基因工程第八章精选PPT.ppt

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1、基因工程第八章基因工程第八章第1页，此课件共49页哦一、粘性末端的连接一、粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的连接酶把相互靠近的5端磷酸端磷酸与与3-OH连到一起。连到一起。第一节 DNA片段的体外连接1.两段DNA的连接依靠粘性末端依靠粘性末端2.DNA片断与载体的连接依靠粘性末端依靠粘性末端第2页，此课件共49页哦二、齐平末端（blunt end）的连接5端与端与3端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。1.直接连接直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的粘性末端的1%。5 5

2、 5 5 3 3 3 3-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5 3-OH-PP-HO-5 3 第3页，此课件共49页哦1972年，斯坦福大学的年，斯坦福大学的P.Labban和和P.Kaiser提提出。出。（1）同聚加尾）同聚加尾 法法 2.人工加尾形成“粘性末端”DNA末端转移酶末端转移酶能在没有模板的情况下给能在没有模板的情况下给DNA的的3-OH端端加加上脱氧核苷酸。上脱氧核苷酸。原理：原理：分别给载体和插入片断加上分别给载体和插入片断加上互补的互补的核苷酸。核苷酸。加尾加尾碱基互补碱基互补第4页，此课件共49页哦缺点缺点：优点优点：能把任何片段连接起来能把任何片段连接起来不能把插入

3、片段再切下来。不能把插入片段再切下来。第5页，此课件共49页哦用用T4 DNA连接酶连到平端连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。一个人工粘性末端。（2）衔接物(linker)连接 linker用化学合成法合成的一段用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别的特定限制性内切酶识别位点序列的位点序列的平端双链平端双链。GGAATTCC CCTTAAGGEcoRI linker：linker的作用的作用第6页，此课件共49页哦缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整

4、的插入如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段片段2）能给载体连接上）能给载体连接上Polylinker:优点：第7页，此课件共49页哦（3）DNA接头(adapter)连接法1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。年康内尔大学的吴瑞教授发明。5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p5 BamHI adapter用用T4DNA连接酶连到连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末分子的两端，直接成为人工粘性末端。端。adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。adapter的作用的作用第8页，此课件共49页哦Blu

5、nt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P5p-GATCCCGG-GGCC-CCGG-GGCCCTAG-P5 5p-GATCCCGG-GGCC-CCGG GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC-P5 接头自我连接接头自我连接第9页，此课件共49页哦接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片片段的连接。段的连接。优点：优点：连上后就能用。连上后就能用。缺点：缺点：先用小牛肠先用小牛肠碱性磷酸酶碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其）处理接

6、头，水解掉其5端的磷酸，端的磷酸，防止自我连接。防止自我连接。（以后再用（以后再用T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶加上磷酸。）加上磷酸。）防止自我连接防止自我连接第10页，此课件共49页哦5p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5 CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5 接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！5GATCCCGG-OH HO-GGCC5 5CCGG-OH HO-GGCCCTAG5 CIP处理处理-OHHO-第11页，此课件共49页哦Blunt-ended DNA5p-G

7、ATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P 5GATCCCGG-HO-GGCC CCGG-OH-GGCCCTAG5 5GATCCCGG-OH3 HO-GGCC5 缺口缺口缺口缺口HO-OHCIP处理处理T4 ligase虽然有缺口，但仍然能与虽然有缺口，但仍然能与DNADNA片断连接。片断连接。第12页，此课件共49页哦三、PCR产物的连接1.在引物的在引物的5端设计酶切位点端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；符合载体的多克隆位点；（1）设计原则）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构）带酶切位点的引物的结构3端端1520bp与模板互补；与模板互补；5端端61

8、0bp是某个内切酶的识别序列。是某个内切酶的识别序列。（5端多余的端多余的35bp属属保护碱基保护碱基）避免与所扩增的避免与所扩增的DNADNA片断内部酶切位点重复。片断内部酶切位点重复。第13页，此课件共49页哦引物1GCAGAATTC 互补序列互补序列模板模板EcoRI位点位点5-3 GCAGAATTC 互补序列互补序列5-3 3 模板模板GCAGAATTC 互补序列互补序列 PCR产物产物5-3 3 复性复性延伸延伸模板模板模板模板3 3 第14页，此课件共49页哦GCTAGCCGG 互补序列互补序列模板模板BamH I 位点位点-5 3-5 复性复性延伸延伸模板模板模板模板3 3 GC

9、TAGCCGG 互补序列互补序列-5 3-模板模板5 GCTAGCCGG PCR产物产物 互补序列互补序列-5 3-引物2第15页，此课件共49页哦带酶切位点的PCR产物GCAGAATTC PCR产物产物5-3 GCTAGCCGG PCR产物产物-5 3-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位点位点BamHI位点位点AATTC PCR产物产物5-3 GCTAG PCR产物产物-5 3-GCEcoRIBamHI两头各有一个粘性末端！两头各有一个粘性末端！第16页，此课件共49页哦2.与T载体直接连接（1）PCR产物两个产物两个3端一般都有一个端一般都有一个ATaq DNA聚合酶的特性：

10、在聚合酶的特性：在DNA双链的双链的3端再加上一端再加上一个多余的核苷酸（优先加个多余的核苷酸（优先加A）。）。（2）T载体的两个载体的两个3端人为地各加一个端人为地各加一个T利用利用Taq DNA聚合酶，当原料中只有聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫时，被迫在平端载体上添加在平端载体上添加T！第17页，此课件共49页哦AAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶聚合酶载体载体PCR产物产物TATA第18页，此课件共49页哦四、四、DNA体外连接应注意的事项体外连接应注意的事项1.插入片断与载体的酶切位点互补插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。相同的粘性末端才能有效地连

11、接。尽量避免平端连接。尽量避免平端连接。决不能进行非粘性末端连接。决不能进行非粘性末端连接。第19页，此课件共49页哦EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生都产生GATC4个碱基的粘性末端。个碱基的粘性末端。第20页，此课件共49页哦2.DNA插入的方向正确（1）用双酶切）用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI第21页，此课件共49页哦3.插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1

12、）DNA定向插入定向插入（2）起始密码）起始密码尤其当尤其当载体上有载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。起始密码的时候，更要注意。ATGGAATTC载体载体ATGCGGAATTCT插入片断插入片断EcoRIEcoRIATGGAATTC T重组重组但移码突变！但移码突变！第22页，此课件共49页哦4.防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的载体切口的5磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片

13、断以单链连接。片断以单链连接。5 3 载体载体插入片断插入片断第23页，此课件共49页哦1.载体自身环化连接（能存活）载体自身环化连接（能存活）2.载体之间互相连接（能存活）载体之间互相连接（能存活）3.插入片段互相连接（不能存活）插入片段互相连接（不能存活）4.一个载体与几个插入片段重组（能存活）一个载体与几个插入片段重组（能存活）五、载体和外源五、载体和外源DNA插入片段的连接结果插入片段的连接结果5.几个载体与一个插入片段重组（能存活）几个载体与一个插入片段重组（能存活）第24页，此课件共49页哦1.目的目的增加受体菌细胞膜的通透性。增加受体菌细胞膜的通透性。第二节 重组体导入细菌细胞一

14、、感受态大肠杆菌的制备一、感受态大肠杆菌的制备第25页，此课件共49页哦使用丧失了使用丧失了限制体系限制体系的大肠杆菌。如的大肠杆菌。如K12系列的大肠系列的大肠杆菌。杆菌。2.菌种用用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理第26页，此课件共49页哦4.制备过程培养大肠杆培养大肠杆菌菌OD600至至0.3-0.4On ice 5-10 min4离心收集离心收集菌菌用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬4离心收集菌离心收集菌4离心收集离心收集菌菌分装、分装、-70 冻存冻存用冰冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬On ice 30 min用冰

15、冷的用冰冷的60mMCaCl2重悬重悬第27页，此课件共49页哦二、重组DNA导入大肠杆菌（1）转化（）转化（transformation)大肠杆菌捕获大肠杆菌捕获质粒质粒DNA的过程。的过程。（2）转染（）转染（transfection)大肠杆菌捕获大肠杆菌捕获噬菌体噬菌体DNA的过程。的过程。1.外源外源DNA导入细菌的几种方法导入细菌的几种方法（3）转导（）转导（transduction)借助借助噬菌体噬菌体把外源把外源DNA导入细菌的过程。导入细菌的过程。第28页，此课件共49页哦每每 gDNA转化成功的细菌克隆数。转化成功的细菌克隆数。3.转化方法转化方法 2.转化率简单简单，但转化

16、效率不高（，但转化效率不高（106-108/gDNA）。）。（1）热休克法（heat shock）转化效率高（高于转化效率高（高于109/gDNA）。）。（2）电转化法第29页，此课件共49页哦10ng载体载体DNA100 L感受态感受态菌菌 On ice混合，混合，静置静置10分钟分钟42C 1分钟分钟加入加入1mL LB培培养基养基37摇摇1小时小时10-100 L转化液涂转化液涂含抗菌素的平板含抗菌素的平板吸附吸附DNA摄入摄入DNA（1）热休克法第30页，此课件共49页哦LB培养受体菌至培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴冰浴15分钟，分钟，2C离心离心集菌集菌冰冷的水重悬菌冰冷

17、的水重悬菌体体2C离心集离心集菌菌冰冷的水重悬冰冷的水重悬菌体菌体2C离心收集离心收集菌体菌体少量冰冷的水少量冰冷的水重悬重悬分装成分装成 50-300 L 电转仪调为电转仪调为2.5kV,25 F 脉冲控制器脉冲控制器200-400 0.5 g质粒质粒DNA On ice混混合合加入加入1mLSOC培养培养液液37C中速震荡中速震荡60分钟分钟10-100 L转化液涂含抗菌素转化液涂含抗菌素的平板的平板转化转化（2）电转化法第31页，此课件共49页哦4.平板培养基培养细菌10-100 L转化液转化液涂于含抗菌素涂于含抗菌素的平板的平板37过夜过夜第32页，此课件共49页哦环形重组质粒环形重组

18、质粒 质粒自我连接质粒自我连接线性载体或线性载体或DNADNA片断进入细菌会被降解。片断进入细菌会被降解。环形质粒数环形质粒数（1）重组质粒 5.影响转化率的因素第33页，此课件共49页哦生长状态生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。必须在冰冷的条件下制备。必须在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。储存感受态菌要在储存感受态菌要在-70以下以下CaCl2处理处理使用感受态菌时必须迅速融化使用感受态菌时必须迅速融化融化后一般不能再次冻存使用。融化后一般不能再次冻存使用。（2）感受态细胞 （competen

19、t cells)第34页，此课件共49页哦把重组的噬菌体把重组的噬菌体 DNA或或Cosmid质粒质粒DNA包装成具有感染能力包装成具有感染能力的的 噬菌体颗粒。噬菌体颗粒。6.体外包装的噬菌体的转导（1）体外包装（）体外包装（in vitro packaging）（2）转导（）转导（transduction）通过受体菌细胞表面的通过受体菌细胞表面的 DNA接受器位点（接受器位点（receptor site)，使带有外源基因的重组体，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩注入受体大肠杆菌进行扩增。增。第35页，此课件共49页哦cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染基因是个温

20、度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在细菌后，在32下培养细菌时能够保持溶源性。下培养细菌时能够保持溶源性。但当温度升高到但当温度升高到4445时，就会导致时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、外壳复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。蛋白合成。便于提取外壳蛋白。（3）cI857基因突变的噬菌体 但由于该噬菌体的但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，所以细菌还不裂基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。解。第36页，此课件共49页哦cI857其它基因其它基因溶源状态（溶源状态（DNA不转录、不翻译）不转录、不翻译）DNA阻遏阻遏 蛋白蛋白阻遏阻遏 蛋白蛋白4445

21、 DNA转录、翻译合成外壳蛋白转录、翻译合成外壳蛋白32第37页，此课件共49页哦 噬菌体噬菌体1外壳蛋白基因外壳蛋白基因E发生了无义突变，发生了无义突变，不能合成头部蛋白不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。在在cI857基因突变的基因突变的 噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型突变型 噬菌体。噬菌体。（4）互补型噬菌体互补型噬菌体 外壳蛋白基因外壳蛋白基因D发生了无义突变，发生了无义突变，不能合成头部的包装不能合成头部的包装识别蛋白识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋，但能合成其它外壳蛋白（头部、

22、尾部蛋白）。白）。噬菌体噬菌体2第38页，此课件共49页哦体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每 g DNA能形成能形成106噬菌斑）。噬菌斑）。（5）转导 第39页，此课件共49页哦转化率高的菌株；转化率高的菌株；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；不育的菌株（不会与其他酵母接合）。不育的菌株（不会与其他酵母接合）。第三节 外源基因导入真核细胞一、导入酵母细胞一、导入酵母细胞1.菌株选择菌株选择如：如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu

23、2-112,his31第40页，此课件共49页哦（1）利用原生质球进行转化）利用原生质球进行转化 2.酵母的转化方法 酵母酵母原生质体原生质体感受态感受态酶去壁酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因插入外源基因 的酵母载体的酵母载体PEG（聚乙二醇）使（聚乙二醇）使细胞壁细胞壁具有通透性，允许具有通透性，允许DNA进入。进入。CaCl2使使细胞膜细胞膜具有通透性，允许具有通透性，允许DNA进入。进入。转化转化第41页，此课件共49页哦 酵母酵母0.1mol/L LiCl处理处理插入外源基因的酵母载体插入外源基因的酵母载体感受态感受态40%PEG 4000（2）利用Li+盐进行转化第42页，此课件

24、共49页哦叶盘叶盘消毒消毒切取切取土壤农杆菌浸土壤农杆菌浸泡泡看护培养基看护培养基愈伤组织愈伤组织分化幼苗分化幼苗二、导入植物细胞1.叶盘法（叶盘法（leaf disk)第43页，此课件共49页哦植物细胞植物细胞原生质体原生质体纤维素酶和果胶纤维素酶和果胶酶酶DNA混合入电击缓冲混合入电击缓冲液液1-2kV,3-25 F电击电击愈伤组织愈伤组织幼苗幼苗分化分化2.电击法（electroporation)第44页，此课件共49页哦又称高速微型子弹射击法（又称高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles)DNA1.2 m钨弹头钨弹头 吸附吸附特制手枪特制手枪射击

25、植物射击植物装入装入3.基因枪法（gene gun）4.脓杆菌（脓杆菌（agrobacterium）介导）介导（详见另外章节）（详见另外章节）第45页，此课件共49页哦（1）原理：）原理：三、导入哺乳动物细胞1.磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法HEPES缓冲盐水与含有氯化钙和缓冲盐水与含有氯化钙和DNA的的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和DNA的沉淀。的沉淀。依据不同的细胞类型，平皿上最多能有依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞的细胞能吸收能吸收DNA沉淀。沉淀。不需要载体。不需要载体。（2）特点：第46页，此课件共49页哦脂质体有商业试剂盒（如脂质体有商业试剂盒

26、（如Life Technologies）。）。2.脂质体（lipofectin）载体法脂类包埋脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。，通过细胞膜进入细胞。直接把外源直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。3.显微注射法(microinjection)第47页，此课件共49页哦二乙氨乙基（二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡）葡萄糖能促进哺乳动物细胞摄入外源萄糖能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。4.DEAE-葡萄糖传染法吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNADNA可以进可以进入到细胞核里。入到细胞核里。第48页，此课件共49页哦DEAE-dextran(葡聚糖葡聚糖)细胞细胞外源外源DNA预处理预处理摄入摄入DEAE-dextran外源外源DNA细胞细胞混合混合DEAE-dextran对细胞有毒对细胞有毒!5.病毒（病毒（virus）介导）介导（略）（略）第49页，此课件共49页哦