植物愈伤组织培养.pptx

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1、本章主要内容 植物愈伤组织及形成过程 植物愈伤组织与遗传变异 植物愈伤组织培养条件与定向变异第1页/共61页第一节 植物愈伤组织及形成过程 植物愈伤组织的概念 植物愈伤组织的形态结构 植物愈伤组织的形成过程 植物愈伤组织的继代培养第2页/共61页一、植物愈伤组织的概念愈伤组织(callus)，原是指植物在伤口表面形成的一团薄壁细胞。在组织培养中，愈伤组织指在人工培养基上由外植体组织的增生细胞产生的一团不定形的疏松排列的薄璧细胞。通过愈伤组织培养再分化产生再生植株是植物组织培养的主要形式之一。几乎所有高等植物的各种器官，如根、茎、叶和花等，以及各种组织，如皮层、茎髓和形成层等，离体后在适当条件下

2、都能产生愈伤组织。第3页/共61页愈伤组织第4页/共61页愈伤组织诱导不定芽第5页/共61页不定芽的生根培养第6页/共61页二、植物愈伤组织的形态结构愈伤组织是许多异质细胞集合而成的一个无一定形态结构的细胞聚集体。根据其性质和细胞组成的特点，可以分为致密和松脆两种结构类型。松脆愈伤组织都有大量的分生组织中心，进行活跃的细胞分裂，愈伤组织内有大量的细胞间隙，细胞排列完全无序。坚实致密愈伤组织内无大的细胞间隙，而由管状细胞组成维管组织。第7页/共61页植物愈伤组织的形态结构第8页/共61页优良的愈伤组织通常必须具备以下特性:高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到再生植株。容易散碎，以便用这

3、些愈伤组织建立优良的悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性原生质体。旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。经过长期继代保存而不丧失胚性，以便有可能对它们进行各种遗传操作。第9页/共61页三、植物愈伤组织的形成过程从单细胞或一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历4个时期:诱导期分裂期形成期分化期第10页/共61页1、诱导期(起动期)诱导期(induction stage)是细胞准备进行分裂的时期,通过一些刺激因素和激素的诱导作用，使处在静止状态的细胞合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸物质的合成。此期间细胞的大小变化不大。诱导期的长短和诱导分裂的难易程度，因植物种

4、类、外植体的生理状况和外部因素而异。外源生长调节物质对诱导细胞开始分裂效果最好，最常用的有2,4-D、NAA、IAA和细胞分裂素等。第11页/共61页2、分裂期分裂期(division stage)是不断增生子细胞的过程。其特征是:细 胞 分 裂 快，结 构 疏 松，缺 少 有 组 织 的 结构，颜色浅而透明。主要表现如下:细胞的数目迅速增加。每个细胞平均鲜重下降。细胞体积小，细胞内无液泡 细胞核和核仁增至最大 细胞中RNA含量减少，而DNA含量保持不变。组织的总干重、蛋白质和核酸含量大大增加，新细胞壁的合成极快。第12页/共61页3、形成期形成期(formation stage)是指外植体的

5、细胞经过诱导、分裂形成了无序结构的愈伤组织的时期。这一时期愈伤组织内细胞有以下特点是:大而不规则、高度液泡化，整个组织是比较松散的。表面以下约510个细胞是细胞生长的中心这些中心是愈伤组织的主要生长部位。第13页/共61页3、形成期若诱导条件不同，愈伤组织的形态和物理性质也有一定的变化，有的紧密坚实，有的疏松脆弱。加入高浓度的生长物质，可使坚实的愈伤组织变为松脆;反之，减低或除去生长物质，则松脆愈伤组织可以转变为坚实。松脆的愈伤组织是进行悬浮培养最适合的材料，稍经机械振荡，即可使组织分散成单细胞或由少数几个细胞组成的小细胞团，在培养中细胞迅速增殖；而坚实愈伤组织中的细胞间被果胶质紧紧地粘着，因

6、而往往不能形成良好的悬浮系统。第14页/共61页4、分化期分化期(differentiation stage)是指停止分裂的细胞发生生理代谢变化，导致形成由不同形态和功能的细胞组成的愈伤组织。分化期愈伤组织的主要表现如下：细胞分裂部位和方向发生改变。分化组织瘤状结构和维管组织的形成。细胞的体积不再减小，形成分化时的一个最好开端，并在此以后，保持相对不变。第15页/共61页4、分化期 出现各种类型的细胞。例如薄壁细胞、分生细胞、管胞、石细胞、纤维细胞、色素细胞、毛状细胞、细胞丝状体等。愈伤组织的颜色。生长旺盛的愈伤组织一般呈乳黄色或白色，有光泽，也有浅绿色或绿色的；而老化的愈伤组织多转变为黄色甚

7、至褐色。第16页/共61页以上对愈伤组织形成过程的时期的划分并不具有严格的意义，实际上，特别是分裂期和分化期往往可以出现在同一块组织上。另外，虽然细胞脱分化的结果在大多数情况下是形成愈伤组织，但这绝不意味着所有细胞脱分化的结果都必然形成愈伤组织。相反，越来越多的试验证明，一些外植体的细胞脱分化后可直接分化为胚性细胞而形成体细胞胚。第17页/共61页四、植物愈伤组织的继代培养一般在愈伤组织长到直径23cm时才将其与外植体分离，单独培养，并将其切成4-8个小块继续培养，此即继代培养。用继代培养维持愈伤组织生长，是长期保存愈伤组织的一种方法。继代培养可选取生长迅速的部位。从外表看，生长迅速的愈伤组织

8、多呈浅色、质地松散。若要进行愈伤组织的分化和再生，则应选生长较慢的愈伤组织。每二次继代培养的时间取决于愈伤组织的生长速度。一般可在4-6周继代一次。第18页/共61页愈伤组织一般只在不与琼脂接触的表面增殖生长，与琼脂接触的一面极少有细胞增殖。因此，由于愈伤组织的迅速增殖，整个愈伤组织小方块变成了一个不规则的馒头状的组织块。ba第19页/共61页第二节 植物愈伤组织与遗传变异 愈伤组织的遗传变异 影响愈伤组织变异的因子 愈伤组织染色体变异与形态发生的关系第20页/共61页 在愈伤组织培养中，经常发现细胞的生理行为和形态发生行为有自发变异的现象。原因可能是核的异常，也可能是其他原因。很多物种在活体

9、中的组织分化并不导致细胞多倍性，但离体条件下却容易发生多倍化现象。一、愈伤组织的遗传变异第21页/共61页组织培养物在细胞学上的异质性可能由2个因子引起：原来存在于外植体中染色体倍数性和遗传组成不同的细胞，经诱导后都能发生分裂；培养条件可能引起新的不规则性。而且这2个因子常常同时发挥作用。因此初生愈伤组织可能是一个异质细胞群，它既反映了原外植体中的染色体状况，又是愈伤组织诱导期间核变异的结果。第22页/共61页1、初生愈伤组织当把外植体接种到人工培养基上以后，细胞核内可能出现3种不同的过程：正常有丝分裂；先进行核内复制，然后进行有丝分裂；先发生核碎裂（无丝分裂），然后进行有丝分裂。在愈伤组织和

10、悬浮细胞生长期间，染色体数目还可能发生进一步变异。一般来说，在愈伤组织和悬浮培养物中核的状态可以有以下几种类型:二 倍 体、多 倍 体、单倍体、非整倍体和染色体结构变异体等。第23页/共61页2、建成愈伤组织就染色体数来说，在培养的愈伤组织细胞中异常现象主要有2种类型：整倍性增加的染色体数是基本染色体数的整倍数(2n，3n，4n，5n等)非整倍性细胞所具有的染色体数不是基本染色体数的整倍数（如2n-1，2n-2，2n+1，2n+2等）。第24页/共61页在组织培养中，由于选择作用的结果，在最终形成的细胞群体中占优势的只是一种主要的核型，即一种染色体数。这种选择作用受培养基成分和培养类型的影响，

11、同时也受到一个异质群体中细胞间的竞争和互作的影响。Smith和Street(1974)把取自生长速率相同的胡萝卜二倍体细胞系和四倍体细胞系的细胞等数混合，混合后经反复继代培养，四倍体细胞的频率不断增加，最后整个培养物都成了四倍体的细胞系。第25页/共61页二、影响愈伤组织变异的因子在离体培养中，愈伤组织细胞的核型变异受许多因素影响，组织自身的变异倾向是一方面，另外还有若干其他因子，其中最重要的是培养基成分。第26页/共61页1、培养基 培养基成分的化学成分Toney(1961)曾经指出，通过改变培养基成分，可以有选择地诱导和保持倍性较高的细胞的分裂。在只加2,4-D的培养基上，豌豆根段培养物中

12、二倍体细胞发生分裂，但当培养基中除2,4-D之外还含有激动素和酵母浸出液时，则能有选择地诱导四倍体细胞发生分裂。激动素和酵母浸出液也能提高多倍体细胞有丝分裂的频率。培养基的物理状态有研究表明，在悬浮培养的条件下，选择压有利于二倍体细胞，而在半固体培养的条件下，四倍体细胞出现的频率较高。第27页/共61页2、组织原有的倍数性Sacristan(1971)研究指出，供体植株原有的倍数性在培养细胞多倍化过程中起着重要作用。比较了在长期培养的还阳参单倍体细胞系和二倍体细胞系中发生的细胞学变化，发现单倍体组织的二倍化比二倍体组织的四倍化现象更为常见，表明在培养中处于二倍体水平上的细胞比处于单倍体水平上的

13、细胞较为稳定。第28页/共61页三、愈伤组织染色体变异与形态发生的关系有些愈伤组织起初具有形态发生能力，但经过反复继代培养之后，这种形态发生能力常常逐渐下降，有时甚至完全丧失。此外，在由老龄培养物分化出来的器官中，有很大一部分可能是形态异常的。造成这些问题的原因有生理的和遗传的两个方面。生理方面的原因主要是继代世代数多引起生理衰退。遗传方面的原因主要是多倍性、非整倍性和染色体结构变异。第29页/共61页第30页/共61页第三节 愈伤组织培养条件与定向变异植物愈伤组织的培养条件不同用途愈伤组织的定向诱导愈伤组织的形态发生方式愈伤组织培养的具体过程第31页/共61页一、植物愈伤组织的培养条件1、外

14、植体不同基因型或同一植株不同部位的细胞外植体在离体培养中的反应可能不同：材料的基因型对愈伤组织的器官分化有决定性的影响。不同植物种的器官分化明显不同，如烟草、胡萝卜和矮牵牛等植物容易诱导器官形成，而禾谷类、豆类、棉花等就比较困难。通常同一种植物的不同器官或组织所形成的愈伤组织，在生理和形态上的差别都不大，但有些植物情况不同。第32页/共61页1、外植体 年龄较幼的外植体，不仅易于诱导形成愈伤组织，而且也容易诱导分化成植株。如油菜植株的自下而上的茎段培养结果表明，下部的器官形成频率低，越往上部，苗的分化频率越高。年龄也有明显影响，年龄越老，当转移到分化培养基上生长时，其苗分化频率越低。因此在组织

15、培养中，要及时转移已形成的愈伤组织进行分化培养，可大大提高苗的分化频率。第33页/共61页2、培养基培养基的各种成分及物理性质，都对愈伤组织的培养和器官发生产生一定影响，但起决定作用的仍然是植物生长调节剂，特别是生长素和细胞分裂素的配比。第34页/共61页生长调节剂细胞分裂素和生长素的比例是控制芽和根形成的重要条件之一。细胞分裂素和生长素的比例高时，有利于芽的形成；而比例低时，有利于根的诱导。这样通过变换激素的种类、浓度和配比，即可有效地调节培养组织的器官分化。不同种类的生长素和细胞分裂素，对生根和长芽的效果是不同的。第35页/共61页无机营养元素在植物组织培养中与整体植物一样，细胞的生长也要

16、求满足植物生长的必需元素，若完全缺乏或过多或不足，也会影响细胞生长和分化。不过其影响不如激素明显。各种类型的植物、器官所需要的每种元素的量，特别是大量元素是有区别的。如生根培养要求无机离子浓度小一些，所以常用1/2MS或White培养基。如有些植物要求的氮，以硝酸态形式供应为佳，而有些植物要求的氮，以铵态氮的形式供应为佳。第36页/共61页有机成分在培养基中加了糖、硫胺素、烟酸、吡哆素、肌醇和甘氨酸等，可以满足愈伤组织的生长和分化的要求。糖不仅可作为碳源，而且也是培养基渗透调节剂。各种氨基酸和生物活性物质，可以促进愈伤组织生长和向器官分化。在组织培养过程中加一些植物器官的汁液，也常常产生良好的

17、效应。第37页/共61页物理性质培养基的物理性质(固体状态或液体状态，渗透压和pH值)对形态发生有明显的影响。在胡萝卜和石刁柏的培养过程中，需要改变培养基的形式，才能顺利地分化出苗。其方法是：第一阶段诱导形成愈伤组织，应在固体琼脂培养基上进行培养；第二阶段细胞和胚状体的增殖，需在液体培养基中完成；第三阶段由胚状体发育成可移植的植株，又应转移到固体琼脂培养基上进行培养。培养基的渗透压对细胞增殖和胚状体的形成有明显的影响。第38页/共61页3、培养环境条件(1)光照 在离体无菌培养条件下，光照对器官的作用主要是一种诱导反应，因为培养基中己有足够的碳源供利用，这时细胞处在异养条件下，不需要光合作用。

18、一定的光照对小苗的形成、根的发生、枝的分化和胚状体的形成有促进作用。(2)温度 在组织培养中，一般都采用2225的恒温条件进行外植体的培养。对一般植物来讲，都可较好地形成芽和根。第39页/共61页二、不同用途愈伤组织的定向诱导松脆的愈伤组织生长旺盛，色泽鲜艳，是进行悬浮培养最适合的材料，稍经机械振荡，即可使组织分散成单细胞或少数几个细胞组成的小细胞团，在培养中细胞迅速增殖。坚实的愈伤组织中的细胞间被果胶质紧紧地粘着，因而结构致密，生长较慢，往往不能形成良好的悬浮系统，但容易分化成苗。这两类愈伤组织可互相转变，加入高浓度的生长物质，可使坚实的变松脆，减低或除去生长物质，松脆的可转变为坚实的。第4

19、0页/共61页影响愈伤组织之间转变的控制因子1、植物激素生长素是促使细胞进入松脆状态的因子，细胞分裂素是促使细胞进入坚实状态的因子。2、氮源形态氨态氮（或谷氨酰胺、精氨酸、水解酪蛋白等有机形式的还原态氮）可起到促进分裂的作用；硝态氮具有抑制细胞分裂的作用。第41页/共61页三、愈伤组织的形态发生方式脱分化后的细胞进行再分化的过程有两种方式：器官发生方式&胚胎发生方式1、器官发生方式指细胞或愈伤组织培养物，通过形成不定芽再生成植株，这是细胞和组织培养中常见的器官发生方式。第42页/共61页愈伤组织的器官发生顺序有4种情况:愈伤组织仅由根或芽器官分化形成，即无根的芽或无芽的根;先形成芽，再在芽伸长

20、后，在其茎的基部长出根而形成小植株，多数植物属这种情况;先产生根，再从根的基部分化出芽而形成小植株。在双子叶植物中较普遍，而单子叶植物很少有这种情况;先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株小植株。第43页/共61页先芽后根先根后芽根芽同步发生器官发生方式第44页/共61页2、胚胎发生方式在组织培养中胚状体的发育过程是:细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结构，称为胚状体，或称体细胞胚。胚状体是双极性的，有共同的维管束贯穿两极

21、，可脱离愈伤组织在无激素培养基上独立萌发。胚状体再发育为完整植株。第45页/共61页四、植物愈伤组织培养的具体过程1、一般愈伤组织的培养(1)外植体的获取 如果目的只是检验能否获得愈伤组织，则可取茎的切段、叶、根、花和种子作外植体，或把其中的某些组织切成片状或块状作外植体。如果目的是精细研究愈伤组织，则要考虑外植体的一致性，如植物材料来源、外植体的大小和形状等。第46页/共61页(2)外植体材料的消毒和接种考虑植物部位和组织特点，进行消毒处理，消毒后切成0.5cm的方形或圆柱形小块接种，可直接放置于培养基表面上。(3)培养愈伤组织的诱导一般都采用固体培养基。采用液体培养基诱发至少有两个缺点:由

22、一次污染而造成外植体的损失量大;缺少气体交换不利于愈伤组织的形成。愈伤组织的诱导和培养一般在暗处进行，也可以因目的的不同而在弱光下进行，避免过早的再分化。第47页/共61页胡萝卜愈伤组织分化出芽第48页/共61页由菊花叶片的愈伤组织分化出的小植株第49页/共61页橡胶愈伤组织第50页/共61页胚性愈伤组织是指能形成体细胞胚的愈伤组织。胚性愈伤组织培养(embry-ogenic callus culture)是指将母体植株上的各个部分切下，形成外植体，接种到无菌的培养基上，进行胚性愈伤组织的诱导、生长和发育的一门技术。胚性愈伤组织培养的外植体，主要有未成熟的胚、幼穗、幼叶、幼根等。胚性愈伤组织培

23、养因植物种类不同而异。诱导时在培养基中附加一定浓度的生长素，有时不需附加细胞分裂素，蔗糖浓度可选2%6%不等，甚至可达15%。2、植物胚性愈伤组织的培养第51页/共61页胚性愈伤组织根据组织学观察、外观特征及其再生性、再生方式等，愈伤组织分成两大类：胚性愈伤组织（embryoniccallus，EC）和非胚性愈伤组织（non-embryoniccallus，NEC）。一般胚性愈伤组织质地较坚实，颜色有乳白色或黄色，表面具球形颗粒，其生长缓慢；从细胞学来看，胚性愈伤组织细胞较小，原生质浓厚，无液泡，常富含淀粉粒，核大，分裂活性强。胚性愈伤组织又可分为致密型胚性愈伤组织和易碎型胚性愈伤组织。这两类

24、胚性愈伤组织都能在分化培养基上再生完整植株。第52页/共61页果蔗愈伤组织第53页/共61页果蔗愈伤组织第54页/共61页愈伤组织胚性化球形胚形成诱导愈伤组织形成子叶胚期蝴蝶兰茎段经愈伤组织体细胞胚发生第55页/共61页胚性愈伤组织球形胚形成高丽参体胚发生悬浮培养的胚性细胞团愈伤组织成熟子叶胚第56页/共61页胚性愈伤组织培养的具体过程：(1)外植体的获取 未成熟的胚作为外植体，一般选取12mm长的幼胚。末经过成熟分裂前的花序，灭菌后，剥去四周叶片，取出花序，切成12mm的小段。在无菌条件下萌发种子，取胚根、胚轴、子叶、幼嫩的未展开的叶片等。成熟胚、幼嫩的芽等其他组织。第57页/共61页(2)

25、培养诱导胚性愈伤组织时，一般可用培养皿，这有利于观察。培养皿用胶带密封，于光下或暗处培养，温度2628。也可以采用其他适宜容器。(3)胚性愈伤组织的诱导一般经过细胞起动分裂，外植体表面增生突起，形成紧密的不透明的白色到浅黄色的胚性愈伤组织，在愈伤组织的表面形成体细胞胚。因外植体材料不同，程序也不同。如未成熟胚为外植体时，多从子叶发生;外植体为幼叶时，多从下表皮细胞及靠近维管束的细胞发生，外植体为幼根，多从根侧面原基上发生。第58页/共61页(4)胚性愈伤组织的保持和培养培养中经常伴有不利于产生胚性细胞的愈伤组织产生，如 软而透明的无结构状态的愈伤组织，一般没有形态发生能力，有时可形成根;软而呈胶质状的愈伤组织，常常带有根。这些愈伤组织无分化能力，但生长迅速，因而常常超过开始时生长较慢的胚性愈伤组织，影响胚性细胞分化。因此，必须在几周后将胚性愈伤组织分离出来，并单独进行继代培养。每次继代时都要仔细地除去非胚性愈伤组织。继代培养的时间，生长快的可半月继代一次，一般可34周继代一次。第59页/共61页本章复习重点 掌握愈伤组织、胚性愈伤组织的概念及其形态结构；了解愈伤组织的遗传变异及其影响因子；熟悉愈伤组织培养过程中两种不同的形态发生方式（器官发生和胚胎发生）及其具体培养过程；第60页/共61页感谢您的观看！第61页/共61页