色谱知识介绍.pptx

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1、 反相分配色谱 极性:固定相 流动相固定相-极性流动相(己烷,庚烷)-非极性极性物质后出峰正相色谱正相色谱 20%反相色谱反相色谱80%正相&反相色谱第1页/共37页 硅胶基质-pH 38 Al2O3.nH2O-pH114 聚合物基质-pH114高或低高或低pH下下,硅胶会溶解硅胶会溶解化学修饰困难化学修饰困难孔结构复杂孔结构复杂,孔径不均匀导致柱效不够高孔径不均匀导致柱效不够高,有有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损柱填料基质第2页/共37页硅胶纯度 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度色谱柱尺寸 填料床的长度和内径颗粒形状 球型或不规则型粒径 平均颗粒直径,通

2、常3-10m表面积 颗粒外表面和内部孔表面的总和,以m2/gram表示孔径 颗粒的孔或腔的平均尺寸,范围80-300 色谱柱物理性质C-18柱-性能影响因素第3页/共37页键合类型 单体键合-键合相分子与基体单点相连 聚合体键合-键合相分子与基体多点相连碳覆盖率 键合相的键合量常用含碳量(C%)来表示，也可以用覆盖度来表示。所谓覆盖度是指参与反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。封端 键合步骤之后,用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来色谱柱化学性质C-18柱-性能影响因素第4页/共37页A类硅胶Original ZORBAX SIL(1970s)由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量

3、高(硅羟基的pKa低),导致碱性化合物发生拖尾B类硅胶(高纯)ZORBAX Rx-Sil(1987)由于金属含量低,硅羟基pKa高,碱性化合物不发生拖尾C-18柱-性能影响因素第5页/共37页色谱柱尺寸-对色谱分离的影响 短柱(15-100mm)-运行时间短,柱压低 长柱(150-250mm)-分辨率高,运行时间长 窄径柱(2.1mm)-检测器灵敏度高 宽径柱(3-21.2mm)-载样量高C-18柱-性能影响因素第6页/共37页颗粒形状 -对色谱分离的影响 当使用黏度较大的流动相50:50=MeOH:H2O时,球型颗粒可以降低柱压,延长色谱柱寿命C-18柱-性能影响因素球形球形不规则形不规则形

4、粒径 -对色谱分离的影响 较小的颗粒柱效较高,但会引起柱压过高.3.5m粒径的常用于分离复杂的多组份样品,而组份单一的样品多采用5m的粒径1.8m 3.5 5m 7m 10m 第7页/共37页表面积 -对色谱分离的影响 高表面积对于多组份样品的分离具有较强的保留能力,柱容量和分离度.表面积低的填料通常能迅速达到平衡状态,对于梯度淋洗尤为重要C-18柱-性能影响因素孔径 -对色谱分离的影响 大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞留的时间,达到充分分离,改善峰形样品 MW 4,000,选择 80 的孔径样品 MW 4,000,选择 300 的孔径第8页/共37页键合类型 -对色谱分离的影响

5、单齿键合：提高传质速率,加快色谱柱平衡双齿键合：增加色谱柱稳定性,增加色谱柱的载样量C-18柱-性能影响因素CHCHCHCHCHCHOSiOOOOSiSiSiCHCHCHCHCHCHSi333333333333SiSiOOSiSiOO第9页/共37页碳覆盖率-对色谱分离的影响 高碳覆盖率：提高分辨率,分析时间长低碳覆盖率：缩短运行时间封端 -对色谱分离的影响 封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象对于极性样品,未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异C-18柱-性能影响因素第10页/共37页 固定相键合固定相键合二甲基硅烷二甲基硅烷 封端四甲基硅烷SiO

6、OHOOCH3SiRCH3CH3SiCH3CH3SiRCH3R=C8,C18,etc.OOHOHOCH3SiRCH3CH3SiRCH3+ClCH3SiCH3CH3OHOHOHOHCH3ClRCH3(TMS)传统键合及封端技术 第11页/共37页键合相种类化学键合相按键合官能团的极性分为极性和非极性键合相两种。极性键合相：氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)常用作正相色谱，极性强的组分保留值较大。极性键合相有时也可作反相色谱的固定相。非极性键合相：各种烷基(C1C18)和苯基、苯甲基，极性弱的组分保留值较大。第12页/共37页HPLC-色谱柱与pH的关系StableBond C1

7、8 pH 18 Bonus-RP pH 29 Extend C18 pH 211.5 Eclipse XDB C18 pH 29（可用于100%全水相）未封端双封端三封端双封端第13页/共37页HPLC-保留值与pH的关系 pH变化值变化值0.1RS变化值变化值1.6色谱柱：色谱柱：Zorbax StableBond C18 4.6 X 250mm,5um流动相：流动相：27%甲醇：甲醇：73%磷酸磷酸pH 2.5&2.6温度：温度：500C流速：流速：1.0mL/min.邻氯苯胺（pKa2.636)第14页/共37页12346 750123456Time(min)01234561234675

8、Time(min)pH 7.00pH 7.25色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C8 4.6 x 75 mm,3.5 m流动相:44%25 mM磷酸,pH 7.00:56%甲醇流速:1.0 mL/min 温度:25C 检测:UV 250 nm可电离的组份的分离可能会随可电离的组份的分离可能会随pH变化发生显著变化变化发生显著变化 甚至很小的甚至很小的 0.050.25 个个pH变化单位变化单位.样品:1.ketoprofen 2.ethyl paraben 3.Hydrocortisone 4.fenoprofen 5.propyl paraben 6.Propranolol (游

9、离碱pka 9.5）7.ibuprofenHPLC-保留值与pH的关系0.25 个pH第15页/共37页HPLC-保留值与pH的关系pH变化：变化：0.2个个pH(7.07.2)保留时间改变：保留时间改变：1.2分钟分钟(13.614.8分钟分钟)保留时间随保留时间随pH改变不明显改变不明显保留时间随保留时间随pH改变改变不明显不明显(酸性环境中酸性环境中)（PKa：2.98）（PKa：10.1）第16页/共37页保留时间酸性组份酸性组份中性组份碱性组份 方法稳定区方法稳定区 方法波动区方法波动区(pKa+1.5)方法稳定区方法稳定区HPLC-保留值与pH的关系第17页/共37页复杂组分的流动

10、相pH选择技巧色谱柱色谱柱:ZORBAX Extend-C184.6 x 150 mm,5 mm 流动相流动相:30%缓冲液缓冲液:70%MeOH pH 7 缓冲液缓冲液20 mM Na2HPO4 pH 11缓冲液缓冲液 20 mM TEA 流速流速:1.0 mL/min 温度温度:RT检测器检测器:UV 254 nm0 512,345Time(min)76Extend-C18pH 71.Maleate 马来酸盐 2.Scopolamine 东莨菪碱 pKa 7.6 3.PseudoEphedrine 假麻黄碱 pKa 9.8 4.Doxylamine 抗敏安(多西拉敏)pKa 9.2 5.C

11、hlorpheniramine 氯苯吡胺pKa 9.1 6.Triprol内径ine 苯丙烯啶pKa 6.5 7.Diphenhydramine 苯海拉明 pKa 9.0Extend-C18pH 110 5 101234Time(min)657 高pH下,碱性成分的保留增加待测物pKa+1.5以外的流动相pH可保证方法的稳定性第18页/共37页样品溶剂溶解强度 样品溶剂溶解能力强于流动相导致色谱峰峰形问题：裂分峰或宽峰色谱柱:ZORBAX StableBond SB-C8,4.6 x 150 mm,5 mm 流动相:82%H2O:18%ACN进样体积:30 mLA.样品溶剂100%乙腈0 10

12、Time(min)12B.样品溶剂流动相0 10Time(min)12样品:1.Caffeine(咖啡因)2.Salicylamide(水杨酰胺)第19页/共37页中性分析时为何要使用缓冲液？色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C8,4.6 x 75 mm,3.5 m 流动相:44%A:56%甲醇流速:1.0 mL/min 温度:25C 检测:UV 250 nm含缓冲液的流动相可改善保留,分离和色谱峰峰形.样品:1.ketoprofen 2.ethyl paraben 3.hydrocortisone 4.fenoprofen 5.propyl paraben 6.propranol

13、ol 7.ibuprofenA=pH 7.0水水A=pH 7.0 水水+25 mM 磷酸缓冲液磷酸缓冲液012345Time(min)1234675012341,4,6,7235Time(min)第20页/共37页0 2.5 5.0 7.5Time(min)1234560 2.5 5.0Time(min)123456增加缓冲液浓度减少拖尾色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C84.6 x 150 mm,5 mm流动相:40%磷酸盐缓冲液60%ACN流速:1.5 mL/min.温度:40CUSP Tf1.1.622.1.653.1.634.1.775.1.836.1.1210 mM 磷

14、酸盐pH 7.0USP Tf1.1.412.1.503.1.334.1.395.1.366.1.0025 mM 磷酸盐pH 7.0 在中等在中等pH下下,离子强度较高离子强度较高,能有效掩蔽硅羟基的二次作用减少拖尾能有效掩蔽硅羟基的二次作用减少拖尾样品:Tricyclic Antidepressants（三环抗抑郁剂）1.Desipramine（脱甲丙咪嗪）2.Nortriptyline（去甲替林）3.Doxepin（多塞平）4.Imipramine（丙咪嗪）5.Amitriptyline（阿米替林）6.TrImipramine（三甲丙咪嗪）第21页/共37页三乙胺对碱性成分峰形的影响0 2.

15、5 5.0Time(min)12345色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C8,4.6 x 150 mm,5 mm 流动相:85%25 mM Na2HPO4:15%ACN 流速:1.0 mL/min.温度:35CUSP TF 5%1.1.292.1.333.1.634.2.355.1.57No三乙胺10 Mm三乙胺USP TF 5%1.1.192.1.183.1.204.1.265.1.14Time(min)0.02.55.035421pH 7样品:1.Phenylpropanolamine（去甲麻黄碱）2.Ephedrine（麻黄素）3.Amphetamine（苯丙胺）4.Meth

16、Amphetamine（脱氧麻黄碱）5.Phenteramine （苯丁胺）第22页/共37页竞争酸对酸性组分的峰形的影响色谱柱:ZORBAX StableBond SB-C18 4.6 x 150 mm,5 mm流动相:40%A:60%ACN流速:1.0 mL/min.温度:室温样品:Ibuprofen（异丁苯丙酸）pKa 4.4pH 35 mM NaH2PO4Tf=1.8pH 35 mM NaH2PO41%乙酸pH 2.55 mM NaH2PO40.1%三氟乙酸Tf=1.0Tf=1.09A:乙酸和三氟乙酸均能作为竞争酸填加至流动相中乙酸和三氟乙酸均能作为竞争酸填加至流动相中 三氟乙酸由于所

17、需浓度较低三氟乙酸由于所需浓度较低,可作为首选可作为首选第23页/共37页液相分析-小诀窍1.提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）2.减小柱内径，可增加柱效（提高灵敏度）3.缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度）4.减小柱外体积，可增加柱效（提高灵敏度）5.使用超纯硅胶，可增加柱效（提高灵敏度）6.使用高能量氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）7.使用中孔透光氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）8.改变流动相pH，可增加柱效（提高灵敏度）9.改变有机相%，可增加柱效（提高灵敏度）10.改变键合相，可增加柱效（提高灵敏度）11.改变有机添加剂，可增加柱效（提高灵敏度）12.改变流动相配比方式，可增加柱效

18、（提高灵敏度）第24页/共37页样品:除草剂流动相:52/48 0.1 M乙酸钠/甲醇,pH 6流速:0.45 mL/min温度:40,90检测:UV柱温的影响柱温的影响1.西玛津2.敌草隆3.扑灭津4.扑灭净5.异丙甲草胺液相色谱柱:Zorbax StableBond-C18色谱柱尺寸:4.6 x 150 mm,5m4090提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）第25页/共37页液相色谱柱:Zorbax StableBond-C8色谱柱尺寸:150 mm,5m减小毛细管内径来提高减小毛细管内径来提高低浓度样品的检测灵敏度低浓度样品的检测灵敏度流动相:60%乙腈/40%水流速:内径 0.3 mm-

19、4 uL/min内径 0.5 mm-10 uL/min内径 1.0 mm-50 uL/min内径 4.6 mm-1.0 uL/min温度:室温检测器:UV 254 nm样品:200 ng联二苯(100 nl)减小柱径，可增加柱效（提高灵敏度）第26页/共37页色谱柱使用小体积色谱柱对于检测器响应时间的重要性(TE32)液相色谱柱:ZORBAX StableBond-C18色谱柱尺寸:4.6 x 15 mm 3.5m流动相:乙腈:1%甲酸=32:68UV:254 nm流速:1.0 mL/min.30C进样量:5 L响应时间:4.0秒响应时间:2.0秒响应时间:1.0秒响应时间:0.5秒响应时间:

20、0.1秒1.尿嘧啶尿嘧啶2.乙酰水杨酸乙酰水杨酸3.N-乙酰苯胺乙酰苯胺缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度）第27页/共37页色谱柱不同硅胶类型比较(TE1)流动相:含0.05%甲醇的二氯甲烷 液相色谱柱Zorbax SilSpherisorbZorbax Rx-Sil1.甲苯2.N-苯甲酰苯胺3.苯酚4.苯甲醇使用高纯硅胶，可增加柱效（提高灵敏度）第28页/共37页pH对苯胺取代物分析的影响流动相25mM磷酸:甲醇=58:42 流速:1 mL/min 22C液相色谱柱:ZORBAX StableBond-C18色谱柱尺寸:4.6 x 150 mm 5m1.对位甲氧基苯胺2.间位苯甲胺

21、(苯甲胺PKb=9.15)3.3-氨基-苯甲腈4.对位氯苯胺5.间位氯苯胺6.邻位氯苯胺（pka=2.636）pH:2.5pH:7.0改变流动相pH，可增加柱效（提高灵敏度）第29页/共37页三氟乙酸浓度对于反相肽的分离的影响(B10)流动相:A:水和三氟乙酸B:乙腈和三氟乙酸0-30%B（30 min.内）流速:1 mL/minUV:254 nm进样量:6uL十肽菌素标样S1-S5（疏水性有略微差异）40C液相色谱柱:ZORBAX 300 SB-C8色谱柱尺寸:4.6 x 150 mm 5m1.0%三氟乙酸0.05%三氟乙酸0.25%三氟乙酸改变流动相pH，可增加柱效（提高灵敏度）第30页/

22、共37页有机改性剂和pH对于选择性的影响流动相:25 mM磷酸缓冲液流速:1.0 mL/min.22C液相色谱柱:ZORBAX StableBond-CN色谱柱尺寸:4.6 x 150 mm 5m1.甲氧基苯胺2.间位苯甲胺3.4-氯-苯胺4.3-氨基苯甲腈5.3-氯-苯胺6.2-氯-苯胺42%甲醇甲醇：58%缓冲液缓冲液 30%甲醇甲醇：70%缓缓冲液冲液pH 2.6pH 3.0改变有机相%，可增加柱效（提高灵敏度）第31页/共37页色谱柱的选择性液相色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl色谱柱尺寸:4.6 x 150 mm 5m流动相:甲醇:水=70:30UV:254

23、nm流速:1.0 mL/min.室温Zorbax Eclipse XDB-苯基Zorbax Eclipse XDB-C8Zorbax Eclipse XDB-C181.尿嘧啶尿嘧啶2.苯酚苯酚3.4-氯氯-硝基苯硝基苯4.甲苯甲苯5.萘萘改变键合相，可增加柱效（提高灵敏度）第32页/共37页流动相对色谱的影响液相色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C8色谱柱尺寸:4.6 x 50 mm 3.5mUV:254 nm流速:1 mL/min.室温1.尿嘧啶尿嘧啶2.尼帕尔金丁酯尼帕尔金丁酯3.萘萘4.二丙基邻苯二甲酸酯二丙基邻苯二甲酸酯5.苊苊刻度混合:Dial-a-Mix A:水 B:甲

24、醇,用泵抽取50%B体积比混合:Vol/Vol250 mL水+250 mL甲醇,用泵抽取100%混合液定容混合:Mix-to-Mark 250 mL甲醇,用水定容至500 mL,用泵抽取100%混合液预混合（重量比混合）:Premixed(w/w)200 g甲醇+200 g水,用泵抽取100%混合液改变流动相配比方式，可增加柱效（提高灵敏度）第33页/共37页反相HPLC常用缓冲液 缓冲液pKapH范围磷酸盐pK12.11.13.1柠檬酸盐pK13.12.14.1甲酸盐3.82.8 4.8 柠檬酸盐pK24.73.75.7 乙酸盐4.83.85.8 柠檬酸盐pK35.44.46.4 磷酸盐pK

25、27.26.28.2羟甲基甲胺8.37.39.3 氨9.28.210.2 硼酸盐9.28.210.2 甘氨酸9.88.810.8 1-甲基-哌啶10.39.311.3 四氢化吡咯10.59.511.5 二乙胺10.59.511.5 三乙胺10.79.711.7 磷酸盐pK312.311.313.3pH 2.5磷酸 0.1%三氟乙酸 0.1%第34页/共37页鬼峰产生原因及解决方法1.样品瓶中残留更换清洗方法2.低极性物质未洗脱，上一针的残留增加有机相比例或进样时间3.滤膜带入离心或换不同的滤膜4.流动相脱气不完全流动相配置好后预先超声脱气5.操作问题流动相配置过程中受到污染或者样品溶剂与流动相极性或者pH相差太大6.梯度变化过快（一般末端吸收）变缓或尽量减少两种流动相之间的差距第35页/共37页鬼峰产生原因及解决方法7.试剂问题甲醇、乙腈、水、缓冲液流动相中的杂质，当梯度开始时由于有机相比例不高，洗脱能力不强，杂质在色谱柱柱头富集，随着流动相比例变化，洗脱能力增强，富集的杂质被洗脱，从而形成鬼峰。Procedure.docx第36页/共37页感谢您的观看！第37页/共37页