间接免疫荧光检测PBMCppt课件.ppt

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1、 间间 接接 免免 疫疫 荧荧 光光-检测人外周血单个核细胞检测人外周血单个核细胞武汉大学基础医学院武汉大学基础医学院免疫学教研室免疫学教研室熊熊 洁洁原原 理理 间接免疫荧光法是用荧光素标记间接免疫荧光法是用荧光素标记Ab2以检测以检测Ag或或Ab的一种实验技术。其原理是的一种实验技术。其原理是Ag首先与首先与Ab1结合，然后结合，然后Ab1再与荧光素标记的再与荧光素标记的Ab2结合，结合，形成一个形成一个Ag-Ab1-荧光素标记荧光素标记Ab2的三分子复合的三分子复合物，在荧光显微镜下呈现荧光。物，在荧光显微镜下呈现荧光。外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞分离 -葡蔗糖葡蔗糖-泛影葡胺密

2、度梯度离心法泛影葡胺密度梯度离心法 原理原理 外外周周血血单单个个核核细细胞胞（PBMC）包包括括淋淋巴巴细细胞胞、单单核核细细胞胞，其其体体积积、形形状状和和比比重重与与其其他他细细胞胞不不同同。红红细细胞胞和和多多核核细细胞胞比比重重较较大大，为为1.092左左右右，而而淋淋巴巴细细胞胞和和单单核核细细胞胞比比重重为为1.075左左右右。利利用用比比重重为为1.077左左右右的的分分层层液液作作密密度度梯梯度度离离心心，使使一一定定比比重重的的细细胞胞按按密密度度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。材料材料 1、淋淋巴巴细细胞胞分分层层液液（葡葡蔗蔗糖糖

3、-泛泛影影葡葡胺胺，比比重重为为1.0770.001g/L）2、2台盼蓝染液台盼蓝染液 3、Hanks液或者液或者RPMI-1640培养基培养基 4、试管、吸管、水平离心机等、试管、吸管、水平离心机等 方法方法 1、无菌采集静脉血、无菌采集静脉血2ml注入盛有注入盛有2ml Hanks液液（含（含100u/ml肝素）的试管中，混匀。肝素）的试管中，混匀。2、吸吸取取淋淋巴巴细细胞胞分分层层液液2ml加加入入离离心心管管中中，再再将将稀稀释释抗抗凝凝血血液液小小心心沿沿管管壁壁加加至至分分层层液液上上，应应注注意保持两者界面清晰。（关键）意保持两者界面清晰。（关键）3、室温、室温2000rmin

4、离心离心20min。管内可分为四层。管内可分为四层。4、用用毛毛细细吸吸管管轻轻轻轻吸吸出出乳乳白白色色的的单单个个核核细细胞胞，加加入入另另一一支支已已含含有有2-5mlHanks液液的的离离心心管管中中，混混匀。匀。5、室温下，、室温下，1500rpm离心离心10min。6、弃上清，重复洗涤一次。、弃上清，重复洗涤一次。用用完完全全RPMI-1640 1ml定定容容，计计数数细细胞胞，调调整整细细胞浓度。胞浓度。一般每一般每ml血可分离出血可分离出1-2106个单个核细胞。个单个核细胞。7、细胞活力检查、细胞活力检查 取取1滴滴细细胞胞悬悬液液加加1滴滴2%台台盼盼蓝蓝染染液液，作作湿湿片

5、片高高倍倍镜镜检检，计计算算活活细细胞胞百百分分率率。活活细细胞胞不不着着色色，死死细胞染成蓝色。一般活性应在细胞染成蓝色。一般活性应在95以上。以上。材材 料料1.Ag PBMC2.Ab1 兔抗人白细胞血清兔抗人白细胞血清(Ab1)3.Ab2 FITC-抗兔单克隆抗体抗兔单克隆抗体(Ab2)4.洗涤液洗涤液5.荧光显微镜荧光显微镜方方 法法1.制备抗原片制备抗原片:吸管取吸管取1滴滴PBMC液体（约液体（约10ul）滴加到标本片）滴加到标本片黑色圈圈背面中央黑色圈圈背面中央,静止静止5-10分钟，待分钟，待PBMC干干燥。燥。2.15 ul Ab1 加入玻片上加入玻片上37孵育孵育30 min。PBS洗洗3次次(3min/次次)。3.玻片上加玻片上加15 ml 荧光二抗荧光二抗(Ab2)湿盒内湿盒内37孵育孵育30 min。PBS洗洗3次次(同上同上,避光操作避光操作)4.用吸水纸印干玻片，滴油，荧光镜显微镜下观察。用吸水纸印干玻片，滴油，荧光镜显微镜下观察。结结 果果在荧光显微镜下呈绿色荧光者为阳性。在荧光显微镜下呈绿色荧光者为阳性。