧毁个基因，摧毁巴斯德毕赤酵母原有的超糖基化系统：巴斯德毕赤酵

50、母原有的超糖基化系统：och1och1，pno1pno1，mnn4Bmnn4B，bmt2bmt2导入导入99个基因，构建个基因，构建人的糖基化系统：人的糖基化系统：UgnTUgnT：小鼠的：小鼠的UDP-UDP-NN-乙酰葡糖胺转运蛋白乙酰葡糖胺转运蛋白 UgnTUgnT：克鲁维酵母的：克鲁维酵母的UDP-UDP-NN-乙酰葡糖胺转运蛋白乙酰葡糖胺转运蛋白 MnsIMnsI：小鼠的：小鼠的-1,2-1,2-甘露糖苷酶甘露糖苷酶 II MnsIIMnsII：果蝇的：果蝇的-1,2-1,2-甘露糖苷酶甘露糖苷酶 IIII GnTIGnTI：人的：人的-1,2-N-1,2-N-乙酰葡糖胺转移酶乙酰葡